Name: 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 초파리 애벌레 샘플의 준비-대사체학을 기반으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 학습하세요 GC-MS 기반 대사체학을 위한 Drosophila 애벌레 샘플 준비 방법을. 냉각 염수 세척과 침전 분리 후 액체 질소 동결을 통해 100개 이상의 대사물질을 민감하고 재현 가능하게 직접 측정할 수 있습니다.

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인디애나 대학 질량 분광학 시설 및 대학의 유타 대사체학 핵심 시설 지원이이 프로토콜 최적화에 대 한 회원 들에 게 감사. J.M.T.에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 R35GM119557에서 국립 보건원의 지원 됩니다.

1. 달걀 컬렉션
<ol><li>성인 남성 및 원하는 genotypes의 처녀 여성을 수집 합니다. 개별적으로 3-5 일에 대 한 표준 블루밍턴 미디어와 식품 유리병에서이 동물을 나이.</li>
	<li>새로운 음식 유리병에 50 처녀 암컷과 25 남성을 전송 하 여 적절 한 matings를 설정 합니다. 참고: 최소 6 개의 독립적인 matings 설정 되어야 합니다 각 유전자 형에 대 한. 하나의 샘플 각 짝짓기 (즉, 6 개의 독립적인 matings에서 수집 된는 6 샘플)에서 수집 됩니다.</li>
	<li>
당 밀 계란-누워 모자를 준비 합니다.
	<ol>
<li>115 mL 당 밀의과 한 천의 29 g H2O 2 L 플라스 크에 700 mL와 함께 믹스.</li>
		<li>당 밀 뜨거운 접시에 한 천 혼합물을 끓인 다.</li>
		<li>70 ° c에 냉각</li>
		<li>산 믹스 (20 mL의 85% 인산 H2O; 1 L에 209 mL 프로 산 25 mL를 추가 갈색 병에 게)와 95% 에탄올에 10% p hydroxy benzoic 산 메 틸 에스테 르의 10 mL.</li>
		<li>35 x 10 m m2 조직 배양 접시의 뚜껑과 하단 부분에 당 밀 한 천 하 거 라. 참고: 하기 전에 당 밀 한 천 배지를 따르고, 반드시 뚜껑 / 35 x 10 m m2 접시의 기초 (단계 1.6에서 설명) 초파리 재고 병의 입에 snuggly 적합. 사용 하는 접시의 브랜드에 따라 기본 사용할 수 없습니다 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>증류수를 추가 하 여 붙여넣기 신선한 효 모에 활성 만들기 건조 효 모 (5 g 효 모/7 물) 혼합물까지 된다 (즉, 땅콩 버터의 일관성) 고체 표면에 쉽게 퍼질 수 있는 붙여넣기.</li>
	<li>당 밀 계란-누워 뚜껑의 표면에 누 룩 반죽의 약 1.5 g을 확산.</li>
	<li>6 온스 초파리 재고 병 22 G 바늘을 사용 하 여 플라스틱의 반대 측에 4 개의 공기 구멍을 찌른.</li>
	<li>문화 병으로 음식 유리병에서 새로 성관계 파리를 전송. 참고: 파리에서 전송 될 수 있습니다 임시 마 취 또는 병의 입에서 유리병의 상단을 급격히는 벤치탑에 대 한 병의 바닥을 도청 하 여 CO2 를 사용 하 여.</li>
	<li>신속 하 게 초파리 재고 병의 입에 표면에 효 모 반죽과 당 밀 계란-누워 모자를 배치 합니다. 실험실 테이프를 사용 하 여 안전한 장소에 계란-누워 모자. 참고: 만약 파리 마 취 전에 전송 했다, 병 두어야 한다 가로 벤치탑에 모든 파리 회복 될 때까지. 파리는 완전히 모바일, 일단 당 밀 계란-누워 캡 아래쪽의 문화 인큐베이터에서 병을 놓습니다.</li>
	<li>처음 2 일 동안 하루에 적어도 한 번 반전 주식 병, 벤치탑에 대 한 병의 바닥을 두드리고, 오래 된 계란 모자를 제거 고 즉시 병의 입에 새로운 계란 모자를 배치 하 여 당 밀 계란-누워 모자를 교체 합니다. 오래 된 달걀에 누워 모자를 삭제 합니다. 참고:이 단계를 통해 여성 그들의 계란을 들고는 동기화 된 인구의 컬렉션에 대 한 수 있습니다.</li>
