Name: 아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 학습하세요 D. discoideum 아메바를 이용한 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 방법입니다. 형광 현미경을 활용하여 1시간 내에 정량적 호스트 살해 효과를 측정할 수 있으며, Pseudomonas aeruginosa 등 다양한 세균의 병원성 연구에 활용됩니다.

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KP와 그대로 쓴 원고를 수정. KP는 실험 및 분석을 수행합니다. 이 작품을 다른 이름으로 국립 보건원 (NIH) 경력 전환 상 (K22AI112816)에 의해 지원 되었다

모든 실험 절차, Irvine가 주 대학에 실행 되었다.
1. 버퍼 및 솔루션
<ol><li>이중 증 류 물 (ddH2O) 1 L에 파운드-밀러 믹스의 25 g을 추가 하 여 1 리터 유리병에 Lysogeny 국물 (파운드)를 준비 합니다. 접시, 한 천의 추가 20 g 추가. 오토 클레이 브 소독. 10 cm 직경 접시에 녹은 한 천 매체의 25 mL를 붓고 고 실 온에서 응고를 허용 합니다. 실내 온도에 액체 미디어와 4 ° c.에 한 천 배지를 저장</li>
	<li>D-포도 당 1 g을 혼합 하 여 1 리터 유리병에 포도 당 효 모 펩 (GYP) 접시를 준비, 펩, 효 0.25 g의 2 세대 추출, KH2포4의 4.2 g, 나2HPO47 H2O, 5.1 g, 한 천의 ddH2 1 리터에 25 g O. 고압 소독입니다. 10 cm 직경 접시에 녹은 한 천 25 mL를 붓고 고 실 온에서 응고를 허용 합니다. 4 ° c.에 게</li>
	<li>펩의 10 g을 혼합 하 여 1 리터 유리병에 펩 S (PS) 매체를 준비, 7 g의 효 모 추출 물, D-포도 당, 나2HPO47 H2O, KH2포4의 1.4 g, 비타민 B12 의 40 µ g의 0.12 g의 15 g 80 µ g ddH2오의 800 mL에서 엽 산의 하루 내 pH 미터를 사용 하지 않은 경우 pH 4와 pH 7 표준 사용 하 여 전자 pH 미터 보정.<ol>
<li>PH 미터를 사용 하 여 PS 매체의 pH를 측정 합니다. 5 M 코 또는 5 M H3포4 pH 6.5 조정 하려면 추가 합니다. 1 l 최종 볼륨 조정 ddH2오 필터를 사용 하 여 0.22 μ m 진공 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장 참고: 장갑, 보호복, 눈 보호, 보호 장비를 착용 하 여 pH 조정으로 신중 하 게 진행 하 고 얼굴을 보호.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 개발 버퍼 프라임 배 준비 (DB') KH2포4나2HPO4 7 H2O, 그리고 ddH2O의 13.4 g 3.4 g 800 mL의 총 볼륨을 추가 하 여 1 리터 유리병에 버퍼. 하루 내 pH 미터를 사용 하지 않은 경우 pH 4와 pH 7 표준 사용 하 여 전자 pH 미터 보정.<ol>
<li>전자 산도 측정기를 사용 하 여 버퍼의 pH를 측정 합니다. 부드럽게 5 M 코 또는 5 M H3포4 필요에 따라 추가 하 여 6.5에 pH를 조정 합니다. 1 l ddH2O를 사용 하 여 최종 볼륨을 조정 하 고 압력가 마로 소독 하 여 소독. 실내 온도에 상점. 참고: 장갑, 보호복, 눈 보호, 보호 장비를 착용 하 여 pH 조정으로 신중 하 게 진행 하 고 얼굴을 보호.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 개발 버퍼 (DB) x 10 100 mL를 혼합 하 여 만들 DB x'의 1 mL와 버퍼 2 M MgCl2, 소독 하 고 1 mL의 1 M CaCl2소독. 1 l 1 L 유리 병 실내 온도에 압력가 마로 소독 멸 균된 ddH2O. 저장소를 사용 하 여 최종 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>멸 균된 PS 매체의 100 mL를 혼합 하 여 1 리터 유리병에 PS:DB 매체를 준비, 100 mL의 멸 균 10 DB x' 버퍼, 그리고 소독된 ddH2O 1 L. 보충의 총 볼륨의 1 mL을 소독 2 M MgCl2 와 1 mL의 1 M CaCl 소독 2. 4 ° c.에 게</li>
