Name: 새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 학습하세요 감염된 식물 잎에서 바이러스 입자를 분리하고 DNA를 추출하여 차세대 염기서열 분석을 수행하는 방법을. 차등 원심분리와 페놀-클로로포름 정제를 통해 고품질 바이러스 게놈을 확보할 수 있습니다.

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연구는 과학의 발전 및 기술 적용 연구 프로그램 단계 II 아칸소 132-053-2; 오클라호마 센터에 의해 투자 되었다 그리고 농업 특수 작물의 오클라호마 부에 의해 연구 교부 금 프로그램. 우리 감사 황 홍 진 오 생물 정보학 핵심 시설 NSF (EOS-0132534)와 NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 5P20RR15564-03)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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최근 몇 년 동안에서 다양 한 방법 바이러스 유사 입자 (VLP) 또는 바이러스 특정 RNA 또는 DNA2,3,44, 풍부 하 게 포함 하는 자연 환경에서 식물 바이러스 생물 다양성 연구에 고용 되어 45,46 . 이러한 메서드는 NGS와 bioinformatic 분석 뒤. 이 연구의 목표는 재배 식물에 일반적인 질병의 인과 대리인을 찾을 했다. 질병은 비 싸여 bacilliform 입자는 565 bp 조각만 복제47는 되었습니다 알 수 없는 바이러스의 결과 보고. 이 정보는 이전 연구자 가정해 가족 내에서 Caulimoviridae Badnavirus 속에 바이러스를 할당에 대 한 충분 한 했다. 이전 보고서는 칸 나 백합에 칸 나 순 질병은이 연구에서 제시 된 metagenomics 접근을 사용 하 여 단일 badnavirus의 결과 가설 하는 동안 우리는 질병 두 미정 badnavirus 종24기인 했다 결정. 따라서, 질병의 인과 대리인을 발견 하는 metagenome 접근을 사용 하 여의 힘은 우리가 지금 상황을 식별할 수 있는 하나 이상의 원인이 있을 수 있습니다.
DNA와 RNA 시퀀싱 데이터를 결합 하는 우리의 접근 철저 한 이며 또한 결과 두 가지 방법을 사용 하 여 일관 된 결과 굴복 하 고 두 개의 관련된 바이러스의 존재를 확인을 보여 줍니다. 우리 caulimoviruses의 격리에 대 한 수정된 절차를 고용 하 고는 관련 바이러스 핵 산에 대 한 풍부한 했다 고 그 바이러스 capsid 내에서 보호 된 샘플 제작. 서비스 실험실 DNA 시퀀싱을 수행 하기로 계약 했다. 드 노 보 시퀀싱에 대 한 필수 개념은 DNA 중 합 효소는 DNA 합성의 순차적 주기 동안 서식 파일 DNA 가닥으로 뉴클레오티드를 표시 하는 형광 통합 이다. contigs 조립 뒤 NGS에 의해 생산 바이러스 contigs로 확인 된 몇 가지 contigs bioinformatic로 제출 했다. 두 바이러스 게놈10,24,,4849,50 의 추가 확인 RNA-seq 데이터 ribo 고갈 RNA 준비에서 얻은 bioinformatic 분석을 통해 얻은 것입니다. 흥미로운 결과 시퀀스의 인구 DNA와 RNA 시퀀싱 되 배워야 하나 비 바이러스 및 바이러스 핵 산의 유사한 배급 제공. DNA와 RNA 시퀀싱에 대 한 시퀀스의 < 0.5% 바이러스 기원 했다. 내 바이러스 Caulimoviridae가족에 속한 시퀀스 78-82%의 인구. DNA와 RNA 시퀀싱에서 조립된 바이러스 contigs 비교 하 여 우리는 두 개의 조립된 게놈 두 데이터 집합에서 발생 한 확인 했다.
유일한 DNA 시퀀싱을 사용 하 여 새로운 바이러스 유전자를 식별 하는 관심사 badnavirus 게놈 오픈 원형 DNA 이다. 우리는 게놈에 있는 불연속을 중첩 시퀀스 contigs에서 게놈 어셈블리에 대 한 장애물을 제시 수 있습니다 추측. DNA 시퀀싱 결과의 초기 시험 두 유사한 바이러스 게놈을 공개 했다. 우리는 이러한 게놈 중 하나는 공부 하지 않은, 종의 유전적 다양성 대표 가설 또는 공동 감염 같은 대표 두 종 공장24. 따라서, 집단 bioinformatic 분석 NGS DNA와 RNA 시퀀싱 하 여 가져온 데이터 집합의 두 개의 전체 길이 genomes의 존재의 확인을 사용할 수 있습니다.
Metagenomic 연구, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV;는 caulimovirus)3에서 DNA를 복구 하는 절차에 따라 식물 homogenates에서 VLP 및 핵 산을 추출 하기 위한 다른 방법을 개발 하는 다른 보고서가입니다. 이 방법은 식별 소설 RNA 및 DNA 바이러스 시퀀스 비 재배 식물. 재배 식물의 질병의 인과 대리인 발견이 연구에 사용 된 caulimovirus 격리 절차에서 파생 된 단계 VLP을 추출 하는 자연적으로 감염 된 식물24에서 파생 된 단계와는 달리 있습니다. 두 수정된 방법의 성공 caulimovirus 격리에 대 한 프레임 워크 절차 일반적으로 식물 바이러스의 metagenomic 연구에 대 한 귀중 한 시작 지점을 있을 수 있습니다 제안 합니다.

