Name: 제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 학습하세요 파라핀 포함 성인 산호 샘플의 제자리 교잡 기술을 통해 RNA 발현을 시각화하는 방법을. 이 기술은 산호 조직의 특정 유전자 발현 패턴을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 수상에 의해 투자 되었다 아니. OCE-버로우즈 Wellcome 펀드 박사 농축 프로그램에서 국립 과학 재단 해양 과학 박사 친목 및 수상 no.1012629 통해 1323652.

1입니다. 파라핀 제거
주의: 증기 두건에서 다음 단계를 수행 합니다.
<ol><li>100% 크 실 렌 유리 Coplin 단지 10 분의 후드 아래에 있는 얇은 sectioned 파라핀 끼워 넣어진 슬라이드 dewax 크 실 렌 녹는 플라스틱으로 플라스틱 Coplin jar를 사용 하지 마십시오. 사용 하기 전에 압력솥에 Coplin 항아리를 소독.</li>
	<li>다음 4 개의 메 마른 유리 Coplin 항아리를 준비: 100% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올과 60% 에탄올. RNase 무료 물과 에탄올을 희석.<ol>
<li>100% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 하 고 10 분 동안 그들을 담가. 10 분 후 빈 유리 Coplin jar 고 새로운 100% 에탄올을 바꿉니다. 다시 10 분에 대 한 슬라이드를 담근 다.</li>
		<li>1 분 동안 80% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 합니다.</li>
		<li>1 분에 70% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 합니다.</li>
		<li>1 분 60% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA 프로브 교 잡의 준비에 대 한 슬라이드 전처리
<ol><li>달리 지정 하지 않는 한, 실내 온도에 다음 세척을 수행 합니다. 느린 속도로 궤도 통에 실 온 세척을 수행 합니다. 최대 5 개의 슬라이드 공간 살 균 슬라이드 우편물을 사용 하 여 슬라이드의 세척에 대 한.</li>
	<li>슬라이드를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 18 mL와 멸 균 슬라이드 우편물 전송. 실 온에서 5 분 동안 세척.</li>
	<li>1 x PBS에서 부 어와 즉시 조직의 프로브 침투 수 있도록 가수분해 K와 함께 슬라이드에는 조직 치료. 슬라이드 우편물을 가수분해 K 솔루션의 약 18 mL을 추가 (작업 솔루션 농도 표 1 참조). 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 동요 하지 마십시오.<ol>
<li>슬라이드는 잠복기 동안 prehybridization 버퍼 (Prehybe 버퍼)를 준비 합니다. Prehybe 버퍼 10 분 동안 끓는 물 욕조에 배치 다음 5 분 동안 얼음 목욕에 냉각. Prehybe 버퍼의 제조 법, 표 1을 참조 하십시오.</li>
		<li>가수분해 K 솔루션 털어 여 성분 K 반응의 소화를 중지 하 고 즉시 슬라이드 우편물을 0.2% 글리신-PBS 솔루션의 18 mL를 추가. 슬라이드 우편물 실 온에서 5 분 동안 앉아 보자.</li>
		<li>0.2% 글리신-PBS 솔루션에 밖으로 부 어과 각 슬라이드 우편물을 2 배 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 솔루션의 18 mL을 추가. 슬라이드 2에서 씻어 100-150 rpm에서 떨고와 실 온에서 10 분 동안 x SSC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. RNA 프로브 교 잡에 대 한 준비에 슬라이드 prehybridization
<ol><li>슬라이드 2로 세척 되는 동안 x SSC, 새로운 살 균 슬라이드 우편물을 얻기와 슬라이드 우편물에 Prehybe 버퍼의 약 18 mL를 넣어. 교 잡 온도에서 교 잡 오븐으로 슬라이드 우편물을 놓습니다. 참고: 교 잡 온도 50-60 ° c.에서 일반적으로 범위에만 사용 되는 프로브에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>2 x SSC 세척 완료 되 면, SSC, 및 장소 2에 밖으로 부 어 1 시간에 대 한 교 잡 오븐에서 Prehybe 버퍼에 슬라이드 메일러 내의 슬라이드.</li>
</ol>4입니다. 교 잡의 RNA 프로브