	<li>Calcein-am는 제조업체에서 제공 하는 플라스틱 용기에서 50 µ g에 DMSO의 50 µ L을 추가 하 여 calcein 오전 재고 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 게</li>
</ol>2. 성장과 Amoebae의 유지 보수
<ol><li>초기 성장 기간 동안 대장균 스트레인 B/r17 amoebae 위한 음식 근원으로 성장. 행진 대장균 냉동된 재고에서 B/r 파운드 한 천 격판덮개에-80 ° C에 저장 하 고 37 ° C 하룻밤 단일 식민지를에서 품 어.</li>
	<li>LB 매체의 2 mL에 대장균 B/r의 단일 식민지를 접종 하 고 하룻밤 롤러 드럼 또는 37 ° C에서 통에서 품 어.</li>
	<li>실 온에 하룻밤 대장균 문화를 가져와. 나무 막대기를 사용 하 여, 야간 문화 750 µ L로-80 ° C에서 보관 냉동된 재고에서 amoebae 접종. 참고: 사용 디 discoideum 스트레인 AX3, axenic 성장18수 있는. 이 단계는 axenic 성장, 필요 하지 않습니다 하지만 후속 단계 그의 요구를 해야 합니다.</li>
	<li>즉시 포도 당 효 모 펩 (GYP) 접시에 amoebae-대장균 혼합물의 700 µ L를 추가 합니다. 뒤로-및-앞뒤와 측면-투-사이드 필요에 따라 그것을 기울이기로 접시의 표면에 균등 하 게 문화를 확산. 스프레더 사용을 하지 않습니다.</li>
	<li>GYP 접시를 한 높은 습도 유지 하는 상자에 향하도록 넣습니다. 2 일회용 플라스틱 용기를 사용 하 여 (183 cm x 183 cm x 91 cm) 서로 위에 쌓아. 물 약 25 mL와 하단 컨테이너와 상위 컨테이너에는 물이 저수지에서 이동 수 분 수 있도록 컨테이너의 바닥을 통해 교 련된 여러 0.5 cm 직경 구멍 최고 컨테이너를 놓습니다.</li>
	<li>4-5 일 아메바 포자 표면 근처에 있는 격판덮개 (그림 2)의 성장 관찰 하는 때까지 GYP 접시와 22 ° C에서 상자를 품 어. 냉장된 인큐베이터를 사용 하 여 접시 보다는 실 온에서 부 화를 품 어. 참고: 포자, 성장 후 그들은 남아 있다 4 ° c.에 저장 될 때 몇 주 동안 접시에 가능한 한 천 면이 위로 향하도록 접시를 저장 합니다. 3-4 일 후 부 화, 세균성 잔디밭에서 비운의 영역 관찰할 수 있습니다, 아메바 포자 형성의 발병을 나타내는.<ol>
<li>인큐베이션 (그림 2)의 4-5 일 후 작은 amoebae 플레이트 표면 위에 포자를 관찰 합니다. 참고:이 기간을 넘어 포자의 품질 저하로, 일주일 이상 amoebae를 성장 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수집 amoebae 포자 균 1 mL 피 펫 팁 접시의 표면에 병렬 스윕하여는 amoebae의 axenic 성장을 위한 준비를 합니다. 10 cm 배양 접시의 절반에서 포자를 수집 합니다. 참고:이 모션 대장균의 다 수 수집 됩니다 한 천 격판덮개의 표면에 팁을 만지지 마십시오.</li>
	<li>PS 매체의 1 mL에 팁을 immersing 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 피 펫의 끝에는 amoebae를 resuspend.</li>
	<li>0.25 배 농도에서 항생제 antimycotic 솔루션과 보완 PS 매체의 25 mL를 포함 하는 250 mL 플라스 크에 접종된 혼합물을 전송 합니다. 참고:-20 ° c.에 250 µ L aliquots 항생제 antimycotic 솔루션 저장 해빙이 그 효능을 줄일 수로이 솔루션의 동결의 반복된 주기를 하지 마십시오.</li>
	<li>100 rpm 회전 통에 22 ° C에서 axenically amoebae 성장. 5 단계에서 독성 분석 결과 대 한 600에서 측정 하는 광학 밀도 세포 성장 0.2 0.5 nm (OD600). 참고:이 단계는 접종 (2.7 단계)의 시간에서 3-4 일을 요구 한다. 더 높은 밀도에 세포 성장, PS는 OD600 0.05 이하로 중간에 다시 문화를 희석 하 고 0.2 0.5의600 세 다시 성장.</li>
</ol>3. P. 녹 농 균 의 성장