	<li>새로운 달걀 누워 모자 주식 병으로 하루 3, 2 시간 후 교체 후 놓고 삭제 합니다. 제거 하 고 4 시간 후 두 번째 계란-누워 캡을 바꿉니다. 날짜, 시간, 및 유전자 형이 낳는 캡의 하단을 레이블을 지정 합니다. 참고: 알이 4 h 창 동안 수집 분석을 위해 사용 됩니다. 이 동기화 단계는 특정 발달 단계를 분석 하기 위한 중요 한. 계란은 몇 일 동안 이러한 방식으로 수집할 수 있습니다.</li>
	<li>원하는 온도 습도에 인큐베이터에 장소와 60 x 15 m m2 페 트리 접시에 계란-누워 모자를 삽입 합니다.</li>
	<li>계란-누워 모자 기아, 인구 밀도 또는 오염 문제에 대 한 매일 검사 합니다. 참고: 애벌레 지속적인 개발을 보장 하기 위해 적절 한 음식에 액세스할 수 있어야 합니다. 필요한 경우, 신선한 효 모 반죽 실험에 사용 될 모든 계란-누워 모자에 퍼질 수 있다. 또한, 애벌레 인구 밀도가 너무 높은 경우에, 애벌레 문화 판에서 방황 시작 됩니다. 이러한 샘플 때문에 높은 인구 밀도 및 기아 방황 하는 동안 경험의 중간 관찰 됩니다 일치 하지 않는 데이터 metabolomic 분석에 사용할 수 없습니다. ~ 80-100의 밀도 중간 두 번째 탈피 애벌레 (L2) 또는 40-50 접시 당 중간 세 번째 탈피 애벌레 (L3) 접시 당 것이 좋습니다. 가시 세균 이나 곰 팡이로 오염 된 샘플을 폐기 해야한다.</li>
</ol>2. 애벌레 샘플 컬렉션
<ol><li>원하는 단계까지 애벌레 나이. L3 유 충 수집, L2-L3 탈피에서 샘플을 다시 동기화. 재 동기화 발달 이정표15앞쪽 spiracles를 사용 하 여 앞에서 설명한 방법을 사용 하 여 일반적으로 이루어집니다. 또는, 중반 L3 애벌레 sgs3 기자 진16를 사용 하 여 동기화 수 있습니다. 참고: 이와 관련, 우리 찾을 중반 L2 애벌레 (달걀 누워 후 ~ 60 h)는이 단계에서 애벌레의 개발은 여전히 상대적으로 동기 때문에 대부분의 분석에 이상적, 신중 하 게 수집한 샘플 개발이 timepoint에 적절 한 음식 그리고 샘플 당 동물의 수는 관리 (아래 참조). 추가 동기화 단계는 L3 애벌레 L3 개발 하는 동안 발생 하는 수많은 ecdysone 펄스 신진 대사에 대 한 극적인 효력이 때문에 동기화 되지 않은 인구에 있는 아티팩트를 생성 합니다.</li>
	<li>부드럽게 리프트는 agar에서 효 모 반죽을 해 바늘을 사용 합니다. 새로운 당 밀 한 천 모자에 누 룩을 놓습니다. 참고: 대부분 애벌레 당 밀 한 천 및 효 모 반죽 사이의 인터페이스에서 먹을 것 이다.</li>
	<li>당 밀 agar의 새로 노출 된 표면에서 애벌레를 수집 하는 작은 붓을 사용 합니다. 얼음에 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 애벌레를 놓습니다. 참고: 각 발달 단계에 대 한 적절 한 샘플 크기는 다음과 같습니다: 50 먼저 탈피 하는 애벌레 (L1); 25 중반 L2 애벌레; 20 초 L3 유 충; 15 L3 중반 또는 후반 L3 유 충입니다.</li>
	<li>세척 하 고 큰 샘플 세트를 수집 하는 동안에 작은 배치 (4 ~ 6 샘플) 샘플 (2.8 통해 2.3 단계)를 고정. 샘플 튜브에 있는 애벌레를 배치의 20 분 이내 동결 해야 합니다. 참고: 다른 튜브 3 단계에서 샘플 전송을 방해할 수 있기 때문에 Eppendorf 1.5 mL 플렉스 튜브를 사용 하 여 것이 좋습니다. 샘플은 microfuge 관에서 수집 해야 합니다. 3.1 단계에서 설명한 구슬 튜브에서 샘플을 수집 하지 않습니다. 세라믹 구슬 부정확 한 질량 측정 결과 및 오염 물질을 소개 하는 샘플에 NaCl의 세척 솔루션을 유지 합니다.</li>
	<li>추가 1 mL의 얼음 처럼 차가운 0.9 %NaCl, 튜브에 뚜껑을 닫고 세로로 대칭 이동 튜브를 철저 하 게 씻어 애벌레.</li>
	<li>튜브를 다시 얼음 ~ 30 위 s. 이 시간 동안, 애벌레는 튜브의 하단 싱크대 것 이다 하지만 효 모 현 탁 액에서 남아 있을 것 이다. 모든 애벌레 느슨한 펠 릿 형성, NaCl 솔루션 1 mL 피 펫을 사용 하 여 제거.</li>
	<li>최종 세척 솔루션 때까지 취소 또는 단계 2.4와 2.5 단계를 두 번, 반복. 참고: 추가 세척 단계는 누 룩의 과도 한 금액을 포함 하는 수집 된 샘플 하는 경우 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에 1 분 동안 2000 × g 에서 샘플을 원심</li>