<ol><li>슬라이드는 교 잡 오븐에서 Prehybe 버퍼와 잠복기는, 하는 동안 교 잡 프로브 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>교 잡 버퍼 (µ 프로브 0.5 L 교 잡 버퍼의 24.5 µ L)에서 각 프로브를 희석. 참고: 교 잡 버퍼에 대 한 제조 법은 표 1에서 발견 된다. 트레일러-놀 즈 외 에 조사 준비 및 농도의 예를 찾을 수 있습니다. 11.</li>
		<li>12 분, 86-90 ° C 열 블록에 희석된 프로브를 배치 후 얼음에 1 분 동안 쿨.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드 우편물 교 잡 오븐에서 제거 하 고 멸 균 핀셋을 사용 하 여 슬라이드 우편물에서 슬라이드를 개별적으로 제거. 종이 타월에 평평 슬라이드를 신중 하 게 조직 샘플 주위 Prehybe 버퍼 초과 닦아. 샘플, 터치 하지 않도록 주의 하 고 조직 샘플의 건조를 방지 하기 위해 신속 하 게 작업.</li>
	<li>PAP 펜 조직을 둘러싸십시오. 25 µ L를 피펫으로 희석된 프로브 솔루션의 적용 하 고 플라스틱 coverslip로 샘플을 커버.<ol>
<li>SSC + 챔버 바닥에 있는 50 %formamide 솔루션 x 4 슬라이드 습기 챔버에 샘플을 놓습니다.</li>
		<li>모든 슬라이드에 프로브를 추가한 일단 교 잡 교 잡 온도 50-60 ° c에서 24 시간 이상 오븐에 슬라이드 습기 챔버를 배치 보육 시간 탐사선의 농도 따라 다를 수 있습니다 하지만 24 시간 최소 이어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>희석 프로브 야간 보육, 후 교 잡 오븐에서 슬라이드 습기 챔버를 제거 합니다.<ol>
<li>각 조직 치환 하지 않도록 주의 되 고 슬라이드에서 coverslips를 제거 합니다. 1000 µ L 피 펫에 2 x SSC 솔루션의 1000 µ L을 추가 하 고 부드럽게 슬라이드를 씻어.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 2 x SSC 솔루션의 18 mL와 멸 균 슬라이드 우편물에 슬라이드를 놓습니다. 솔루션을 부 어 하 고 신선한 2의 18 mL x SSC. 부드러운 진동으로 실 온에서 5 분 동안 다시는 부 화를 반복 합니다.</li>
		<li>2 x SSC 솔루션을 붓는 다. 실 온에서 1 x SSC 솔루션 및 5 분 동안 세척의 18 mL를 추가 합니다. 1 x SSC 솔루션을 부 어 하 고 신선한 1의 18 mL x SSC. 부드러운 진동으로 실 온에서 5 분 동안은 부 화를 반복 합니다.</li>
		<li>1 개 부 어 x SSC. 동요 하지 않고 42 ° C에서 0.5 x SSC와 10 분 동안 세척 18 mL를 추가 합니다. SSC 및 바꾸기 x 0.5에 밖으로 부 어 신선한 0.5 18 mL와 함께 그것은 x SSC. 동요 하지 않고 42 ° C에서 10 분 동안 다시 세척.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. RNA 프로브의 시각화
참고: 프로브를 시각화, BM 보라색 사용 됩니다 개발 과정. 그러나,이 단계 전에 여러 세척은 얼룩에 대 한 샘플을 준비 해야 합니다.
<ol><li>1 분에 대 한 MgCl2 MgCl2, 없이 AP 버퍼에 밖으로 부 어 1 x Boehringer 임 차단 버퍼 maleic 산 버퍼 희석의 18 mL를 추가 하지 않고 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼 (AP-버퍼)의 18 mL와 함께 슬라이드를 씻어. 부드러운 진동으로 슬라이드 우편물에서 실내 온도에 적어도 1 시간에 품 어. 참고: Boehringer 임 차단 버퍼와 maleic 산 버퍼 사용 들어찬 되었고 발굴 세척 및 블록 버퍼 설정에서 구입한 (사용 가능한 상업적으로).<ol>
<li>또는, 4 ° C에서 하룻밤 인큐베이션을 수행할 수 있습니다. 더 이상 차단 기간 아닌 특정 바인딩의 모양을 줄일 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 mL 희석된 발굴 안티-digoxigenin-AP 놀라 우 파편의 준비 (안티 발굴 항 체 = 안티 발굴 항 체 + 20 mL 1 Boehringer 임 차단 버퍼 x 2 µ L). 이 1 플라스틱 슬라이드 우편물에 사용 하기 위해 충분 하다. 이 솔루션의 경우 하나 이상의 슬라이드 메일러 사용 되는 준비 되어야 한다.</li>
	<li>새로운 살 균 슬라이드 우편물을 방지 발굴 항 체를 추가 하 고 슬라이드 슬라이드 우편물 안티 발굴 항 체 솔루션에 전송. 부드러운 떨고와 3 시간 실 온에서 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 부 항 발굴 항 체 어 고 부드러운 떨고와 5 분 동안 MgCl2 없이 AP 버퍼의 18 mL와 슬라이드 우편물에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>MgCl2, 없이 AP 버퍼에 밖으로 부 어과 AP 버퍼의 18 mL을 추가. 부드러운 진동으로 5 분 동안 세척. 5 분 부 화 후 AP 버퍼에서 부 어, 신선한 AP-버퍼, 18 mL와 함께 그것을 대체 하 고 부드러운 떨고와 5 분 동안 세척.</li>