<ol><li>파운드 플레이트에서 P. 녹 농 균 에의 한 식민지 선택, PS:DB 문화 2 mL에 접종 하 고 채도를 37 ° C에서 하룻밤 성장. 참고: PS:DB 미디어 항생제 antimycotic 솔루션을 추가 하지 마십시오.</li>
	<li>PS:DB를 사용 하 여 6 cm 직경 샬레에 숙박 문화 1: 100 또는 1:1,000를 희석. Planktonic 세포 독성은 전적으로 분석 되 고, 만약 성장 대신 기존의 문화 관을 사용 하 여 문화. 37 ° c.에서 100 rpm에서 설정 벤치탑 회전자에 문화를 흔들어</li>
	<li>재현성을 보장 하기 위해 특정 시간 포인트에서 문화를 수확. 독성을 평가 하는 앞서 1 h 30 분 천 패드 섹션 4에서에서 설명한 대로 준비 합니다. 참고: 피 녹 농 균 에 독성 약 8 h의 표면에 성장에 의해 유도 된다.</li>
	<li>표면 부착 세포 분리, 배양 접시에서 액체 매체를 제거 하 고 즉시 planktonic 셀을 제거 하려면 DB 버퍼의 1 mL로 씻어 5.1 단계로 바로 진행. 주의: 30 이상 세척 하지이 것으로 s 교란 및 표면 부착 세포를 분리 하 고 독성 측정에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
	<li>Planktonic 세포를 분리, 깨끗 한 배양 접시에 배양 접시에서 문화의 10 µ L를 전송 하 고 5.1 단계로 바로 진행 합니다.</li>
</ol>4. 현미경-천 패드의 준비
<ol><li>Amoebae P. 농 균혼합 준비가 전에 천 패드 1 시간 30 분 정도 준비 합니다.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 DB 버퍼 한 천 1% (w/v) 50 mL를 전자 레인지. Agar의 대단히 짧은 시간까지 혼합 모든 20 s가 사라집니다.</li>
	<li>15 분 동안 데워 55 ° C 물 욕조에 그것을 배치 하 여 녹은 agar를 냉각 하십시오.</li>
	<li>15 ml 원뿔 튜브에 녹은 agar의 calcein 오전 재고 솔루션의 15 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 반전 튜브 4-5 배 하 여 혼합 하 고 즉시 다음 단계를 진행 합니다. 참고: 폴 리 프로필 렌 15 mL 원심 분리기 튜브에서이 단계를 수행 합니다. 이를 너무 빨리 응고 한 발생할 것입니다 두꺼운 유리 용기를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>12 cm x 10 cm 유리 접시 위에 녹은 한 천 혼합물을 부 어 하 고 실 온에서 10 분간 응고 agar를 허용 합니다. 유리 접시 인쇄 된 격자에 놓고 절단 금속 눈금자를 사용 하 여 그리드를 따라 작은 1.5 c m x 1.5 c m 섹션으로 응고 한 천 패드를 잘라.</li>
	<li>사용할 준비가 될 때까지 습 한 상자에 수 화 젤을 유지.</li>
</ol>5. 현미경-영상에 대 한 박테리아 아메바 샘플의 준비
<ol><li>표면에 부착 된 세균 세포의 독성을 분석 결과, 추가 10 µ L 아메바 세포의 단계 2.10에서에서 3.4 단계에서 표면에 부착 된 박테리아를. 참고:이 단계는 박테리아와 amoebae의 혼합을 설명 합니다.</li>
	<li>Planktonic 세포의 독성을 분석 결과, 단계의 3.5 planktonic 박테리아의 10 µ L로 단계 2.10에서에서 아메바 세포의 10 µ L을 혼합 한다. 참고: 박테리아와 혼합 하기 전에 (한 OD600 0.2 0.5) axenically 성장 아메바 세포 씻지 않는. 아니 대장균 성장 항생제 antimycotic 솔루션의 사용으로 인해 아메바 문화에서 관찰 됩니다.</li>
	<li>바로 페 트리 접시 표면에 박테리아 아메바 혼합물 위에 4.5 단계에서 1.5 c m x 1.5 c m calcein 오전 천 패드를 놓습니다. 참고: 빠른 부드러운 모션을 사용 하 여 혼합물 위에 천 패드를 놓습니다. 이 모션 주변 그리고 패드의 아래쪽에서 세포를 밀어 경향이 있다 혼합물에 천천히 패드를 낮출 하지 않습니다. 이 단계는 박테리아와 amoebae는 균등 하 게 보장 한다 혼합, 움직일 수 두 종류 세포 같은 평면에 수감 된다.</li>