신흥 식 물병 드라이브 올바른 인과 에이전트를 식별 하는 새로운 도구를 개발 하는 연구원. 새로운 또는 되풀이 바이러스 질병의 초기 보고서 모자이크 및 잎 정 맥 지우기, 왜소, 시 들고, 병 변, 괴 사, 기형 같은 일반적으로 발생 증상 또는 다른 증 후를 기반으로 합니다. 질병에 대 한 인과 에이전트 다른 오염 병원 체에서 그것을 분리 하는 새로운 바이러스를 보고 하기 위한 표준 적합 한 호스트에 그것을 전파 하 고 원래 호스트 종의 건강 한 식물으로 접종에 의해 질병을 재현. 이 접근에 한계는 식물 바이러스의 많은 속 곤충 또는 다른 벡터 전송 또는 다시 원래 호스트 종에 적합 한 호스트에 대 한 의존 이다. 이 경우에, 적절 한 벡터에 대 한 검색을 연장 수, 실험실 식민지는 벡터의 설정에 어려움이 있을 수 있습니다 있으며 더 노력 실험적인 전송에 대 한 프로토콜을 고안 하는 데 필요한. 성공적인 실험실 전송 연구에 대 한 조건을 얻을 수 없는 경우 다음 작업 짧은 폭포 표준 보고 새로운 바이러스 질병. 매우 낮은 titers에 그들의 자연적인 호스트에서 발생 하는 바이러스에 대 한 연구자는 연구 수행에 대 한 충분 한 전염 성 주식을 유지 하기 위해 전파에 대 한 대체 호스트를 식별 해야 합니다. 몇 가지 식물을 감염 하는 바이러스 종에 대 한이 주식 문화1성장에 걸림돌이 될 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 과학자는 고용 더 자주 높은 처리량 NGS와 metagenomic 접근 알려진된 질병에 관련이 있을 수 있습니다 하지만 분류학 종과 장군에 할당 될 수 있습니다 환경에 존재 하는 바이러스 시퀀스를 밝히기 2 , 3 , 4. 발견 및 고유한 환경에서 유전 물질의 분류에 같은 접근 자연에서 바이러스 다양성 또는 특정 생태계에서 그들의 존재를 설명 하는 방법을 제공 하지만 반드시 정의 하기 위한 프레임 워크를 확인 하지 않습니다 명백한 질병에 대 한 인과 대리인입니다.
Badnavirus 속 pararetroviruses의 Caulimoviridae 가족에 속한다. 이 바이러스는 약 7 ~ 9 kb의 원형 이중 가닥 DNA 게놈을 가진 모양에 있는 bacilliform. 모든 pararetroviruses RNA 중간을 통해 복제합니다. Pararetroviruses는 episomes로 존재 하 고 복제 식물 염색체 DNA5,6의 독립. 바이러스 인구의 분야 연구는 이러한 바이러스는 유전자 복잡 한 나타냅니다. 또한, 높은 처리량 연속 식물 게놈의 범위에 걸쳐 얻은 정보 위법 통합 이벤트로 식물 게놈으로 삽입 하는 badnavirus 게놈 조각의 수많은 예제를 발견 있다. 이러한 내 생 badnavirus 시퀀스 감염7,,89,,1011와 반드시 연결 되지 않습니다. 그 후, 질병의 인과 대리인으로 새로운 badnaviruses를 식별 하는 NGS의 사용 episomal 게놈의 부분 모집단 다양성 생 시퀀스12,13의 발생에 의해 복잡 합니다.
소설 pararetrovirus 유전자의 발견에 대 한 최적의 파이프라인은, 질병에 대 한 인과 대리인으로 서 이러한 바이러스를 식별 하는 두 가지 일반적인 방법 있습니다. 1 개의 방법은 감염 된 잎에서 작은 RNA 순서에 대 한 풍부 하 고 다음 이러한 시퀀스 바이러스 genome(s)14,15,,1617를 다시 구성할 것입니다. 다른 방법은 회전 원형 증폭 (RCA) 원형 DNA 바이러스 게놈18증폭입니다. RCA의 성공 잎 및 선택한 조직에 바이러스 titer의 나이에 따라 다릅니다. RCA 제품 제한 소화를 받게 되며 직접 시퀀싱19,,2021플라스 미드로 복제.
칸 나 노란색 반점 바이러스 (CaYMV)는 badnavirus 이며, 게놈의만 565 bp 파편 이전 감염된 cannas22분리 되었습니다 비록 칸 나에 노란 반점 질병의 etiological 원인으로 설명. 현대 연구에서 Alpinia purpurata (꽃 생강; CaYMV 식별 CaYMV-Ap)23. 이 연구의 목표는 감염 된 칸 나 백합에서 완전 한 badnavirus 게놈 시퀀스를 복구 했다. 우리 공장에서 오염 물질에서 바이러스를 정화 하 고이 준비에서 바이러스 성 DNA 분리에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 DNA 도서관 NGS에 사용 하기 위해 준비. 이 방법은 중간 분자 증폭 단계에 대 한 필요가 없다. 우리 또한 RNA이 NGS, 대 한 감염 된 식물에서 mRNA를 분리 RNA-seq 포함 실시 했다 각 핵 산 준비를 사용 하 여. 조립된 contigs Badnavirus taxon 도구에 대 한 생물 공학 정보 (NCBI) 기본적인 현지 줄 맞춤 검색 핵 산 (BLASTn)에 대 한 국립 센터를 사용 하 여 두 데이터 집합에 관련 된 발견 되었다. 우리는 2 개의 badnavirus 종24의 유전자 발견.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>바이러스 정제용 분쇄 버퍼</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0751</td><td>바이러스 정제를 위한 분쇄 버퍼</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>바이러스 정제 요소용 분쇄 버퍼</td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>균질화 추출&nbsp;</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>X-100</td><td>균질산 추출&nbsp;</td></tr><tr><td>치즈클로스</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>필터 균질산물&nbsp;</td></tr><tr><td>트리스&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>펠렛 재현탁액 및 DNA 재현탁 완충액&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>펠릿 재현탁 완충액</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>스펙트럼</td><td>E1045</td><td>효소 반응 중지</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>DNA 재현탁 완충액</td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:이소아밀알코올&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>비리온 단백질</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>추출물에서 세포 DNA 분해</td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>바이러스 DNA 침전</td></tr><tr><td>실험실 블렌더</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>그라인드 리프 샘플</td></tr><tr><td>바닥 모델 초원심분리기&nbsp; & Ti70 로터</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&nbsp;</td><td>A94471</td><td>세포 추출물의 분리</td></tr><tr><td>바닥 모델 원심분리기와 JA-14 로터</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>세포 추출물의 분리</td></tr><tr><td>자석 스티어 플레이트</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>밤새 샘플에 요소를 섞어</td></tr><tr><td>고무 경찰관</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>바이러스 펠릿을 용해</td></tr>;<tr><td> 2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>DNA 및 RNA의 품질 및 수량에 대한 민감한 검출</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>2100 Bioanalyzer에서 