	<li>200 µ L 피 펫을 사용 하 여 모든 잔여 솔루션을 제거 합니다.</li>
	<li>즉시 액체 질소에 샘플을 동결. 참고: 프로토콜은이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다. 샘플-80 ° c.에 3 달까지 동안 저장 될 수 있다</li>
</ol>3입니다. 비드 튜브 샘플의 전송
<ol><li>각 애벌레 샘플 1.4 m m 세라믹 구슬을 포함 하는 2 mL screwcap 튜브 1.5 mL microfuge 관에서 전송 되어야 합니다. 이 전송 단계에 대 한 준비, 2 mL screwcap 구슬 튜브 (뚜껑에 표시는 4.4 단계 파괴 될 것 이다)의 측면을 에탄올 증거 마커를 사용 합니다.</li>
	<li>0.01 mg를 정확 하 게 측정 분석 균형을 사용 하 여 레이블이 지정 된 비드 튜브의 대량 포장</li>
	<li>애벌레 샘플-80 ° C에 저장, 전송 액체 질소 사전에 샘플 튜브를 배치 합니다.</li>
	<li>긴 집게를 사용 하 여 액체 질소에서 1.5 mL 샘플 튜브를 제거 dewar.</li>
	<li>입고 니트 릴 장갑, 잡아는 냉동 튜브, 반전, 그리고 예리하게 언된 펠 릿을 꺼내 려 벤치탑에 대 한 튜브 뚜껑을 파운드. 즉시 미리 tared 2 mL screwcap 구슬 튜브에 펠 릿을 부 어. 펠 릿을 꺼내 려 실패, 액체 질소에 튜브를 반환 하 고 반복 합니다. 참고: 애벌레 펠 릿은 모든 microfuge 관에서 분리 하지 하십시오. 권장 다른 튜브를 사용 하 여, 애벌레 알 약 샘플 분석에 대 한 수집 전에 dislodged 수 있습니다 경우 결정 합니다.</li>
	<li>빠르게 애벌레 펠 릿과 구슬 튜브의 결합 된 질량을 측정 합니다. 바로 액체 질소로 샘플 튜브를 놓습니다. 애벌레 펠 릿 질량 metabolomic 데이터를 정규화 하는 데 사용 됩니다. 참고: 프로토콜은이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다. 샘플-80 ° c.에 3 달까지 동안 저장 될 수 있다</li>
</ol>4. 샘플 추출
<ol><li>쿨러는-20 ° C 벤치탑에서 샘플 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>각 튜브에 2 µ g/mL 호박-d4 산을 포함 하는 prechilled (-20 ° C) 90% 메탄올의 0.8 mL를 추가 합니다. 쿨러-20 ° C 벤치탑에 샘플을 반환 합니다. 참고: 호박-d4 산 내부 표준으로 제공합니다. 만 HPLC 급료 H2O와 메탄올을 사용 합니다. 때문에 메탄올 및 다른 유기 용 매 휘발성과 공기 변위 펫을 사용 하 여 정확 하 게 측정 하기 어려운,이 단계와 다음 단계를 모두에 대 한 긍정적인 변위 펫을 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>빈 구슬 튜브에 2 µ g/mL 호박-d4 산을 포함 하는 prechilled (-20 ° C) 90% 메탄올의 0.8 mL을 추가 하 여 부정적인 제어를 설정 합니다.</li>
	<li>6.45 m/s 4 ° C 온도 제어 실에 있는 비드 밀 균질 화기를 사용 하 여 30 초 동안 샘플을 균질. 참고: 실패를 신속 하 고 완전 하 게 균질 애벌레 펠 릿 대사체학 분석에 가변성의 일반적인 소스입니다. 만 30 애벌레 조직을 동결를 파괴 수 있는 균질을 사용 하 여 s.</li>
	<li>쿨러-20 ° C 벤치탑에 무 균된 샘플 튜브를 반환 하 고 적어도 1 시간을 위한-20 ° C 냉동 실에 그들을 품 어.</li>
	<li>결과 침전 제거 하 4 ° C에서 5 분에 대 한 20000 × g 또는 최대 속도에서 튜브를 원심.</li>
	<li>새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에는 상쾌한의 600 µ L를 전송 합니다. 침전을 방해 하지 마십시오. 촉진 펠 릿 되는 상쾌한 pipetting 동안 빠질 경우 모든 상쾌한 튜브를 반환 하 고 단계 4.6을 반복 합니다.</li>