	<li>천 패드를 둘러싼 나머지 액체 밖으로 부드럽게 pipetting으로 과잉 액체를 제거 합니다. 실 온에서 20 분 동안 건조를 페 트리 접시를 허용 합니다.</li>
	<li>Petri 접시 뚜껑으로 커버 하 고는 추가 40 분 진행 단계 6.1에 대 한 실 온에서 고정된 아메바-박테리아 혼합물을 품 어. 참고: 시간, 시간이 지남에 배경 형광 증가의 동일한 금액에 대 한 모든 샘플을 품 어 중요 하다. 1 h의 외피 시간 것이 좋습니다. 1 시간 이상 외피는 덜 재현할 amoebae 셀 버스트를 시작할 수 있습니다.</li>
</ol>6입니다. 현미경-이미지 수집
<ol><li>이미지 amoebae 명시 및 녹색 형광 이미지 수 있는 형광 현미경을 사용 하 여. 474/27와 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터 사용 녹색 형광에 대 한 및 525/45 nm 여기 및 방출, 각각. 10 X (≥0.3 숫자 조리개) 목표는 amoebae의 이미지를 사용 합니다. 참고:는 agar에 calcein 오전 녹색 형광 채널에서 죽어가는 amoebae 형광을 발생 합니다. 건강 한 amoebae는 달리 형광.</li>
	<li>GFP 이미지 농도의 동적 범위를 최적화 하 고 phototoxicity, 제한 채널 위상 대조에 대 한 수집 시간을 조정 합니다. 필요한 경우 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 단계 대조를 대체 합니다. 참고: 가능 하면 위상 대비 및 GFP 형광 100-200 ms 노출을 사용 합니다. 전체 실험을 통해 그대로 노출 및 악기 설정을 유지 합니다. 이것은 호스트 살인 지 계산 중요 합니다.</li>
	<li>살인 지 계산 하는 호스트에 대 한 좋은 통계를 얻기 위하여 적어도 100 아메바 세포에 대 한 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>7. 이미지 분석 및 호스트 살인 인덱스
<ol><li>ImageJ를 사용 하 여 이미지 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>ImageJ에서 파일을 클릭 하 여 단계 대조 이미지 파일을 열고 | 오픈 이미지를 선택 하 고. 이미지를 클릭 하 여 임계값을 조정 | 분석 | 임계값. 강도 피크 (그림 3A)만 선택 하는 하위 및 상위 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>프로세스를 클릭 하 여 이진 이미지를 변환 | 이진 | 이진 하 게. 프로세스를 선택 하 여 구멍을 채우기 | 이진 | 구멍 채우기. 참고: 그림 1 에서 이미지를 사용 하 여 원본으로, 단계 7.1-7.2 amoebae 및 표면 연결 박테리아 어두운 영역 (그림 3B)으로 표시 한 이미지를 생산할 예정 이다.</li>
	<li>지역 및 회색 값 의미 상자 분석에에서 체크 확인 | 측정을 설정. 주 도구 모음에서 타원 도구를 선택 하 여는 amoebae의 대략적인 크기를 측정 합니다. 클릭 분석 | 측정 고 대표 amoebae의 영역.</li>
	<li>분석을 클릭 하 여는 amoebae에 대 한 마스크를 만들기 | 입자 분석. 크기 상자에는 amoebae 포함 되지만 박테리아 제외 영역을 입력 합니다. 보기 옵션에 대 한 드롭다운 메뉴 막대에서 마스크 를 선택 합니다. 관리자 추가 상자가 선택 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>확인 및 이미지 표시만 amoebae와 ROI 관리자 대화 상자가 나타납니다 (그림 3C) 클릭 합니다.</li>
	<li>파일을 사용 하 여 형광 이미지를 엽니다 | 오픈 적절 한 파일을 선택 하 고. Shift 키를 누른 채 목록 (그림 3D)에서 각 지역에 클릭 수익 관리자 에서 모든 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>투자 수익 관리자에서 측정 버튼을 클릭 합니다. 이 각 아메바의 평균 휘도 값 표시 결과 창이 열립니다.</li>
	<li>스프레드시트 프로그램에 각 아메바의 형광 값을 복사 하 고 모든 형광 값의 평균을 취 함으로써 인덱스를 죽이고 호스트를 계산.</li>
</ol>