RNA 품질을 이동, 염색 및 측정하는 데 사용되는 Microfluidics 칩</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td><td></td><td>5067-4626</td><td>2100 Bioanalyzer에서 DNA 품질을 이동, 염색 및 측정하는 데 사용되는 Microfluidics 칩</td></tr><tr><td>Nanodrop 분광 광도계</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>절차의 중간 단계에서 DNA/RNA 품질 분석</td></tr><tr><td>식물 총 RNA 분리 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>RNA-seq</td></tr><tr><td>RNase-free water를</td> 위한 RNA 분리&nbsp;<td>VWR</td><td>10128-514</td> NGS RNA 집중 장치 스핀 컬럼<td>을 위한 DNA 및 RNA의 재부유</td></tr><tr><td></td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>RNA-seq</td></tr><tr><td>rRNA 제거 키트</td>를 위한 RNA 준비 <td>Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>RNA-seq를 위한 RNA 준비</td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>RNA-seq를 위한 RNA를 준비</td></tr>;<tr><td> RNA&nbsp; 농축 시스템</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>RNA-seq Agarose를 위한 RNA를 준비합니다</td></tr><tr><td>.</td>절차<td>의 중간 단계에서 DNA/RNA 품질의</td> <td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td> 겔 분석</tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>Agarose gel staining</td></tr><tr><td>pGEM-T +JM109 competent cells</td><td>Promega, Madison,</td><td>WI A3610</td><td>클론 게놈 단편</td></tr><tr><td>pFU Taq polymerase</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>PCR 증폭 바이러스 게놈</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>PCR 증폭 바이러스 게놈</td></tr><tr><td>PCR 올리고뉴클레오티드</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>맞춤 주문</td><td>PCR 증폭 바이러스 게놈</td></tr><tr><td>Miniprep DNA 정제 키트</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>염기서열분석 전 플라스미드 DNA 정제</td></tr><tr><td>PCR 클린업 키트</td><td>Promega</td><td>A9281</td> pDRAW32 <td>소프트웨어 ACAClone</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>복제를 위한 PCR 제품 준비원형 DNA 및 모티프의 컴퓨터 분석</td></tr><tr><td>MEGA6.0 소프트웨어</td><td>MEGA</td><td></td><td>분자 진화 유전학 분석</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&trade; 리보그린&트레이드; RNA 분석 키트</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>RNA 수량의 형광 측정</td></tr><tr><td>GS Junior&trade; 파이로시퀀싱 시스템</td><td>Roche</td><td>5526337001</td><td>염기서열분석 플랫폼</td></tr><tr><td>GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996520001</td><td>에멀젼 PCR 용 시약</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR 비드 회수 시약</td><td>Roche</td><td>5996490001</td><td>에멀젼 PCR</td></tr> <tr><td>용 시약GS Junior EmPCR 시약 (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996538001</td><td>에멀젼 PCR 용 시약</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR 오일 & 브레이킹 키트</td><td>Roche</td><td>5996511001</td><td>에멀젼 PCR 용 시약</td></tr><tr><td>GS Jr 티타늄 시퀀싱 키트*</td> <td>Roche</td><td>5996554001</td><td>시퀀싱 시약, 효소, 완충액 및 패킹 비드 포함</td></tr><tr><td>GS Jr. 티타늄 Picotiter 플레이트 키트</td><td>Roche</td><td>5996619001</td><td>관련 시약 및 개스킷이 있는 시퀀싱 플레이트</td></tr><tr><td>IKA Turrax 믹서</td><td></td><td>3646000</td><td>Turrax와 함께 사용되는 특수 믹서 튜브</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tube (특수 믹서)</td><td></td> <td>20003213</td><td>에멀젼 생성을위한 내부 로터가있는 특수 혼합 튜브</td></tr><tr><td>GS Nebulizers Kit</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>라이브러리 준비 중 사용하기위한 핵산 크기 분류기</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR 비드 카운터</td><td>Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>라이브러리 비드 카운터</td></tr><tr><td>GS Junior 비드 증착 장치</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>원심분리 중 Picotiter 플레이트용 홀더</td></tr><tr><td>카운터웨이트 & 비드 증착 장치용 어댑터</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>피코티터 플레이트 원심분리와 증착 장치의 균형을 맞추는 데 사용</td></tr><tr><td>GS Junior Software</td><td>Roche</td><td>05 996 643 001</td><td>기기 제어, 데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어 제품군</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(위의 항목 05 996 643 001에 포함)</td></tr><tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(위 항목 05 996 643 001에 포함)</td></tr><tr><td>GS De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(위 항목 05 996 643 001에 포함)</td></tr><tr><td>GS Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(위 항목 05 996 643 001에 포함)</td></tr><tr><td>GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(위 항목 05 996 643 001에 포함)</td></tr></tbody></table>