	<li>진공 원심 분리기에 샘플 튜브를 놓습니다. 원심 분리기를 밀봉 하기 전에 모든 튜브는 열려 있어야 합니다. 모든 용 매 제거 될 때까지 실 온에서 샘플을 건조 (이 단계는 일반적으로 완료 ~ 16 시간 걸립니다). 참고: 필요한 경우 프로토콜 수 수 일시 중지이 단계에서. 말린된 샘플-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
</ol>5. 화학 Derivatization
<ol><li>말린된 샘플-80 ° C에서 저장, 개봉된 샘플 튜브 진공 원심 분리기에 놓고 30 분 동안 건조 합니다. 샘플 튜브를 열기 전에이 단계를 수행 해야 합니다. 참고:이 단계는 응축을 냉장고에서 제거 하는 때 microfuge 관의 외부에 제거 됩니다. 프로토콜의이 부분은 매우 민감한 H2O 하 고 여분의 주의 모든 시 약을 가능한 건조 유지 하 이동 해야 합니다.</li>
	<li>
무수 피리 딘에서 40 mg/mL methoxylamine 염 (MOX)의 솔루션을 준비 합니다. 무수 피리 딘을 사용 합니다. MOX 그리고 pyridine는 desiccator에 저장 하 고 매일 MOX 솔루션을 준비. 주의: MOX, pyridine 독성이 있다. 증기 두건에서이 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>열 총을 사용 하 여 1 mL 유리 주사기를 건조.</li>
		<li>무수 피리 딘 병에 주사기의 바늘을 삽입 합니다. 피리 딘 1 mL을 제거 하 고 포함 된 MOX의 40 mg microfuge 관에 추가.</li>
		<li>무수 피리 딘 아르곤과의 병을 플러시. 병을 밀봉 하 고는 desiccator 돌아갑니다.</li>
		<li>잠복기 600 rpm에서 10 분 동안 35 ° C에서 열 믹서에 관 하 여는 pyridine에 MOX를 분해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>무수 피리 딘 솔루션에 말린된 샘플 40 mg/mL MOX의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>10 s 그리고 짧게 원심 분리기에 대 한 소용돌이 (10000 x g 20에 대 한 s).</li>
	<li>열 믹서에 600 rpm에서 1 h 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>20000 × g 또는 입자 물질을 제거 하 5 분에 대 한 최대 속도 원심.</li>
	<li>250 µ L 비활성화 유리 microvolume 삽입 autosampler 유리병에 상쾌한의 25 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>40 µ L N-메 틸-N-trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) 포함 하는 1%의 추가 TMCS. 주의: MSTFA은 독성이 있습니다. 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다. 참고: 지금까지 사용 가능한 경우에이 단계는 Gerstel autosampler에 의해 완료할 수 있습니다.</li>
	<li>Autosampler 유리병에 모자를 놓고 뇌관 집게 도구를 사용 하 여 밀봉 합니다.</li>
	<li>진동 (250rpm)와 함께 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>이전 desceribed3지방산 메 틸 에스테 르 표준 (FAMES) 솔루션을 준비 합니다. 사용 하 여 주입 직전 로봇 autosampler autosampler 유리병에 FAMES의 3 µ L를 추가 합니다. 참고: FAMEs는 보존 시간 이동 보정 및 악기 성능 확인 하는 데 사용 됩니다. 사용할 수 없는 로봇 autosampler 이면 FAMEs 5.8 단계 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>6. GC-MS 검색
참고: 대부분의 경우에서 사용자 질량 분광학 핵심 시설의 도움으로이 단계를 수행 합니다. 이 프로토콜은 30 m, 5 m 가드 열 GC 열 함께 사용 하도록 설계 되었습니다.