	<li>어둠 속에서, AP-버퍼에 밖으로 부 어 하 고 슬라이드 우편물에 보라색 BM의 18 mL를 추가 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 슬라이드를 품 어, 개발 되 고 조사에 따라 시각화를 위한 모든 ½ h. 반응 시간이 달라 집니다 보라색 컬러 개발에 대 한 검사. 참고: BM 보라색 시각화, 대신 개발 솔루션 만들 수 있습니다 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)를 사용 하 여 니트로 블루 tetrazolium (NBT). 자세한 내용은 표 1 을 참조 하십시오.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 5 분에 대 한 트리 스-EDTA (테) 버퍼의 18 mL와 함께 새로운 살 균 슬라이드 우편물에 슬라이드를 전송 하 여 컬러 개발을 중지 합니다.</li>
	<li>TE 버퍼에서 부 어와 슬라이드 우편물을 어둠 속에서 1 분 동안 세척 RNase 무료 물 18 mL을 추가.</li>
	<li>슬라이드, 물에서 제거 하 고 조직의 가장자리 주위에 그들을 건조. 매체를 장착 하는 글리세롤을 추가 하 고 장소는 coverslips. 사진 촬영 준비가 될 때까지 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+Change%2C+Human+Impacts%2C+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933(2003).</li>
<li>Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959378014001782">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li>
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<li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59(2007).</li>
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<li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+situ+hybridization+protocols%22">In situ hybridization protocols</a>. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).</li>
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<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li>
<li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900(2013).</li>
<li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15(2014).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li>
<li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+%28Leucoraja+erinacea%29%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24(2017).</li>
<li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3(2014).</li>
<li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubozoan+jellyfish%3A+an+Evo%2FDevo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 의료 및 진화 발달 연구8,9,10,,1217이전 작품에서 수정 되었습니다. 이 프로토콜 발굴 표시 된 RNA 안티 감각 프로브는 보존 되 고 파라핀에 포함 된 성인 산호에 제자리에 하이브리드의 뉘앙스에 집중 한다. 이 메서드는 파라핀 포함 된 또한 산호 넘어 생물의 샘플을 쉽게 전송할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 세포 배양, 또는 산호 (예를 들어, 유 충)의 다른 생활 단계 수행할 수 있습니다. 하지만 정확한 프로토콜 이러한 유형의 샘플은 항상 파라핀 포함5,6...

