Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성
2018년 9월 7일
이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.
이 방법은 항원 면역 유도 의존성 및 독립 항체 반응뿐만 아니라 B 세포 활성화 및 생식 중심 반응에 대한 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스의 B 세포 활성화와 체액성 면역을 직접 비교하여 신뢰할 수 있고 정량적인 Ig isotype 응답 측정을 제공한다는 것입니다. TNP-다당류 면역의 경우, 생쥐 한 마리당 1밀리리터의 인슐린 주사기에 100마이크로리터의 갓 준비된 항원 용액을 넣고 바늘을 각 동물의 오른쪽 하단 사분면에 약 30도 각도로 삽입하여 하부 장기 주입을 피합니다.
모든 쥐에게 주사를 맞았을 때, 동물들을 우리로 돌려보내 특정 병원체가 없는 시설에 수용한다. 적절한 실험 시점에서, 역안와 출혈로 면역된 각 동물로부터 150-200마이크로리터의 혈액을 채취하고, 샘플이 실온에서 1-2시간 동안 응고되도록 합니다. 배양이 끝나면 응고된 혈액 샘플을 원심분리하고 각 혈전 상단의 투명한 혈청을 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
잔류 혈전을 제거하기 위한 두 번째 원심분리 후, 50마이크로리터의 혈청을 개별 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 옮겨 영하 80도에서 보관합니다. 도금하기 전에 총 혈청 Ig 이소타입에 대한 적절한 농도의 마우스 Ig 이소타입 특이적 포획 항체로 개별 96웰 면역플레이트를 코팅하고, TNP 특이적 Ig 이소타입에 대한 TNP-38BSA 항원 또는 높은 친화성 TNP 특이적 Ig 이소타입에 대한 TNP-3BSA 항원으로 코팅하고 코팅된 플레이트를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침에는 우물당 200마이크로리터의 세척 버퍼로 접시를 두 번 세척합니다.
세탁 버퍼를 버리고 세탁할 때마다 종이 타월 더미에 접시를 두드려 말리십시오. 다음으로, 실온에서 1시간 배양하기 위해 웰당 200마이크로리터의 차단 버퍼로 플레이트를 차단합니다. 플레이트가 막히는 동안 표시된 대로 웰당 150마이크로리터의 별도의 처리되지 않은 96웰 플레이트에 적절한 표준물질 및 혈청 희석액과 블로킹 버퍼를 준비합니다.
그런 다음 시연된 바와 같이 세척 버퍼로 ELISA 플레이트를 세척하고 희석된 각 Ig isotype 표준 및 혈청 샘플 100마이크로리터를 ELISA 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 배양 후 시연된 대로 플레이트를 세척하고 차단 완충액으로 희석된 적절한 알칼리 인산가수분해효소 접합 이소형화 항체 100마이크로리터를 각 웰에 첨가하여 실온에서 1-2시간 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 세척하고 갓 준비한 기질 용액 100 마이크로 리터를 각 웰에 첨가하십시오.
실온에서 다음 몇 분 동안 진행되는 반응을 모니터링합니다. 반응이 분석할 수 있을 만큼 충분히 강력하면 플레이트를 마이크로플레이트 리더에 놓고 설정을 클릭하여 파장을 405나노미터로 설정합니다. 확인을 클릭한 다음 템플릿을 클릭하여 설정된 96웰 플레이트에 따라 적절한 블랭크, 표준 및 알 수 없는 웰을 할당합니다.
그런 다음 가장 집중된 표준물질이 약 1, 1.5, 2 및 2.5의 광학 밀도에 도달하면 읽기를 클릭하여 플레이트를 읽고 각 분석 후에 결과 데이터 파일을 저장합니다. 면역이 없는 경우, 성별 및 연령이 일치하는 B-TRAF3 충분한 깔짚 짝짓기 대조군과 비교하여 B 세포 특이적 TNF 수용체 관련 인자 3 또는 B-TRAF3 녹아웃 마우스에서 IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA의 기저 혈청 수치 증가가 관찰됩니다. TNP-다당류 또는 TNP-KLH를 사용한 면역 접종 후 7일 후, 흉선 비의존성 Ig 동형을 분석한 결과, 흉선 비의존성 TNP 특이적 IgG3 수치가 골수성 세포 특이적 TRAF3 녹아웃 마우스에서 깔짚 메이트 대조군에 비해 흉선 의존성 TNP 특이적 IgG2b 수치가 상당히 높은 것으로 나타났습니다.