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 rna 분석 원유 virion 추출에 dna의 결합 분석

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Metagenome 이렇게는 원형 DNA 게놈으로 식물 바이러스 및 그들의 증명서를 식별 하는 데 사용 됩니다. 종종 식물 DNA 바이러스는 그들의 호스트에 낮은 titers에서 발생 또는 다른 호스트에 기계적으로 주사 될 수 없다는 전파 감염 물질의 더 큰 titer를 달성 하기 어렵다. 감염 된 잎은 최적의 pH와 이온 조성 대부분 bacilliform 파라 레트로 바이러스를 정화 하는 것이 좋습니다 가벼운 버퍼에 지상. 요소는 virions 함정 포함 시체를 휴식 하 고 세포질 구성 요소를 분해 하는 데 사용 됩니다. 차등 원심 분리 공장 오염 물질에서 virions의 분리를 추가 제공합니다. 다음 가수분해 K 치료는 capsids 제거합니다. 바이러스 성 DNA 이다 집중 그리고 차세대 시퀀싱 (NGS) 사용 합니다. NGS 데이터는 NCBI-BLASTn 바이러스 시퀀스 생성 된 데이터 집합의 하위 집합을 식별 하는 제출 contigs 조립 하는 데 사용 됩니다. 병렬 파이프라인에서 RNA는 감염 된 잎은 표준 열 기반 RNA 추출 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 다음 리보솜 고갈 mRNA 및 바이러스 성적 하위 집합에 대 한 풍부 하 게 수행 됩니다. 조립된 시퀀스 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에서 파생 된 바이러스 시퀀스에서이 데이터 집합의 하위 집합을 식별 하기 위해 NCBI BLASTn에 제출 했다. 우리의 연구에서 우리는 두 개의 데이터 집합에서 두 개의 관련된 전체 길이 badnavirus 유전자 발견. 이 메서드는 식물 바이러스 게놈 시퀀스를 다시 구성할 작은 RNA 시퀀스의 집계 인구를 추출 하는 또 다른 일반적인 접근을 선호. 이 후자의 metagenomic 파이프라인 복구 바이러스 관련 시퀀스는 복고풍 속기 요소 식물 게놈으로 삽입 됩니다. 이를 더 적극적으로 전염 성 요원을 분별 생화학 또는 분자 분석을 결합 이다. 이 연구에서 설명 하는 접근 가능성이 표시 활성 바이러스 감염 하는 바이러스 복제의 시퀀스를 복구 합니다.