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<li>O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quorum-sensing+inhibitor+blocks+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 P. 녹 농 균에 독성 분석 결과를 신속 하 고 양적 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아와 테스트할 수 있습니다. 그러나, 그것은 성장 매체 아메바 성장 조건와 호환 되어야 하는 마음에 유지 하는 것이 중요입니다. 특히, 우리는 세균성 성장 매체로 PS:DB를 사용 하 여 프로토콜을 최적화 했습니다. 다른 미디어를 사용 하는 경우에는 셀이 없으면 세균성 매체는 amoebae와 호환 되는지 확인 하려면 현재 성장 미디어 전용 제어를 수행할 필요할 수 있습니다.
이 메서드는 독성의 성장 단계 의존도 분석 결과를 확장할 수 있습니다. 특히, 세균성 문화 다양 한 고정된 시간 포인트 대신 시간에 대 한 성장 될 수 있다. 우리의 경험에서는, 그것은 피 녹 농 균 에 독성 성장 단계에 종속 되도록 나타나는 특정 시간 포인트에서 세균성 문화를 수확 하는 것이 중요. P. 녹 농 균 에 독성의 배양 접시에 성장 6-8...

세균 감염 인간과 동물1,2사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 문화 또는 biofilms에 박테리아의 독성을 측정 하는 능력은 의료 및 연구 설정에 중요 합니다. 여기, 세균성 독성을 계량 하는 다재 다능 한, 빠른, 그리고 상대적으로 간단한 방법을 설명 합니다. 진 핵 유기 체 Dictyostelium discoideum (아메바) 모델 호스트 유기 체로 사용 됩니다. D. discoideum 은 녹 농 균 (P. 녹 농 균)3,,45 에 다른 박테리아6,7 독성 요소를 식별 하는 호스트로 사용 되었습니다. ,8 주로 같은 독성 요인 유형 III 분 비9,10을 포함 한 포유류 세포를 죽이 게 쉽습니다. D. discoideum 를 사용 하 여 이전 독성 분석 실험 시간3,,45의 과정을 통해 디 discoideum 세포를 가진 박테리아의 장기간된 노출을 관련 있다. 프로토콜, 여기,이 아메바를 사용 하 여 독성을 결정 하는 빠른 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜 (그림 1) 설명 하는 방법: (1) axenically (에서 박테리아의 부재) amoebae 성장, (2) 분석 결과 대 한 박테리아, (3) 준비 박테리아 성장과 현미경 검사 법, (4)에 대 한 호스트 셀 epifluorescence 현미경 검사 법, 수행 하 고 (5) 아메바 분석 형광입니다.
Amoebae 처음 냉동된 주식에서 줄무늬 고는 amoebae 포자를 생산 하는 곳의 대장균 (대장균), 잔디밭에 성장. 이 포자는 포착 하 고 axenic 성장 위한 풍부한 매체에 주사. amoebae는 영양분이 풍부한 조건에서 axenic 성장을 통해 세균 독성의 평가 대 한 박테리아와 혼합 될 준비가 될 때까지 유지 됩니다. 생존 또는 amoebae의 죽음은 calcein-acetoxymethyl (calcein-오전), 세포내 esterases에 의해 죽 습 이며, 따라서, 형광11,12에 대 한 활성화의 형광을 측정 하 여 정량. 강조 하는 반면 라이브 amoebae 거의 비슷하게 형광을 전시 하 고 죽어가는 세포 형광 강렬 하지. 이 결과 calcein-오전 건강 amoebae와 법인의 조금 또는 전혀 설립 및 스트레스 amoebae13기판의 분열. 이 문제는 특히 포유류 세포11,,1415,16calcein 오전 형광 다릅니다.
박테리아 독성에 대 한 평가 별도로 성장 된다. 여기, 우리는 기회 주의 병원 체 피 녹 농 균 의 독성을 측정 planktonic (수영) 및 표면 부착 부분 모집단의 독성을 계량 하는 방법에 자세히 설명 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아의 독성 테스트를 적용할 수 있습니다. 대표적인 결과 섹션에서 우리는 독성 표면 부착 세포에서 활성화 되 고 보여줄 낮은 planktonic 셀에 이전13보고 했다. 비 악성 planktonic 세포는 amoebae 소비 하는 동안 표면에 부착 된 독성 활성화 P. 농 균 amoebae 죽인다. Planktonic 박테리아의 독성은 전적으로 분석 되 고, 박테리아는 프로토콜에 설명 된 대로 접시를 사용 하는 것 보다는 일반 문화 관에서 경작 될 수 있습니다.
P. 농 균 문화는 amoebae 영양분이 풍부한 조건에서 안정 된 상태에서 성장 하는 동안 의도 성장 단계에 도달 되도록 amoebae의 P. 농 균 문화 성장 조정 해야 합니다. 이 상태는 일반적으로 그들은 박테리아와 혼합 되어 적어도 1 일 하기 전에 희석 amoebae 문화를 필요 합니다. Amoebae 및 박테리아 천 패드를 사용 하 여 움직일 수는, 1 시간에 대 한 공동 incubated 이며 객관적인, 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터, 낮은 해상도 (10 X, 숫자 조리개 0.3)와 이미징 카메라를 사용 하 여 몇 군데. 분석은 ImageJ 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용자 정의. 