아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과

이 방법은 박테리아 세포에서 숙주를 죽이는 독성 효과기가 언제 발현되는지, 표면 부착 임플란트 세포의 독성 상태는 무엇인지와 같은 박테리아 발병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 정량적이며 숙주 세포를 비교적 쉽게 처리할 수 있다는 것입니다. 우리는 슈도모나스(Pseudomonas)의 표면 부착 임플란트 하위 집단이 다른 숙주 사멸 표현형을 가지고 있다는 것을 알아차렸을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.

시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 밤새 E.coli 균주 BR을 성장시킵니다. 그런 다음 대장균 배양을 실온으로 가져옵니다. 나무 막대기를 사용하여 750l의 배양액에 아메바를 접종합니다.

즉시 아메바 대장균 혼합물 700l를 GYP 플레이트에 첨가합니다. 접시를 기울여 접시 표면에 배양물을 고르게 펴십시오. 그런 다음 높은 습도를 유지하는 상자에 접시를 넣으십시오.

상자 안의 플레이트를 22°C에서 4-5일 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 멸균 피펫 팁을 사용하여 플레이트의 절반에서 아메바 포자를 수집합니다. 그런 다음 위아래로 피펫을 사용하여 1mL의 PS 배지에 피펫 팁의 아메바를 재현탁시킵니다.

접종된 혼합물을 항생제 항진핵 용액이 보충된 25mL의 PS 배지가 있는 250mL 플라스크로 옮깁니다. 22°C에서 100rpm으로 회전하는 셰이커에서 아메바를 성장시킵니다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 하룻밤 동안 배양한 후 6cm 페트리 접시에 PSB 배지로 배양물을 희석합니다.

그런 다음 37 C에서 100 rpm으로 설정된 벤치 탑 회전기에서 배양물을 흔들어 250 mL 플라스크에서 DB 버퍼에 1 % 한천의 첫 번째 전자 레인지 50 mL를 흔들어줍니다. 용융된 한천 15mL에 칼슘 AM 15L를 넣고 부드럽게 섞습니다. 용융된 한천 혼합물을 12 x 10cm 유리판에 붓고 한천이 실온에서 10분 동안 응고되도록 합니다.

그런 다음 금속 눈금자와 인쇄된 그리드를 사용하여 응고된 한천 패드를 1.5 x 1.5cm의 더 작은 섹션으로 자릅니다. 젤을 사용할 준비가 될 때까지 젤이 수분을 유지하는지 확인하십시오. 다음으로, 표면에 부착된 세포를 분리하려면 페트리 접시에서 액체 매체를 제거합니다.

그런 다음 1mL의 개발 버퍼로 접시를 세척하여 플랑크톤 세포를 제거합니다. 표면 부착 박테리아 세포의 독성을 분석하려면 이전에 얻은 표면 부착 박테리아 세포에서 10L의 아메바 세포를 추가합니다. 플랑크톤 세포를 분리하려면 배양액 10L를 신선한 페트리 접시에 옮깁니다.

다음으로, 10L의 아메바 세포와 이전에 얻은 플랑크톤 박테리아를 혼합하여 플랑크톤 세포의 독성을 분석합니다. 즉시 페트리 접시 표면의 적절한 박테리아 아메바 혼합물 위에 작은 한천 패드를 놓습니다. 그런 다음 여분의 액체를 부드럽게 피펫으로 넣어 여분의 액체를 제거하고 접시를 20분 동안 건조시킵니다.

접시를 뚜껑으로 덮고 실온에서 40분 더 배양합니다. 마지막으로, 형광 현미경을 사용하여 최소 100개의 아메바 세포에 대한 이미지를 획득합니다. 이 프로토콜에서는 플랑크톤 및 표면 부착 녹농균 세포의 독성을 분석했습니다.

표면 부착 야생형 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 둥근 아메바 세포 모양과 칼세인 형광의 존재로 나타나는 아메바를 죽였습니다. 플랑크톤 세포에 비해 표면 부착 야생형인 녹농균은 숙주 사멸 지수가 높았습니다. 플랑크톤 세포는 비정질 아메바 세포 모양과 상대적으로 적은 칼세인 형광으로 표시된 아메바에 의해 소비되었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 새로운 칼세인 AM 및 아메바 세포를 사용하고 아메바의 광학 밀도를 면밀히 추적하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 전사 프로파일링과 같은 다른 방법을 수행하여 다음과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 신속한 이미지 기반 독성 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.