이 수정된 바이러스 정화 방법 바이러스 DNAs NGS와 생물 정보학 두 바이러스 종 식별 하는 데 유용의 농축을 제공 합니다. 후에 homogenate에서 40000 x g 2.5 h에 대 한 centrifuged는, 튜브의 하단에 녹색 펠 릿과 길이 따라 흰색 펠 릿 있었습니다. 녹색 펠 릿은 한 microcentrifuge 튜브에 resuspended 그리고 화이트 펠 릿 두 microcentrifuge 튜브 resuspended 했다. PCR 표준 CaYMV PCR 진단 뇌관을 사용 하 여 실행 되었다 고 제품 solubilized 화이트 펠 릿과 하지 녹색 펠 릿 (그림 1A)에서 발견 되었습니다. 원유 준비의 샘플 전송 전자 현미경에 의해 조사 되었다 하 고 우리가 124-133 nm 길이 (그림 1B)를 측정 하는 bacilliform 입자를 관찰. 이것은 대부분 badnaviruses의 예측된 모달 길이 이내 이다. DNA는 흰색과 녹색 알갱이에서 추출 하 고 별도로 resuspended. 그림 1C, 우리는 녹색에서 추출한 DNA의 5 µ L 로드 고 흰색 펠 렛 샘플 (녹색 부분에 대 한 DNA의 1.6 µ g)와 흰 부분을 위해 DNA의 3.1 µ g 0.8 %agarose 젤 전기 이동 법 ethidium 평범한 사람을 다음 DNA를 분석 얼룩. 녹색 부분 흰색 분수 높은 분자량 DNA, DNA (그림 1C) 낮은 분자량의 두 밴드를 생산 하는 반면 낮은 분자량 DNA를 포함. 그림 1C 에 젤 100 V에서 40 분 동안 실행 하 고 레인 3에 얼룩 젤 전압 명확 하 게 밴드를 생산 하기 위해 인하 해야 제안 합니다. 이러한 데이터 제안 화이트 펠 릿 virions에 대 한 풍부한 했다. 흰색 샘플에서 추출 된 DNA (0.6 µ g/mL) 농도, 했지만 NGS, 10의 최소 필요에 대 한 적절 한 진행에 DNA의 ng. 조각난된 DNAs는 NGS에 대 한 라이브러리를 준비 하 사용 되었다.
동시에, RNA 높은 처리량 RNA-이 대 한 감염된 칸 나 식물 (그림 1D)에서 추출 된 표준 워크플로 라이브러리 준비, NGS, contigs, 만들고 확인 하는 바이러스 성 게놈 시퀀스 (그림 1E)를 위해 수행 되었다. 재료를 시작으로 DNA와 RNA를 사용 하 여 출력 결과 비교 했다.
우리는 원유 바이러스 준비에서 고립 된 DNA를 사용 하 여 188,626 원시 DNA 읽기를 NGS 여 얻었다. 읽기 13,269 contigs로 조립 및 BLASTn 뉴클레오티드 시퀀스의 NCBI 데이터 집합을 검색 하는 데 사용 되었다 (Viridplantae TaxID를 사용 하 여: 33090 및 바이러스 TaxID: 제한 기체로 10239) (그림 1E). NCBI BLASTn 결과 계시는 데 노 보 조립 contigs의 93% 셀룰러 시퀀스, 22%, 아니었다 고 0.3% 바이러스 contigs (그림 2A). Contigs 셀룰러 시퀀스도 미토 콘 드리 아 발견 했다로 분류 또는 엽록체 DNA의 대부분. 바이러스 contigs dataset에서 바이러스 contigs의 32% (되지 않은 Badnavirus 시퀀스) Caulimoviridae 의 회원 관련 있었다와 이들 중 58% 관련이 있었다 Badnavirus. 바이러스 contigs의 29% 매우 비슷한 (e < 1 x 10-30) CaYMV 격리 V17 ORF3 유전자 (EF189148.1), 사탕수수 bacilliform 바이러스 Batavia D, 완전 한 게놈 (FJ439817.1), 격리 되었고 바나나 행진 CA 바이러스 게놈 (완료 KJ013511)입니다. 이 인구 내에서 두 개의 전체 길이 genomes 닮은 긴 contigs가 있었습니다.
높은 처리량 RNA-seq 생산 153,488 청소 개별 시퀀스 읽기 읽기 < 500 bp. Contig 어셈블리의 길이 평균 8,243 contigs이 감소. 이러한 NCBI BLASTn에 제출 했다 (TaxID Viridplantae를 사용 하 여: 33090 및 바이러스 TaxID: 제한 기체로 10239) 출력 식물 세포 시퀀스, 23%의 범주에는 contigs의 76%를 배치 했다, 그리고 0.1% 바이러스 contigs (로 분류 했다 그림 2 B). 가까이 시험 바이러스 contigs 인구의 0.1%의 인구의 68% Caulimoviridae (그림 2B)에 할당 된 결정. 이 인구 내의 3 개의 큰 contigs 높은 유사성을 발견 했다 (10-30X e < 1) CaYMV 격리 V17 ORF3 유전자 (EF189148.1), 사탕수수 bacilliform 바이러스 분리 Batavia D, 완전 한 게놈 (FJ439817.1)와 바나나 행진 CA 바이러스 완전 한 게놈 (KJ013511). 우리가 수동으로 전체 길이 바이러스 게놈을 생산 하기 위해 이러한 두 합류 3 contigs 검사.