<ol><li>무작위 샘플 주문.</li>
	<li>
GC-MS를 준비 합니다.
	<ol>
<li>1 mL/min를 헬륨 캐리어 가스 유량 설정 합니다.</li>
		<li>입구 온도 250 ° c.를 설정</li>
		<li>프로그램 실행 다음 온도 기울기에 GC:<ol>
<li>1 분의 보류와 95 ° C를 초기 온도.</li>
			<li>2 분의 보류와 40 ° C/min의 속도로 110 ° C에 온도 증가.</li>
			<li>250 ° C에 5 ° C/min 램프에 의해 증가.</li>
			<li>4 분의 마지막 보류와 25 ° C/min의 속도로 330 ° c 증가.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3.5 분 용 지연을 설정 합니다. 참고: 시간 GC-MS 시스템에 따라 변경할 수 있습니다. 이 단계의 목적은 손상 된 검출기에서 MSTFA 및 MOX를 방지 하기 위해입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(10: 1의 비율로 분할) GC-MS에 derivatized 샘플의 1 µ L를 삽입할. 참고: 봉우리의 강도 너무 낮은 경우 샘플의 2 µ L를 주사. 샘플의 주입 순서를 무작위로 한다.</li>
	<li>50-500 m의 대량 범위 전체 스캔 모드에서 질량 분석기를 작동/z.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>대상 또는 타겟이 불분명 한 방법 중 하나를 사용 하 여 metabolomic 데이터를 분석 합니다. 타겟된 분석 측정 하는 대사 산물, 우리는 아래 설명 하는 젖 산 측정 등의 정의 된 집합의 풍부에 집중 된다. 반면, 타겟이 불분명 한 분석 크게 두 샘플 세트 사이 변경 모든 신진 대사 기능을 식별 하는 공평한 접근을 사용 합니다. 참고: 연구소 주로 사용 하 여 무료 프로그램 MetAlign17 와 MetaboAnalyst18,19 데이터 분석에 대 한. 품질 관리, 표준화, 및 데이터 처리 단계에 대 한 적절 한 설명이이 원고의 범위 때문에, 우리는 참조 하십시오 사용자 데이터 처리20,21에 헌신 하는 더 상세한 프로토콜 22. 또한,이 분석에 필요한 단계를 설명 하는 순서도 찾을 수 있습니다 다른 곳에서8.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

대사체학 중간 대사를 구성 하는 대사 반응을 조사 하는 최상의 기회를 제공 한다. 그러나이 기술의 감도 데이터 유전 배경, 발달 단서와 다양 한 환경 스트레스, 온도, 습도, 인구 밀도, 그리고 양분 가용성을 포함 하 여 렌더링 합니다. 따라서, 높은 품질과 재현성 대사체학 분석이 매우 제어 조건 하에서 샘플을 수집 하는 것. 여러 리뷰가 포인트3,,823강조, 여기 우리가 재현성을 보장 하도록 설계 된 애벌레를 수집에 대 한 단계별 방법을 제공 합니다.
대사체학 분석에 가변성의 가장 일반적인 소스는 끄다, 또는 중지, 샘플 수집 후 신진 대사 반응 하는 실패에서 유래한 다. 이와 관련, 액체 질소에서 동결 시 대사는 정지 하 고 샘플은-20 ° C 메탄올에 무 균 때 대사 효소를 파괴 될 것 이다. 사용자 샘플 ...

과일 파리 초파리 melanogaster 중간 신진 대사를 조절 하는 분자 메커니즘을 공부 하는 이상적인 시스템으로 떠오르고 있다. 대부분 대사 경로 보존 초파리 와 인간 사이 뿐만 아니라 주요 영양소 센서 및 성장 레 귤 레이 터, 인슐린, 토르, myc, 등 비행1,2활성도 있습니다. 그 결과, 초파리 는 당뇨병과 비만에서 neurodegeneration, 암에 이르기까지 인간의 질병의 변화 기초를 탐구 하 사용할 수 있습니다. 이와 관련, 초파리 애벌레 개발 호 기성 분해, 또는 바르 부르 크 효과로 알려진 신진 대사 프로그램을 공부 하는 이상적인 프레임 워크를 제공 합니다. 마찬가지로 많은 종양 호 기성 분해를 사용 하 여 탄수화물에서 바이오 매스를 생성, 그래서 할 초파리 애벌레 활성화 촉진 발달 성장3,,45호 기성 분해. 애벌레 사이의 이러한 유사성 및 종양 물질 대사 이해 어떻게 에어로빅에 대 한 주요 모델 초파리 를 설치 분해는 레 귤 레이트 된 vivo에서.
