새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

이 방법은 새로운 질병의 출현과 같은 환경 바이러스학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 세포 성분으로부터 변이체를 정제하고, 해당 변이체들을 사용하여 시퀀싱을 위한 DNA를 추출하는 것입니다. 저는 온실의 식물들이 하나 이상의 미지의 Badnaviruses에 감염되었다는 것을 발견했을 때 처음으로 이 아이디어를 떠올렸습니다. 이 방법이 처음인 분들은 세 가지 이유로 어려움을 겪을 수 있습니다. 첫째, 균질화는 양질의 수율을 보장하기 위한 결정적인 단계입니다. 둘째, 차등 원심분리를 통해 여러 개의 펠릿이 생성될 수 있으며, 이러한 펠릿들을 식별하고 분리하는 방법을 알아야 합니다. 셋째, 바이오 분석기(bio-analyzer)의 결과 해석 또한 어려울 수 있습니다.

본 절차의 모든 단계에서 실험복과 장갑을 착용해야 합니다. 먼저 -20 °C에서 냉동 보관했던 병든 식물에서 잎 80~100 g을 채취하십시오. 그다음 200 mL의 분쇄 완충액과 0.5% sodium sulfite를 사용하여 Waring 블렌더로 잎을 분쇄합니다. 균질화된 시료를 1 L 비커에 옮기십시오.

적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태에서, 균질액에 urea 18 g과 10% 비이온성 세제 25 mL를 첨가하고 비커를 알루미늄 호일로 덮습니다. 마그네틱 교반기를 사용하여 하룻밤 동안 교반합니다. 다음 날, 균질액을 250 mL 원심분리 로터 병에 옮기고 고정각 로터를 사용하여 4 °C에서 4000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 회수하여 네 겹의 치즈 천으로 여과합니다. 회수된 액체 균질액의 부피를 측정한 다음, 균질액을 38.5 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 나누어 담습니다. 균질액을 4 °C에서 40,000 ×g로 2.5시간 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 튜브 바닥에 녹색 펠렛이 있는지, 그리고 튜브 길이를 따라 흰색 펠렛이 형성되었는지 확인합니다. 두 펠렛은 그대로 유지한 채 상층액을 따라내고 샘플을 얼음에 둡니다.

흰색 펠렛과 녹색 펠렛을 분리하는 것은 전체 과정에서 가장 까다로운 단계 중 하나이며, 인내심과 숙련된 기술이 필요합니다.

화학 흄 후드 내에서 고무 폴리스맨을 사용하여 펠렛을 분리합니다. 펠렛을 긁어 서로 다른 로터 병으로 옮깁니다. 흰색 펠렛이 담긴 로터 병을 얼음에 둡니다. 각 병에 1 mL의 물을 추가하고 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 1~2시간 동안 5분마다 혼합물을 피펫팅하여 펠렛을 다시 현탁시킵니다. 흰색 펠렛이 모두 재현탁되면, 해당 현탁액을 4 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다.

다음 날, 4°C에서 6000 ×g로 10분 동안 현탁액을 원심분리하여 남은 부유물을 제거합니다. 농축된 현탁액을 새 튜브로 옮긴 후 4°C에서 136,000 ×g로 2시간 동안 원심분리하여 비리온을 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 1 mL의 완충액에 재현탁합니다.

먼저 비리온을 파쇄하여 이 절차를 시작합니다. 펠렛 현탁액에 2 µg/µL proteinase K 용액 40 µL를 첨가하고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 각 시료에 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올을 1부피 첨가하고 20초 동안 손으로 흔들어 섞어줍니다.

실온에서 16,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층의 수용액층을 제거하여 새 튜브로 옮깁니다. 이 추출 과정을 2회 이상 반복합니다.

에탄올 침전법을 사용하여 DNA를 농축합니다. 0.3 M sodium acetate(pH 5.2)와 2.5 부피의 95% 에탄올을 사용하십시오. 시료를 -20 °C에서 30~60분 동안 보관합니다. 그 후, 13,000 ×g에서 10~20분 동안 원심분리하여 DNA 펠릿을 형성합니다.

실험대에서 DNA 펠렛을 1 mL의 0.1 mM TE 완충액에 재현탁합니다. 원심분리를 통해 상용 겔 여과 컬럼으로 현탁액을 여과합니다. 에티듐 브로마이드 염색을 이용한 1% 아가로스 겔 전기영동으로 샘플을 분석하여, 본문에 기술된 대로 준비물의 상태를 확인하고 DNA의 품질을 평가합니다.

투과전자현미경으로 관찰했을 때, 감염된 칸나 잎의 조분획으로 회수한 흰색 펠렛에서 바이러스 입자가 발견되었습니다. 녹색 및 흰색 펠렛에서 회수한 DNA에 대해 아가로스 겔 전기영동을 실시한 결과, 빨간색과 노란색 점으로 표시된 흰색 분획에서 두 개의 고분자량 DNA 밴드가 확인되었습니다.

감염된 잎에서 분리한 RNA의 무결성은 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였습니다. 이 차트는 조립된 조립체(contig)의 풍부도와 조립된 바이러스 조제물로부터의 분류학적 분포를 보여줍니다. 그리고 이 차트는 Caulimoviridae 과, Badnavirus 속과 관련된 바이러스 조립체의 비율 및 밀접하게 연관된 3개 종과 관련된 조립체의 비율을 나타냅니다.

다음 두 차트는 분류학적 분포에 따른 RNA 시퀀싱 유래 contig의 풍부도를 보여줍니다. 오른쪽 차트는 Caulimoviridae 과의 Badnavirus 속 및 밀접하게 관련된 세 가지 종과 연관된 바이러스 contig 집단 내의 contig 풍부도를 나타냅니다. DNA 및 RNA 시퀀싱으로 생성된 바이러스 게놈 길이의 contig를 상호 스캐폴드로 비교함으로써 두 개의 전체 길이 바이러스 게놈이 존재함을 확인하였습니다.

마지막으로, 바이러스에 감염된 잎에서 추출한 RNA를 이용한 RT-PCR 분석을 통해 두 바이러스 게놈이 모두 검출되었습니다.

이 기술에 숙련되면 이틀 정도 소요되나, 초보자의 경우 사흘이 걸릴 수 있습니다. 이 절차를 처음 수행할 때는 각 상층액 내 균질액의 부피를 기록하는 것이 중요하며, 이를 통해 절차 종료 후 최종 DNA 수율을 초기 시작 물질과 비교할 수 있습니다.

이 방법이 발견된 이후, 식물 바이러스학 분야의 연구자들은 환경 내의 새로운 DNA 바이러스를 식별할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 식물 재료를 균질화하고 변이체를 농축하며, 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)에 사용할 수 있는 충분한 양의 DNA를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. urea와 phenol chloroform을 사용하는 작업은 매우 위험하므로, 이러한 화학 물질을 다룰 때는 항상 고글, 장갑, 실험복 및 마스크를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 안전한 초원심분리를 위해서는 튜브의 균형을 적절히 맞추는 것이 중요하므로, 튜브의 무게를 측정하여 로터의 서로 반대편에 배치해야 하며, 각 튜브의 무게 차이는 0.01 이내여야 합니다.