우리는 두 개의 전체 길이 바이러스 게놈의 존재를 확인 상호 발판으로 DNA와 RNA 시퀀싱 제작한 바이러스 게놈 길이 contigs 비교. 6,966의 1 개의 전체 길이 바이러스 게놈 bp 가칭 칸 나 노란색 반점 관련 바이러스 1 (CaYMAV-1) (그림 3A) 지명 되었다. 두 번째 게놈 이었다 7,385 bp와 CaYMV Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (그림 3A) 감염의 변종.
마지막으로, 각 바이러스의 복제 ~ 1000 bp 파편 설계 되었다 PCR 뇌관 차동 9 상업 종류를 나타내는 227 칸 나 식물의 인구에 있는 두 유전자를 감지 사용 되었다. 많은 경우에 개별 공장 두 바이러스에 감염 되었습니다. 12 식물에서 CaYMAV-1 및 CaYMV Ap01 RT-PCR 탐지의 예를 제공합니다. 3 다음 긍정적인 CaYMV Ap01 대해서만 되었고 9 두 바이러스 (그림 3B)에 대 한 긍정적인 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> 그림 1 : 바이러스 핵 산 준비 및 NGS 워크플로. (1.0%) (A) Agarose 젤 전기 이동 법 CaYMV 유전자의 565 bp PCR 파편의. 두 개의 PCR 제품 녹색 펠 렛 샘플 (3 차선)에 흰색 펠 릿 (차선 1, 2)에서 준비 하는 샘플만 발견 했다. 긍정적인 컨트롤 (+)은 감염 된 공장 표준 상자성 셀 입자를 포함 하는 자동화 된 방법을 사용 하 여 격리 된 DNA에서에서 증폭 PCR 제품을 나타냅니다. 레인 L 샘플 레인에 선형 DNA 밴드의 크기를 측정 하기 위한 표준으로 사용 하는 DNA 사다리를 포함 합니다. 감염 된 칸 나 잎의 원유 분류 되는 백색 펠 릿에 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 전망 하는 바이러스 입자의 (B) 예. (C) Agarose (0.8%) 녹색 (1 레인)에서 복구 된 DNA의 전기 영동 젤과 화이트 (2 레인) 패널 A. PCR에 의해 시험 된 긍정적인 그 펠 릿 레인 2 옆 빨간색과 노란색 점 두 높은 분자량 DNA 밴드 흰색 부분에서 발생 하는 식별 합니다. (D) Agarose (1%) 되는 RNA 정화 열 기반 총 RNA의 전기 이동 법 젤. 레인 L 샘플 레인에 선형 밴드의 크기를 측정 하기 위한 표준으로 사용 하는 DNA 사다리를 포함 합니다. 레인 1-6 ribo-고갈 및 핵 산 격리, 도서관 준비, 시퀀싱, contig 어셈블리 및 바이러스 게놈 RNA-이 (E) 도식 파이프라인에 대 한 단일 샘플에는 풀링된 했다 감염 된 칸 나 잎에서 분리 된 RNA를 포함 발견입니다. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> 그림 2 : 크로나 차트 시각화 contigs의 분류학 종류. (A) 풍요로 움과 contigs의 분류학 배포 원유 바이러스 준비에서 조립 왼쪽된 쇼에 차트. 오른쪽 차트 Caulimoviridae 가족, Badnavirus 속, 및 3 개의 밀접 한 관련이 종와 관련 된 바이러스 contigs의 비율을 보여 줍니다. (B) 왼쪽에 있는 패널 contigs RNA-seq에서 파생 된의 풍부한 그들의 분류학 분포에 따라 보여 줍니다. 오른쪽에 Caulimoviridae 가족, Badnavirus 속, 및 3 개의 밀접 한 관련이 종와 관련 된 바이러스 contigs의 인구 내의 contigs의 풍요를 묘사 하는 그래프입니다. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> 그림 3 . CaYMAV-1 및 CaYMV Ap01 유전자의 특성. (A) 도표 표현의 칸 나 노란색 반점 연결 바이러스 1 (CaYMAV) 및 칸 나 노란색 반점 바이러스 게놈에서 절연 비슷한 Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). 뉴클레오티드 위치 1-10 게놈의 시작으로 식별 되 고 tRNA만난 anticodon 사이트가 대부분 badnavirus 유전자의 전형. 열려있는 독서 프레임 (ORF) 1과 2의 번역에 대 한 중지 및 시작 위치는 인접 한. 이 단백질에는 알 수 없는 함수. ORF3 아연 손가락 (ZnF), 프로 테아 제 (프로), 역전사 (RT), RNAse H 도메인을 포함 하는 polyprotein입니다. 3' 많은 신호 순서는 두 바이러스 게놈에 대 한 보존입니다. (B) RT-PCR 분석 RNA 바이러스에 감염 된 잎 및 CaYMAV 및 CaYMV Ap01 검출 뇌관에서 격리를 사용 하 여 실시 되었다. 12 식물의 동일한 인구, 3 감염 되었습니다 CaYMV Ap01만, 반면 CaYMAV와 CaYMV Ap01 감염 된 나머지. (+) 나타냅니다 긍정적인 제어 (-) 부정적인 제어를 나타냅니다. 이 수치는 Wijayasekara 그 외 여러분 에서 재현/수정 24 동의입니다. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