우리의 분석은 과학적인 분석 패키지13를 사용 하 여 작성 하는 우리 자신의 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 소프트웨어 단계 명암 이미지를 사용 하 여 마스크를 만들고 형광 이미지의 마스크 된 영역에서 형광 값을 추출 해야 합니다. 형광 값은 적어도 100 셀, 숫자 호스트 살인 색인 결과 이상 평균 했다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, dehydrated</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot < 1 mL 및 -20 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>염화칼슘, 무수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>덱스트로오스</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>엽산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>특수 펩톤</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hyroxide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>비타민 B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab Strain</td><td>AX318</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn 실험실</td><td>균주 B/r17</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 strain19</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &Delta; lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14 유래 균주20</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; M 필터&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>필터 멸균용</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>유리 보관 병</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>페트리 접시, 직경 6cm</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm 폴리스티렌 플레이트</td></tr><tr><td>페트리 접시, 직경 10 cm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm 폴리스티렌 플레이트</td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 플라스틱 용기</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>정사각형 3컵 용기</td></tr><tr><td>유리판</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>한천 패드 준비용. 다른 유리판도 유사한 치수로 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>나무 막대기</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><강력한>장비</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E 현미경&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>현미경 설정</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 목표&nbsp; 0.3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>현미경 설정</td></tr><tr><td>형광 자극 소스</td><td>Lumencor</td><td>Sola 광 엔진</td><td>현미경 설정</td></tr><tr><td>형광 필터 세트</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&nbsp;</td><td>현미경 설정</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>현미경 설정</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Orbital shaker 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>37 &deg에서 박테리아 성장; C</td></tr><tr><td>플랫폼 shaker</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>22 &deg에서 아메바의 성장을 위해; C</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>언더카운터 냉장 부화기</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>22 &deg에서 아메바의 성장을 위해; C</td></tr><tr><td>Isotemp 수조&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>55°C까지 매체를 냉각하는 경우; 씨</td></tr></tbody></table>