또한, TNP-KLH 면역에 대한 흉선 의존성 마우스 1차 및 기억 반응에 대한 평가는 T 세포 특이적 TRAF3 녹아웃 마우스에서 부분적으로 감소된 흉선 의존성 IgM 1차 반응 및 결함 있는 IgG1 1차 및 기억 반응의 존재를 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 ELISA에는 일반적으로 표준 곡선의 선형 범위에 의해 정의되는 검출 한계가 있으므로 샘플을 여러 번 희석해야 할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유세포 분석 또는 L 스폿과 같은 다른 보완 방법을 수행하여 주어진 실험 환경에서 항체 반응을 포괄적으로 이해할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 ELISA를 사용하여 마우스의 T 세포 의존성 및 T 세포 독립성 면역글로불린(Ig) 동형 반응을 특성화하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 항원 면역 후 B 세포 매개 Ig 동형 반응의 차이를 연구자가 식별할 수 있게 해줍니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 항체 반응
- B 세포 활성화
배경
- T 세포 의존성 및 T 세포 비의존성 항체 반응을 이해하는 것은 면역학에서 매우 중요합니다.
- Ig 동형 반응을 특성화하면 체액성 면역 연구에 도움이 됩니다.
- 유세포 분석법은 상세 분석을 위해 ELISA를 보완할 수 있습니다.
- Ig 동형 반응의 신뢰할 수 있는 측정은 연구에 필수적입니다.
연구 목적
- 마우스의 Ig isotype 반응을 측정하는 프로토콜을 제공합니다.
- 다양한 항원에 대한 B 세포 활성화를 비교합니다.
- 다양한 상황에서의 면역 반응에 대한 이해를 높입니다.
사용된 방법
- Ig 이소타입 반응 정량을 위한 ELISA.
- B 세포 활성 분석을 위한 유세포 분석법.
- 면역화를 위한 마우스 내 항원 용액 주입.
- 혈청 분석을 위한 혈액 샘플 채취.
주요 결과
- Ig isotype 반응의 정량적 측정을 수행하였습니다.
- 항원 유형에 따른 B 세포 활성화의 차이가 관찰되었습니다.
- 해당 방법이 체액성 면역 연구에 신뢰할 수 있음이 입증되었습니다.
- 추가 분석을 위한 깨끗한 혈청 샘플을 확보하였습니다.
결론
- 본 프로토콜은 항체 반응을 특성화하는 데 효과적입니다.
- 이는 B 세포 매개 면역에 대한 통찰을 제공합니다.
- 이 방법은 다양한 면역학 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 프로토콜은 바이오 제약 연구자가 마우스 모델에서 흉선 의존성 및 흉선 독립성 면역글로불린 이소타입 반응을 정량적으로 분석할 수 있게 하여, B 세포 활성화 및 체액성 면역에 대한 기전적 통찰을 제공합니다. 신뢰할 수 있는 이소타입 특이적 ELISA 측정을 통해 백신 및 면역 조절제 개발 과정에서의 타겟 검증과 예측적 리스크 감소를 지원합니다. 이 방법은 유세포 분석과 같은 보완적 분석법과 결합될 때 중개 연구의 연속성을 높여주며, 초기 발견 파이프라인의 진행 여부 결정(go/no-go decision)에 중요한 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 흉선 의존성 및 흉선 독립성 자극에 대한 항원 특이적 IgM 및 이소형 전환 IgG/IgA/IgE 반응을 정량화함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 면역 조절 후보 물질의 기능적 표적 결합 및 생물학적 활성을 명확히 하는 표준화되고 재현 가능한 혈청 항체 측정법을 제공합니다.
- 예측적 가치: 이소형 전환 패턴과 기억 반응 역학을 기반으로 면역원들의 기전적 분류를 구분함으로써 포트폴리오 선별을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 하위 스크리닝 워크플로우에 적합한 정량적 Ig 이소형 결과물을 갖춘 검증된 생물학적 시스템(마우스 혈청)을 생성합니다.