이 방법은 새로운 질병의 출현과 같은 환경 바이러스학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 세포 성분으로부터 변이체를 정제하고, 해당 변이체들을 사용하여 시퀀싱을 위한 DNA를 추출하는 것입니다. 저는 온실의 식물들이 하나 이상의 미지의 Badnaviruses에 감염되었다는 것을 발견했을 때 처음으로 이 아이디어를 떠올렸습니다. 이 방법이 처음인 분들은 세 가지 이유로 어려움을 겪을 수 있습니다. 첫째, 균질화는 양질의 수율을 보장하기 위한 결정적인 단계입니다. 둘째, 차등 원심분리를 통해 여러 개의 펠릿이 생성될 수 있으며, 이러한 펠릿들을 식별하고 분리하는 방법을 알아야 합니다. 셋째, 바이오 분석기(bio-analyzer)의 결과 해석 또한 어려울 수 있습니다.본 절차의 모든 단계에서 실험복과 장갑을 착용해야 합니다. 먼저 -20 °C에서 냉동 보관했던 병든 식물에서 잎 80~100 g을 채취하십시오. 그다음 200 mL의 분쇄 완충액과 0.5% sodium sulfite를 사용하여 Waring 블렌더로 잎을 분쇄합니다. 균질화된 시료를 1 L 비커에 옮기십시오.적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태에서, 균질액에 urea 18 g과 10% 비이온성 세제 25 mL를 첨가하고 비커를 알루미늄 호일로 덮습니다. 마그네틱 교반기를 사용하여 하룻밤 동안 교반합니다. 다음 날, 균질액을 250 mL 원심분리 로터 병에 옮기고 고정각 로터를 사용하여 4 °C에서 4000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 회수하여 네 겹의 치즈 천으로 여과합니다. 회수된 액체 균질액의 부피를 측정한 다음, 균질액을 38.5 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 나누어 담습니다. 균질액을 4 °C에서 40,000 ×g로 2.5시간 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 튜브 바닥에 녹색 펠렛이 있는지, 그리고 튜브 길이를 따라 흰색 펠렛이 형성되었는지 확인합니다. 두 펠렛은 그대로 유지한 채 상층액을 따라내고 샘플을 얼음에 둡니다.흰색 펠렛과 녹색 펠렛을 분리하는 것은 전체 과정에서 가장 까다로운 단계 중 하나이며, 인내심과 숙련된 기술이 필요합니다.화학 흄 후드 내에서 고무 폴리스맨을 사용하여 펠렛을 분리합니다. 펠렛을 긁어 서로 다른 로터 병으로 옮깁니다. 흰색 펠렛이 담긴 로터 병을 얼음에 둡니다. 각 병에 1 mL의 물을 추가하고 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 1~2시간 동안 5분마다 혼합물을 피펫팅하여 펠렛을 다시 현탁시킵니다. 흰색 펠렛이 모두 재현탁되면, 해당 현탁액을 4 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다.다음 날, 4°C에서 6000 ×g로 10분 동안 현탁액을 원심분리하여 남은 부유물을 제거합니다. 농축된 현탁액을 새 튜브로 옮긴 후 4°C에서 136,000 ×g로 2시간 동안 원심분리하여 비리온을 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 1 mL의 완충액에 재현탁합니다.먼저 비리온을 파쇄하여 이 절차를 시작합니다. 펠렛 현탁액에 2 µg/µL proteinase K 용액 40 µL를 첨가하고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 각 시료에 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올을 1부피 첨가하고 20초 동안 손으로 흔들어 섞어줍니다.실온에서 16,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층의 수용액층을 제거하여 새 튜브로 옮깁니다. 이 추출 과정을 2회 이상 반복합니다.에탄올 침전법을 사용하여 DNA를 농축합니다. 0.3 M sodium acetate(pH 5.2)와 2.5 부피의 95% 에탄올을 사용하십시오. 시료를 -20 °C에서 30~60분 동안 보관합니다. 그 후, 13,000 ×g에서 10~20분 동안 원심분리하여 DNA 펠릿을 형성합니다.실험대에서 DNA 펠렛을 1 mL의 0.1 mM TE 완충액에 재현탁합니다. 원심분리를 통해 상용 겔 여과 컬럼으로 현탁액을 여과합니다. 에티듐 브로마이드 염색을 이용한 1% 아가로스 겔 전기영동으로 샘플을 분석하여, 본문에 기술된 대로 준비물의 상태를 확인하고 DNA의 품질을 평가합니다.투과전자현미경으로 관찰했을 때, 감염된 칸나 잎의 조분획으로 회수한 흰색 펠렛에서 바이러스 입자가 발견되었습니다. 녹색 및 흰색 펠렛에서 회수한 DNA에 대해 아가로스 겔 전기영동을 실시한 결과, 빨간색과 노란색 점으로 표시된 흰색 분획에서 두 개의 고분자량 DNA 밴드가 확인되었습니다.감염된 잎에서 분리한 RNA의 무결성은 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였습니다. 이 차트는 조립된 조립체(contig)의 풍부도와 조립된 바이러스 조제물로부터의 분류학적 분포를 보여줍니다. 그리고 이 차트는 Caulimoviridae 과, Badnavirus 속과 관련된 바이러스 조립체의 비율 및 밀접하게 연관된 3개 종과 관련된 조립체의 비율을 나타냅니다.다음 두 차트는 분류학적 분포에 따른 RNA 시퀀싱 유래 contig의 풍부도를 보여줍니다. 오른쪽 차트는 Caulimoviridae 과의 Badnavirus 속 및 밀접하게 관련된 세 가지 종과 연관된 바이러스 contig 집단 내의 contig 풍부도를 나타냅니다. DNA 및 RNA 시퀀싱으로 생성된 바이러스 게놈 길이의 contig를 상호 스캐폴드로 비교함으로써 두 개의 전체 길이 바이러스 게놈이 존재함을 확인하였습니다.마지막으로, 바이러스에 감염된 잎에서 추출한 RNA를 이용한 RT-PCR 분석을 통해 두 바이러스 게놈이 모두 검출되었습니다.이 기술에 숙련되면 이틀 정도 소요되나, 초보자의 경우 사흘이 걸릴 수 있습니다. 이 절차를 처음 수행할 때는 각 상층액 내 균질액의 부피를 기록하는 것이 중요하며, 이를 통해 절차 종료 후 최종 DNA 수율을 초기 시작 물질과 비교할 수 있습니다.이 방법이 발견된 이후, 식물 바이러스학 분야의 연구자들은 환경 내의 새로운 DNA 바이러스를 식별할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 식물 재료를 균질화하고 변이체를 농축하며, 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)에 사용할 수 있는 충분한 양의 DNA를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. urea와 phenol chloroform을 사용하는 작업은 매우 위험하므로, 이러한 화학 물질을 다룰 때는 항상 고글, 장갑, 실험복 및 마스크를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 안전한 초원심분리를 위해서는 튜브의 균형을 적절히 맞추는 것이 중요하므로, 튜브의 무게를 측정하여 로터의 서로 반대편에 배치해야 하며, 각 튜브의 무게 차이는 0.01 이내여야 합니다.