즉석 대사 공부에 대 한 인기 모델로 떠오르고 있다 사실에도 불구 하 고 대부분 초파리 연구는 개별 대사 산물3, 트 레 할 로스, 트리 글리세라이드, ATP 등을 측정 하도록 설계 된 방법에 의존. 특정 프로토콜 각 대사 산물을 측정 하는 데 필요한, 이후 분석 결과 기초를 둔 학문은 노동 집약, 비싸고, 그 화합물 상업 키트를 사용 하 여 측정할 수 있는 쪽으로 편 파. 이러한 제한 사항에 대 한 해결책의 대사체학, 초파리 대사 공부 보다 효율적이 고 공평한 방법을 제공 분야에서 나왔다. 분석 결과 기반 연구와 달리 단일 metabolomic 분석 수 있습니다 동시에 작은 분자 대사 산물의 수백을 측정 하 고 유기 체의 대사 상태6,7에 대 한 포괄적인 이해를 제공. 이 기술은 크게 초파리 대사 연구의 범위를 확장 했다 그리고이 신흥 분야8의 미래를 나타냅니다.
Metabolomic 연구는 주로 세 가지 기술을 사용 하 여 실시: (i) 핵 자기 공명 (NMR), (ii) 액체 크로마토그래피-질량 분석 (MS LC), 및 (iii) 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)9. 각 접근 제공 뚜렷한 장점과 단점, 그리고 이러한 모든 기술은 성공적으로 초파리 대사 공부 하 사용 되었습니다. 때문에 실험실에서 실시 하는 연구, 극 지 대사 산물에 초점을 맞추고, 우리가 주로 GC-MS 기반 메서드를 사용 합니다. GC-MS 장점, 높은 재현성, 최대 해상도, 감도, 등의 번호와 사용자를 제공 하 고의 급속 한 식별 수 있는 표준 전자 영향 (EI) 스펙트럼 라이브러리의 가용성 변화 발견 기능10,11. 그러나 GC-ms, 샘플의 준비, 다소 복잡 하 고 세부 사항에 주의 요구 한다. 샘플 수집, 세척, 몸 무게, 고 대사 반응을 신속 하 게 냉각 하는 방식으로 냉동 있습니다. 또한, 비행 시체는 표준 균질 프로토콜에 저항 하며 최적의 대사 산물 추출 되도록 비드 밀. 마지막으로, GC-MS 분석 샘플 탐지12이전 화학 derivatization를 겪어야 한다. 이전에 게시 방법이 단계3,,1314의 모든 설명, 동안 reproducibly 고품질 데이터를 생성 하는 초보자 사용자 있도록 시각적 프로토콜 여전히 필요 합니다. 여기 GC-MS 기반 대사체학 분석 초파리 애벌레 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜 reproducibly 측정 하는 중앙 탄소 물질 대사를 구성 하는 작은 극 지 대사 산물의 많은 사용자를 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>무황 블랙스트랩 당밀</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>피리딘</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>메톡시아민 하이드로콜로라이드(MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA with 1% 트리메틸클로로실란</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>플라이슈만 s 활성 건조 효모</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz 초파리 주식 병</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>연조직 균질화 믹스 (2 mL 튜브)&nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-627</td><td></td></tr><tr><td>바이알 인서트, 250 &마이크로; L 폴리머 피트가 있는 비활성화 유리</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>숙신산-2,2,3,3-d4</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-인산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>프로피온산</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-하이드록시 벤조산 메틸 에스테르</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>비드 Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>24 X 12 mm 블록이 있는 MultiTherm Shaker</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm 조직 배양 접시</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC 컬럼</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

가스 크로마토그래피-질량 분석 (gc-ms) 초파리 애벌레 샘플의 준비-대사체학을 기반으로

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Metabolomics의 분야의 최근 발전 동물 물질 대사 공부에 대 한 강력한 유전자 모델 초파리 melanogaster 과일 파리를 설립 했다. 결합 하 여 초파리 유전자 도구의 광대 한 배열을 조사 중간 대사의 큰 swaths 하는 기능, 대사체학 접근 다이어트, 유전자 형, 생활 역사 사건과 환경 신호 사이 복잡 한 상호 작용을 밝힐 수 있다. 또한, 대사체학 연구 소설 효소 기계 장치를 발견 하 고 겉보기에 서로 다른 대사 경로 사이 이전에 알려지지 않은 연결을 밝히기 수 있습니다. 초파리 지역 사회 중이 기술을 더 광범위 한 사용을 촉진 하기 위하여 여기 우리 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)에 대 한 초파리 애벌레 샘플을 준비 하는 방법을 설명 하는 상세한 프로토콜 제공- metabolomic 분석을 기반 으로합니다. 우리의 프로토콜 애벌레 샘플 수집, 대사 산물 추출, 화학 derivatization 및 GC-MS 분석에 대 한 설명을 포함합니다. 이 프로토콜의 성공적인 완료는 분해와 TCA 주기에서 아미노산, 당 분, 유기 산 관련된을 포함 하 여 작은 극 지 대사 산물의 관계 되는 풍부를 측정 하는 사용자 수 있게 됩니다.