산호는 중요 한 생태계 빌더 바다와 인간의 건강1,,23에서 생물 다양성에 대 한 중요 한. 그들은 기후 변화 및 다른 anthropogenic 스트레스 위협을 받고 있다 그리고 많은 산호 종 비판적으로 멸종 위기에 놓인 것으로 간주 됩니다. 따라서, 세포 및 분자 도구 진단 스트레스 산호를 위한 중요 한 필요가 있다. 또한, 거기 약간 이해 된다 성인 산호 조직, 그리고이 유전자의 기능에 따라서 작은 이해 내 유전자가 표현 하는 곳에 대 한. 이 문제를 해결 하려면 우리는 현장에서 교 잡 (틱), 일반적으로 사용 되는 프로토콜 인간의 의학 및 진화 개발 생물학, 성인 산호의 파라핀 끼워 넣어진 조직 추출에서 사용 하기 위해 적응 시켰다. 이 기술은 열 스트레스에 노출 등 스트레스 이벤트 받은 성인 산호에 사용 될 때 가장 강력 하다. 그러나,이 기술은 다양 한 조직 및 산호의 삶의 단계에 사용할 수 있습니다 그리고만 열 스트레스 산호4,,67에 국한 되지 않습니다. 또한,이 기술은 사용할 수 cDNA 순서 정보는 조직 또는 모든 metazoan의 셀에 사용할 수 있습니다.
이 방법의 목적은 보존 및 파라핀에 포함 되었으며 슬라이드에 구분 성인 산호 조직 내의 RNA 프로브를 시각화 하는 것입니다. 이 방법은 성인 산호 조직 내에서 핵 산의 시각화에 대 한 허용 하는 강력한 진단 도구입니다. 처음에이 방법은 의료 진단에 대 한 개발 하 고 이후 발생 생물학 및 진화 개발 생물학8,,910분야에서 인기 있는 도구가 되고있다. 분의 비-모델 시스템, 게놈에서 특히 중요 한 방법 이기도 하 고 transcriptomic 시퀀스 데이터 사용할 수 있지만 공간 유전자 표현 패턴을 알 수 있습니다. 진단 작업 비 모델 시스템에 대 한이 기술은 강력 하다는 세포와 조직 관심사의 유전자를 표현 하 고 더 많은 타겟된 치료 접근8,,910, 이어질 수 있습니다 나타낼 수 있습니다 때문에 11,12. 마지막으로,이 기술은 질적 및 양적 유전자 표현 데이터11와 결합 하는 때 더 강력한입니다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 이미 digoxigenin (발굴) 설계 연구원에 게 관심이 될 것입니다-표시 된 RNA 프로브 (감각 및 antisense 프로브)는 이제 제자리에서 교 잡의 샘플을 프로브를 실행할 준비가 되었습니다. 이 메서드를 수행 하기 위해 파라핀 산호 직물의 2 개의 직렬 섹션 테스트 중인 각 프로브에 대 한 필요 합니다. 한 섹션 감지 프로브 및 센스 프로브에 대 한 다른 사용 됩니다. 감각 프로브를 나타내는 일반적인 바인딩 컨트롤 될 것입니다. 만약 얼룩이 지는 감각 프로브에서 관찰, 센스 프로브 관심의 RNA를 특정 하지 않습니다. 프로브는 모든 유전자 표현에 대 한 디자인할 수 있습니다. 이 프로토콜에 몇 가지 예는 사용 이전 산호에 열 스트레스 동안 표현할 것을 발견 했다: FBJ murine 다리 바이러스 oncogene 체 B (포-B), 활성 단백질 (AP1), 종양 괴 사 인자 수용 체 41 (TNFR 41)11. 그들의 처리는 많은 안전10때문에 방사성 프로브를 사용 하 여 분 발굴 표시 된 RNA 프로브를 사용 하 여 것이 좋습니다. 또한,이 기술은 매우 민감한 이며 다양 한 조직 및 열 스트레스 성인 산호13,14,,1516넘어 배아에서 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Denhardt의 솔루션</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld 알칼리 인산가수분해효소 완충액</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 메일러</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld 알칼리성 인산가수분해효소 완충액</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50mL 팔콘 튜브</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 연어 정자 DNA 용액</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - 인산염 완충 식염수(10X) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 증류수, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 증류수, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon 정자 DNA 용액</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 화이트 에이펙스 우수한 접착제</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>PBS 솔루션, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, 분자 등급, 2mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-Digoxigenin-AP 팹 단편</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG 세척 및 블록 버퍼 세트</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액, 500 mL 크기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC 버퍼 20X 농도</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 무수물</td><td>시그마-알드리치</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>트리에탄올아민</td><td>시그마-알드리치</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>크실렌, AR(ACS), 조직학적 사용</td><td>VWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>VWR</td><td>PAV6232</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 셰이커</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