combining-analysis-dna-crude-virion-extraction-with-analysis-rna-from

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 1.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 2.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 파트 3 찬란 염료의 아미노 알릴 결합에 의해 두 호스트 및 바이러스 샘플에서 증폭된 RNA를 라벨링 과정을 설명합니다. 3 부 3.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3

우리는 감염된 세포로부터 고순도 herpesvirus nucleocapsid DNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응, 새로운 바이러스 recombinants 생산 transfections에 적합하고, 높은 집중력과 순결입니다.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

를 통해 식물 세포에 여러 바이러스 구성 요소의 배포를 동기화하는 간단하고 효율적이며 강력한...

간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서</em바이러스 조립 유학을위한> 접근법

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

여기에서는 일본뇌염 바이러스의 양성 가닥 게놈 RNA의 전체 길이 cDNA를 포함하는 감염성 박테리아 인공 염색체를 만들기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스의 기능적 cDNA를 구성하는 데 사용할 수 있어 바이러스 생물학 연구를 위한 강력한 게놈 도구입니다.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

우리는 아데노바이러스(Ad)에 감염된 인간 세포에서 바이러스 복제 구획(RC)을 분리하는 새로운 전략을 제공합니다. 이 접근법은 바이러스 게놈 복제 및 발현을 조절하는 분자 메커니즘과 RC에서 확립된 바이러스-숙주 상호 작용의 조절을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 무세포 시스템을 나타냅니다.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

이 프로토콜에는 vivo에서 바이러스 감염 초파리 melanogaster 나노 주입 방법 기본적인 기법을 사용 하 여 바이러스-호스트 상호 작용을 분석 하에 설정 하는 방법을 설명 합니다.

바이러스 성 감염 및 초파리 Melanogaster 상호 작용 호스트-바이러스의 분석의 설립

학습하세요 감염된 식물 잎에서 바이러스 입자를 분리하고 DNA를 추출하여 차세대 염기서열 분석을 수행하는 방법을. 차등 원심분리와 페놀-클로로포름 정제를 통해 고품질 바이러스 게놈을 확보할 수 있습니다.

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

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