젖 산 효소 dLDH 활동4, 그리고 유전자 일치 컨트롤 부족 (dLDH) 뮤턴트 중순 L2 애벌레로 수집 되었고 위에서 설명한 프로토콜에 따라 처리. 컨트롤과 비교 될 때 돌연변이 애벌레 젖 산, pyruvate, 및 L-2-hydroxyglutarate4에 상당한 변화를 전시 한다. 스펙트럼은 애질런트 GC6890 5973i MS 시스템으로 인수 했다. GC-MS 스펙트럼의 예로 생성 우리의 프로토콜 그림 1에 표시 됩니다. 많은 기능을 볼 수 있으며 일반적으로 애벌레 샘플의 가장 큰 피크를 나타냅니다 하 고 일반적으로, 트 레 할 로스에 대 한 주목할 만한 피크 oversaturated (그림 1AB). 부정적인 컨트롤 샘플의 개...

이 프로토콜 GC-MS 기반 metabolomic 분석 초파리 애벌레를 준비 하는 방법을 설명 합니다.

가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 초파리 애벌레 샘플의 준비-대사체학을 기반으로

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

이 방법은 온코메타볼라이트 L2-하이드록시글루타레이트가 건강한 세포에서 어떻게 합성되는지와 같은 대사 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 민감하고 재현 가능한 방식으로 100개 이상의 대사 산물을 직접 측정할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 프로토콜이 효율적인 시료 처리를 필요로 하고 수증기에 매우 민감하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.프로토콜을 시작하려면 미리 준비된 유충이 들어 있는 1.5ml 튜브에 얼음처럼 차가운 0.9%염화나트륨 1ml를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 튜브를 수직으로 뒤집어 유충을 깨끗이 씻은 다음 튜브를 얼음 위에 30초 동안 놓습니다. 유충은 튜브 바닥으로 가라앉지만 효모는 현탁액으로 남아 있습니다.모든 유충이 느슨한 펠릿을 형성하면 1ml 피펫을 사용하여 염화나트륨 용액을 제거합니다. 섭씨 4도에서 1분 동안 2, 000g에서 샘플을 원심분리합니다. 200마이크로리터 피펫을 사용하여 모든 잔류 용액을 제거하고 샘플을 액체 질소에서 즉시 동결합니다.에탄올 방지 마커를 사용하여 2밀리리터 나사 캡 비드 튜브의 측면에 레이블을 지정합니다. 다음으로, 0.01 milligram을 정확하게 측정할 수 있는 분석 저울을 사용하여 라벨링된 비드 튜브의 질량을 측정합니다. 긴 집게를 사용하여 액체 질소 듀어에서 1.5ml 샘플 튜브를 제거합니다.니트릴 장갑을 끼고 얼어붙은 튜브를 잡고 뒤집은 다음 튜브 뚜껑을 벤치탑에 세게 두드려 얼어붙은 펠릿을 제거합니다. 즉시 펠릿을 미리 타르 처리된 2밀리리터 나사 캡 비드 튜브에 붓습니다. 내인성 대사 경로가 재활성화되지 않도록 검체를 신속하게 처리해야 합니다.유충 펠릿과 비드 튜브의 결합된 질량을 빠르게 측정합니다. 즉시 샘플 튜브를 액체 질소에 넣습니다. 샘플 튜브를 섭씨 20도의 음의 탁상용 냉각기에 넣습니다.숙신산 D4 산 밀리리터당 2마이크로그램을 함유한 미리 냉각된 90% 메탄올 0.8밀리리터를 각 튜브에 추가합니다. 샘플을 섭씨 20도의 음의 탁상용 쿨러로 되돌립니다. 0.8밀리리터의 숙신-D4산을 1밀리리터당 2마이크로그램을 함유한 0.8밀리리터의 사전 냉각된 4% 메탄올을 빈 비드 튜브에 첨가하여 음성 대조군을 설정합니다.