- 재현성: 정의된 희석 요구 사항과 선형 범위 대조군을 포함한 표준화된 ELISA 절차를 제공하여 실험 간 분석 일관성을 보장합니다.
- 확장성: 면역원성 스크리닝 캠페인에서 항원 제형, 보조제 또는 유전적 모델의 비교 분석을 위한 플랫폼 재사용을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련성: 인간의 체액성 면역을 반영하는 모델에서 항원 특이적 반응의 평가를 가능하게 하여, 중개 바이오마커의 일관성을 지원합니다.
- 전임상 연속성: 면역화 전후의 종단적 혈청 샘플링을 통해 초기 발굴 단계의 Ig 이소타입 프로파일링을 전임상 검증 단계와 연결합니다.
- 리스크 조정 의사결정: 이소타입 전환(예: IgG1)의 결함이나 특정 세포 경로(예: T 세포 TRAF3)와 연관된 기억 반응을 식별함으로써 개발 진행 기준에 대한 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 초기 표적 검증부터 리드 화합물 발굴, 전임상 평가로 이어지는 발견 연속체 단계에 적합하며, 특히 이소타입 프로파일링을 통해 기능적 결과를 예측할 수 있는 면역 조절제 및 백신 연구에 유용합니다.
- 발견 생물학: 항원 노출을 정의된 Ig 이소형 시그니처(예: TI IgG3 vs. TD IgG2b)와 연결함으로써 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 높은 특이도와 민감도를 갖춘 정량적 분석 결과물을 제공하여, 후보 물질 간의 면역원성 잠재력을 신뢰성 있게 비교할 수 있게 합니다.
- 분석: 표준 곡선에서 보간된 405 nm에서의 광학 밀도 기반 측정값을 제공하여, 항체 역가의 그룹 간 통계적 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 백신 후보 물질 평가에 필수적인 1차 및 기억 반응의 종단적 추적을 가능하게 하여 전임상 연속성을 확보합니다.
- 기업 내 재사용: B 세포 매개 반응과 관련된 여러 프로젝트에 적용 가능한 재사용 가능한 면역 프로파일링 도구를 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: B 세포 활성화 경로의 기전적 모호성을 줄임으로써 표적 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운용적 가치: 정의된 혈청 희석 프로토콜과 ELISA 최적화 단계를 통해 표준화 및 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 아이소타입 프로필을 기능적 면역 결과와 연결하여 go/no-go 의사결정을 개선하고, 후기 단계의 생물학적 리스크를 감소시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 원하는 아이소타입 전환 및 기억 반응을 유도하는 능력에 기반하여 후보 물질의 리스크 조정 우선순위 선정을 가능하게 합니다.
구현 고려 사항
- 표준 곡선의 선형 범위 내에서 정확한 정량을 보장하기 위해 마우스 면역학, 혈청 처리 및 ELISA 최적화에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 혈청 처리 및 분석 수행을 위해 마이크로플레이트 리더, 인큐베이터, 원심분리기 및 멸균 조직 배양 시설의 사용이 가능해야 합니다.
- 데이터 무결성을 유지하기 위해 샘플 수집 시점, 채혈 기법(예: 후안와 채혈) 및 보관 조건(−80 °C)에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 다른 마우스 계통, 항원(예: TNP-KLH 대 TNP-polysaccharide) 또는 보조제 시스템(alum 대 PBS)으로 확장할 때 적응을 위한 고려 사항이 필요합니다.
- 실질적 제한 사항: 신호 포화를 방지하고 표준 곡선으로부터 정확한 보간법을 보장하기 위해 샘플의 연속 희석이 필요한 경우가 많으며, 이로 인해 실제 작업 시간이 증가합니다.
바이오제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
2,4,6-Trinitrophenyl (TNP)-polysaccharide and TNP-keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Immunization and Serum Preparation
1:54
Enzyme-linked Immunosorbent Analysis (ELISA)
4:17
Results: Representative Thymus-independent (TI) and Thymus-dependent (TD) Ig Isotype responses to TNP-polysaccharide and TNP-KLH Immunization
5:36
Conclusion