산호는 바다의 전반적인 건강 뿐만 아니라 인간의 건강에 대 한 중요 한 중요 한 바다 무척 추 동물. 그러나, 상승 바다 온도 해양 산성화 등 인간의 영향으로 인해 산호는 점점 더 위협을 받고. 이러한 과제를 해결 하기 위해 세포 및 분자 생물학 산호의 건강 진단에 대 한 중요 한 것을 입증 했다. 인간의 의학에서 일반적으로 사용 되는 기법 중 일부를 수정 연구자의 능력을 치료 하 고 산호 저장에 크게 향상 시킬 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 현장에서 교 잡 인간의 의학 및 진화 개발 생물학에서 주로 사용 하는 프로토콜 스트레스 성인 산호에 사용 하기 위해 적응 되었습니다.
이 방법의 목적은 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분 된 성인 산호 조직에서 RNA 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 것입니다. 이 메서드는 파라핀 및 샘플의 재 수 화 작용의 제거, 샘플, 사전 교 잡 부 화, RNA 프로브의 교 잡 그리고 RNA 프로브의 시각화의 침투성을 보장 하기 위해 샘플의 전처리에 중점을 둡니다. 이 때 강력한 방법 비 모형 유기 체를 사용 하 여 특정 유전자가 표현 및 프로토콜은 다른 비 모형 유기 체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 그러나, 방법은 식 강도 시각화 단계 및 프로브 농도 동안 사용 시간에 따라 달라질 수 있기 때문에 그것은 주로 질적 제한 됩니다. 또한,이 프로토콜 최대 5 일 (와 많은 경우에, 더 이상) 사용 되는 프로브에 따라 걸릴 수 있습니다 인내심 필요 하다. 마지막으로, 일반적인 배경 얼룩은 일반적, 그러나이 한계를 극복할 수 있습니다.