아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

전통적인 세균 독성 분석 실험 호스트 셀에 몇 시간에 걸쳐 박테리아의 장기간된 노출을 포함 됩니다. 이 기간 동안 박테리아 호스트 성장 환경에 노출 하 고 호스트 세포의 존재로 인해 생리에 변화를 받을 수 있습니다. 우리는 빠르게는 박테리아 호스트 세포의 성장 정도 최소화 하는 박테리아의 독성 상태를 측정 하는 분석 결과 개발. 박테리아와 amoebae 함께 혼합 하 고 천 패드를 사용 하 여 단일 영상 평면에 움직일 수 있다. 절차는 호스트 세포 건강의 지표로 서 에스테 르 calcein acetoxymethyl (calcein-오전) 단일 셀 형광 이미징을 사용합니다. 호스트 세포의 형광 박테리아 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 호스트 세포의 노출의 1 시간 후 분석 된다. 이미지 분석 소프트웨어는 호스트 살인 인덱스를 계산 하는 데 사용 됩니다. 이 방법은 planktonic 및 표면 부착 녹 농 균 에서 독성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다 biofilm 형성의 초기 단계에서 하위 인구 및 다른 박테리아와 biofilm 성장의 다른 단계에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜 독성을 측정 하는 신속 하 고 강력한 방법을 제공 합니다 그리고 많은 성장과 포유류 세포의 유지 보수와 관련 된 복잡성을 방지 합니다. 여기 amoebae를 사용 하 여 측정 하는 독성 고기 또한 마우스 대 식 세포를 사용 하 여 확인 되었습니다. 특히,이 분석 결과 피 녹 농 균에 그 표면 첨부 파일 upregulates 독성 설정 하 사용 되었다.

우리 야생-타입 성장 P. 농 균 PA1419 스트레인 또는 ΔlasR 6 cm 직경 접시에 동일한 PA14 배경에서20 를 변형 하 고 planktonic 및 표면에 연결 된 세포의 독성을 분석. 문화는 PS:DB 문화, 채도를 37 ° C에서 롤러 드럼에 문화 관에서 하룻밤 성장에 단일 식민지에서 주사 했다, PS:DB, 100 rpm, 떨고 6 cm 직경 접시에 8 h에 대 한 성장 planktonic 고 표면 부착에 1: 100 희석 P. 농 균 하위 인구 격리 섹션 3에서에서 설명 했다.
야생-타입 표면 부착 P. 농 균 사망 amoebae, 라운드 아메바 세포 모양 및 calcein 형광 (<strong ...

여기, 선물이 D. discoideum (아메바)를 사용 하 여 호스트 planktonic 또는 표면에 부착 된 세균의 독성을 측정 하는 프로토콜. 독성은 1 시간 동안 측정 하 고 호스트를 죽이 형광 현미경 검사 법 및 이미지 분석을 사용 하 여 계량. 이 프로토콜 P. 농 균박테리아를 사용 하 여 설명 합니다.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