그런 다음 섭씨 4도 온도 제어실에 위치한 비드 밀 균질기를 사용하여 초당 6.45미터로 30초 동안 샘플을 균질화합니다. 균질화된 샘플을 섭씨 음의 20도 탁상용 쿨러로 되돌리고 쿨러를 섭씨 음의 20도 냉동고에 최소 1시간 동안 옮깁니다. 배양 후에, 20, 000 g에 4 섭씨 온도에 5 분 동안 유래한 침전물을 제거하기 위하여 관을 분리기로 하십시오.600 마이크로 리터의 상층액을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮기고 침전물을 방해하지 마십시오. 모든 샘플 튜브를 열고 진공 원심 분리기에 넣습니다. 모든 용매가 제거될 때까지 실온에서 샘플을 건조시킵니다.건조된 샘플이 섭씨 영하 80도에서 보관된 경우 개봉하지 않은 샘플 튜브를 진공 원심분리기에 넣고 30분 동안 건조시킵니다. 무수 피리딘에 밀리리터당 40mg의 메톡실아민 염산염 또는 MOX 용액을 준비합니다. MOX와 피리딘을 데시케이터에 보관합니다.그런 다음 히트 건을 사용하여 1 밀리리터 유리 주사기를 약 5 초 동안 건조시킵니다. 주사기의 바늘을 무수 피리딘 병에 삽입하십시오. 피리딘 1ml를 제거하고 40mg의 MOX가 들어 있는 마이크로퓨지 튜브에 추가합니다.프로토콜의 이 부분은 물에 매우 민감합니다. 모든 시약은 사용하기 전에 건조제에 보관해야 합니다. 또한 사용자는 샘플이 대기 중 수증기에 최소한으로 노출되도록 해야 합니다.그런 다음 무수 피리딘 병을 아르곤으로 씻어냅니다. 병을 밀봉하고 데시케이터에 다시 넣으십시오. 섭씨 35도의 열 혼합기에서 600rpm에서 10분 동안 튜브를 배양하여 MOX를 피리딘에 용해시킵니다.다음으로, 무수 피리딘 용액에 있는 40밀리리터 MOX당 40밀리그램의 40마이크로리터를 건조된 샘플에 추가합니다. 샘플을 10초 동안 볼텍스하고 잠시 원심분리합니다. 그런 다음 열 혼합기에서 샘플을 배양합니다.입자 사정을 제거하기 위하여 5 분 동안 20, 000 g 또는 최대 속도에 표본을 분리기로 만드십시오. 250마이크로리터의 비활성화된 유리 마이크로볼륨 인서트가 있는 25마이크로리터의 상등액을 오토샘플러 바이알로 옮깁니다. 1%TMCS를 함유한 MSTFA 40마이크로리터를 추가합니다.오토샘플러 바이알에 캡을 씌우고 크림퍼 도구를 사용하여 바이알을 밀봉합니다. 섭씨 37도에서 250rpm으로 흔들면서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 마지막으로, 주입 직전에 로봇 자동시료주입기를 사용하여 미리 준비된 지방산 메틸 에스테르 표준물질 또는 FAMES 용액 3마이크로리터를 자동시료주입기 바이알에 추가합니다.젖산 탈수소효소 돌연변이 유충의 가스 크로마토그래피-질량 분석법은 대조군 유충에 비해 젖산염, 피루브산 및 L2-하이드록시글루타레이트에서 상당한 변화를 보입니다. 프로토콜로 생성된 GC-MS 스펙트럼은 많은 가시적 특징과 트레할로스에 대한 주목할만한 피크를 보여주며, 이는 일반적으로 유충 샘플에서 가장 큰 피크를 나타냅니다. 주성분 분석(PCA)은 녹아웃 그룹과 와일드 유형 그룹이 서로 분리되어 있으며 두 그룹 모두에 이상치가 없음을 명확하게 보여줍니다.이 절차를 시도하는 동안 균질화 전에 샘플을 냉동 상태로 유지하고 절차 전반에 걸쳐 모든 시약을 건조한 상태로 유지하는 것이 중요합니다.

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Research

연구

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