이 프로토콜을 완료 한 후 관심의 RNA 프로브를 표현 하는 조직과 세포의 식별 달성 될 것 이다. 이 프로토콜에 대 한 대표적인 결과 AP 1, FosB, 및 TNFR41입니다. 이러한 결과 이전 트레일러 놀 즈 외 에 출판 11, 열 스트레스에 노출 된 성인 산호에 프로브는 RNA의 표시 공간 표현 합니다. 다른 얼룩 유형의 두 가지 예는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 1A 확산 조직 얼룩의 예입니다. 얼룩 뿐만 아니라 특정 셀에에서는 조직에 걸쳐 발견 된다. 여기, 반대로 감각 AP-1의 식 표 피와 구두 gastrodermis11 (그림 1A)에 걸쳐 발견 된다. 얼룩이 확산 하 고 하나의 특정 세포 유형...

이 프로토콜의 목표 성인 산호 샘플 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분에 교 잡 현장에서 수행 하는 것입니다. 이것은 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 RNA 방지 감지 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 데 사용 하는 질적 방법입니다.

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

이 방법은 어떤 유형의 조직과 세포가 특정 유형의 유전자를 발현하는지와 같은 산호 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 RNA 발현에 대한 시각적 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법은 성인 산호의 공간 유전자 발현에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 산호의 다른 생활 단계와 다른 무척추 동물 시스템에서도 사용할 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 추적해야 할 단계와 솔루션이 너무 많기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 따라서 그들은 프로토콜에서 자신이 어디에 있는지 주의를 기울이고 세탁을 할 때 시간을 잘 추적해야 합니다. 제 연구실의 기술자인 Kevin Rodriguez가 이 절차를 시연할 것입니다.시작하려면 후드 아래에서 10분 동안 유리 Coplin 용기에 100% 자일렌이 포함된 얇은 절편 파라핀 내장 슬라이드를 왁스합니다. 다음으로, 4개의 멸균 유리 Coplin 항아리에 각각 100% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올 및 60% 에탄올을 채웁니다. 먼저 100% 에탄올이 들어 있는 Coplin 용기에 슬라이드를 옮기고 10분 동안 담가둡니다.그런 다음 슬라이드를 100% 에탄올이 함유된 다른 Coplin 용기로 옮깁니다. 각 Coplin 용기에 대해 이 과정을 에탄올 농도가 내림차순으로 반복합니다. 먼저 슬라이드를 18mL의 PBS가 들어 있는 멸균 슬라이드 메일러로 옮깁니다.그런 다음 실온에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다. 다음으로, PBS 1부피를 붓고 약 10mL의 proteinase K 용액을 메일러에 추가합니다. 그런 다음 메일러를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.슬라이드가 배양하는 동안 prehyb 버퍼를 끓는 물 수조에 10분 동안 넣습니다. 그런 다음 얼음 수조에서 버퍼를 5분 동안 식힙니다. proteinase K 반응에 의한 분해를 중지하려면 proteinase K를 제거하고 0.2%glycine PBS 용액 18mL를 메일러에 추가합니다.그런 다음 메일러를 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 글리신 PBS 용액을 제거하고 18mL의 2x 식염수 시트르산 나트륨 또는 SSC로 교체합니다. SSC에서 슬라이드를 실온에서 100-150RPM으로 흔들면서 10분 동안 세척합니다.슬라이드가 혼성화 오븐에서 배양하는 동안 프로브를 혼성화 완충액에서 희석합니다. 그런 다음 희석된 프로브를 섭씨 8

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JoVE Journal

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환경

마우스 조직에서 데이터 수집을 최대화하기 위해 다양한 기술의 조합이 제공됩니다.

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

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식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될...

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

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형광 현장 혼성화 및 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 표지 수중동물 해파리 클라도네마 파시피쿰에서 줄기 유사 세포

여기에서는 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석을 위해 산호 홀로비온트에서 극성 및 반극성 대사 산물의 추출 및 준비와 분리된 산호 숙주 조직 및 Symbiodiniaceae 세포 분획을 제시합니다.

가스 크로마토그래피 - 경산호 시료의 질량분석법 기반 표적 대사체학

이 프로토콜은 멸종 위기에 처한 산호 종의 정자 처리 및 냉동 보존의 효율성과 용량을 개선하기 위한 반자동 경로를 설명하여 유전적 다양성을 확보하고 산호초 복원 노력을 지원하는 것을 목표로 합니다.

바이오뱅킹 및 양식업을 지원하기 위한 산호 정자의 냉동 보존을 위한 반자동 워크플로우

학습하세요 파라핀 포함 성인 산호 샘플의 제자리 교잡 기술을 통해 RNA 발현을 시각화하는 방법을. 이 기술은 산호 조직의 특정 유전자 발현 패턴을 연구하는 데 활용됩니다.

제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술

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