이 방법은 박테리아 세포에서 숙주를 죽이는 독성 효과기가 언제 발현되는지, 표면 부착 임플란트 세포의 독성 상태는 무엇인지와 같은 박테리아 발병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 정량적이며 숙주 세포를 비교적 쉽게 처리할 수 있다는 것입니다. 우리는 슈도모나스(Pseudomonas)의 표면 부착 임플란트 하위 집단이 다른 숙주 사멸 표현형을 가지고 있다는 것을 알아차렸을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 밤새 E.coli 균주 BR을 성장시킵니다. 그런 다음 대장균 배양을 실온으로 가져옵니다. 나무 막대기를 사용하여 750l의 배양액에 아메바를 접종합니다.즉시 아메바 대장균 혼합물 700l를 GYP 플레이트에 첨가합니다. 접시를 기울여 접시 표면에 배양물을 고르게 펴십시오. 그런 다음 높은 습도를 유지하는 상자에 접시를 넣으십시오.상자 안의 플레이트를 22°C에서 4-5일 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 멸균 피펫 팁을 사용하여 플레이트의 절반에서 아메바 포자를 수집합니다. 그런 다음 위아래로 피펫을 사용하여 1mL의 PS 배지에 피펫 팁의 아메바를 재현탁시킵니다.접종된 혼합물을 항생제 항진핵 용액이 보충된 25mL의 PS 배지가 있는 250mL 플라스크로 옮깁니다. 22°C에서 100rpm으로 회전하는 셰이커에서 아메바를 성장시킵니다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 하룻밤 동안 배양한 후 6cm 페트리 접시에 PSB 배지로 배양물을 희석합니다.그런 다음 37 C에서 100 rpm으로 설정된 벤치 탑 회전기에서 배양물을 흔들어 250 mL 플라스크에서 DB 버퍼에 1 % 한천의 첫 번째 전자 레인지 50 mL를 흔들어줍니다. 용융된 한천 15mL에 칼슘 AM 15L를 넣고 부드럽게 섞습니다. 용융된 한천 혼합물을 12 x 10cm 유리판에 붓고 한천이 실온에서 10분 동안 응고되도록 합니다.그런 다음 금속 눈금자와 인쇄된 그리드를 사용하여 응고된 한천 패드를 1.5 x 1.5cm의 더 작은 섹션으로 자릅니다. 젤을 사용할 준비가 될 때까지 젤이 수분을 유지하는지 확인하십시오. 다음으로, 표면에 부착된 세포를 분리하려면 페트리 접시에서 액체 매체를 제거합니다.그런 다음 1mL의 개발 버퍼로 접시를 세척하여 플랑크톤 세포를 제거합니다. 표면 부착 박테리아 세포의 독성을 분석하려면 이전에 얻은 표면 부착 박테리아 세포에서 10L의 아메바 세포를 추가합니다. 플랑크톤 세포를 분리하려면 배양액 10L를 신선한 페트리 접시에 옮깁니다.다음으로, 10L의 아메바 세포와 이전에 얻은 플랑크톤 박테리아를 혼합하여 플랑크톤 세포의 독성을 분석합니다. 즉시 페트리 접시 표면의 적절한 박테리아 아메바 혼합물 위에 작은 한천 패드를 놓습니다. 그런 다음 여분의 액체를 부드럽게 피펫으로 넣어 여분의 액체를 제거하고 접시를 20분 동안 건조시킵니다.접시를 뚜껑으로 덮고 실온에서 40분 더 배양합니다. 마지막으로, 형광 현미경을 사용하여 최소 100개의 아메바 세포에 대한 이미지를 획득합니다. 이 프로토콜에서는 플랑크톤 및 표면 부착 녹농균 세포의 독성을 분석했습니다.표면 부착 야생형 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 둥근 아메바 세포 모양과 칼세인 형광의 존재로 나타나는 아메바를 죽였습니다. 플랑크톤 세포에 비해 표면 부착 야생형인 녹농균은 숙주 사멸 지수가 높았습니다. 플랑크톤 세포는 비정질 아메바 세포 모양과 상대적으로 적은 칼세인 형광으로 표시된 아메바에 의해 소비되었습니다.이 절차를 시도하는 동안 새로운 칼세인 AM 및 아메바 세포를 사용하고 아메바의 광학 밀도를 면밀히 추적하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 전사 프로파일링과 같은 다른 방법을 수행하여 다음과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 신속한 이미지 기반 독성 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: 첸, Y. 외. Caenorhabditis elegans 모델에서 에어로모나스 감염의 병원성 및 병인기전 평가. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 영양소가 제한된 액체 환경에서 벌레의 생존을 측정하여 박테리아 병원성을 평가하는 C . elegans 의 액상 독성 검사법인 Aeromonas를 시연합니다. 이 검사는 C. elegans에서 독소 유발 손상과 사망률의 정도를 바탕으로 균주별 특이적 병원성을 밝혀냅니다.

C. elegans 액체 독성 검사를 이용한 박테리아 병원성 평가

출처: 페린밤, K., 시리아폰, A. 아메바를 이용한 신속 영상 기반 박테리아 병원성 분석. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 아메바를 표면에 부착된 박테리아나 플랑크톤성 박테리아와 함께 배양하고, 칼세인-아세톡메틸 에스터(칼세인-AM) 아가로스 패드를 적용하며, 형광 영상을 이용해 숙주 세포 손상을 감지하는 빠른 이미지 기반 탐지 방법을 시연합니다.

표면에서 유도된 박테리아 병원성 스크리닝을 위한 신속한 영상 기반 분석

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

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아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과

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