Name: 고주파 자극에 의해 마우스가 뇌의 활성화에 대 한 침략 적 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 배우세요 마우스 해마에서 고주파 자극(HFS)을 이용한 신경 활성화 및 신경 발생 연구 방법을. c-fos와 BrdU 염색으로 분자 신호를 분석하여 뇌 질환 치료에 활용할 수 있는 인사이트를 제공합니다.

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(하이 타오 우), 중국과 그랜트 Z161100000216154에서의 기초 연구에 대 한 국가 주요 개발 프로그램에서 973 (2014CB542203) 프로그램 31522029, 31770929 및 31371149 (하이 타오 우) 중국의 국가 자연과학 기초에 의해 지원 되는 베이징 시 과학 및 기술 위원회 (하이 타오 우). 저자는 그들의 격려와 토론에 대 한이 타오 우 연구소의 모든 구성원을 감사합니다. 저자는 그의 도움 장치 디버깅에 대 한 Zhenwei 류를 매우 감사.

동물 실험 절차는 베이징의 기본적인 의료 과학 연구소 (베이징, 중국) 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 중국 정부 규정의 기관 지침에 따 랐 다. 쥐 (성인 남성, 26 ~ 30 g) 지 내게 되었고 12 h 빛/12-h 어두운 주기 (오전 7 시에 조명) 아래 물과 음식 광고 libitum, 23 ° C의 일정 한 온도에서 보관. 모든 실험 절차는 가벼운 주기 동안 수행 했다.
1. 수술 준비
참고: 사용자 지정 전극은 Halpern의 보고서23에서 수정 하는 방법을 사용 하 여 만든.
<ol><li>2 구리 마이크로-전선 (200 µ m의 외부 직경)를 사용 하 여 병렬 양극 전극으로. 자극에 대 한 원통형 전극 형성에 서로 주위 전극 랩. 참고: 여기, PP 또는 DG 내 전극 길이 핵의 해부학 적 깊이 따라 다양 했다.</li>
	<li>에틸렌 산화물 소독 캐비닛을 사용 하 여 전극 소독. 처리 하 고 제 2 채널 마이크로 와이어 전극 어떤 오염 없이 저장 합니다. 전극 엄격 하 게 어떤 수술 주입 하기 전에 살 균 되어야 한다.</li>
	<li>압력솥 수술 도구.</li>
	<li>수술 하기 전에 주사 마우스 pentobarbital (20-50 mg/kg)와 intraperitoneally, 마 취의 수술 비행기를 달성 하기 위해.</li>
	<li>살 균 페니실린 G procaine 정지 (75000 U, 인스턴트 메신저)와 각각24통증과 감염의 위험을 줄이는 진통 에이전트 (carprofen, 0.05-1 mg/kg, 사우스 캐롤라이나) 마우스를 주사.</li>
	<li>동물 마 취 후 눈 건조를 방지 하기 위해 두 눈을 눈 윤 활 유를 적용 합니다. 동물의 반사 응답 곤란 발가락 응답이 발생 하는 경우에 작업을 진행 하 여는 진정의 유도 및 마 취의 깊이 확인 합니다. 참고: 수 의사 연 고 눈 건조를 방지 하기 위해 또 다른 옵션입니다.</li>
	<li>마우스 머리 위에 모피의 대부분 전기 머리 또는 면도날 면도, 면도 영역 70% 알코올과 betadine 솔루션의 세 가지 번갈아 스크럽을 소독 하 고는 betadine 피부에 건조 후 작업 진행.</li>
</ol>2. 고주파 자극 수술25,26
참고:이 단계에서 전극이 아니다 일방적으로 심은 지 DG 또는 중간 PP 영역, 에피소드 학습과 기억에 중요 한 역할을 해 마의 한 부분으로.
<ol><li>정위 적 프레임에 마 취 마우스를 놓습니다. 마우스의 머리를 움직이기 힘 드는 유지 하 귀 바 제대로 정렬 하 고 신속 하 게 그들을 설치 합니다. 중심으로 머리를 지원 하 고 약간 마우스를 보안 부드럽게 귀 바 조입니다.</li>
	<li>37 ±에 동물의 체온을 유지 하기 위해 온도 조절 패드를 사용 하 여 0.5 ° c.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 마우스 귀 앞쪽 피부를 파악 하 여 마우스의 두개골의 정상 피부 1 c m2 지역에 대 한 제거 하는 소독가 위로 잘라. 참고: 적은 양의 출혈 컷된 피부의 가장자리를 따라 관찰 될 수 있었다.</li>
	<li>근육 및 두개골 표면 노출 면봉으로 두개골을 overlying 다른 첨부 파일을 제거 합니다. 모든과, 힘 줄 및 두개골의 완전히는 화살을 식별 하는 표면 및 람다 봉합 라인에서 결합 조직 청소는 면봉와 해를 사용 합니다.</li>
	<li>Bregma와 람다 포인트를 식별 합니다. 혀끝 봉합 교차는 calvaria의 우수한 중간 부분에 화살 봉합은 bregma이 있는 곳입니다. 화살 봉합에 의해 lambdoid 봉합의 교집합 람다는 표시입니다. 원래 지점으로는 bregma를 사용 하 여 다른 핵 위치를 설정.</li>
	<li>두개골에 bregma 람다 위치 식별 후 수평에이 두 지점을 조정 합니다. 이러한 두 지점의 높이 (모든 오류 < 0.05 m m 이어야 한다) 등 쪽 복 부 방향으로 거의 동일 다는 것을 확인 하십시오. 또한, 두개골 수준 같은 방법26의 중간 측면 방향에 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>일방적인 수술에 대 한 정위 적 수술 프레임에 만든 2-채널 구리 마이크로 와이어 전극 회전 전극 홀더에 탑재 합니다.</li>
	<li>처음에, bregma 지점 위에 수직으로 전극을 놓고 원래 사이트로 설정 합니다. 사용 디지털 표시를 나타내는 앞쪽-뒷부분 (AP), 중간 옆 (ML), 정위 적 수술 프레임을 dorso-복 부 (DV) 합니다. 참고: 전극 휘어 지 고 되지 않도록 만지지 마십시오 두개골에 전극 팁 작업 중.</li>
	<li>올바른 위치로 전극을 부드럽게 이동 하는 방법 (그림 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 DG와 AP-3.8/ML ± 3.0 PP, 각각) 어떤 터치 하지 않고 두개골 위에27 . 원하는 사이트 전극 삽입을 위해 확인 되었다 때 높은 dorsoventral 정위 적 조정을 사용 하 여 전극 홀더, 고 검은색 표시와 함께 위치를 표시 합니다. 참고: stereotaxic 좌표에 관하여 정확한 위치는 마우스 스트레인, 무게, 그리고 섹스에 의해 달라질 수 있습니다. 성인 생쥐 같은 섹스의 위치에 어떤 변화를 최소화 하기 위해 사용 되어야 한다. 가능 하면 개별 주제 기초27에 위치를 식별 하 작전 해 부 검사를 사용 해야 합니다.</li>
	<li>휴대용 micromanipulator 도움 드릴을 사용 하 여 (크기 규 석 = 0.5 m m) 정확 하 게 표시 된 위치에서 버는 구멍을. 드릴링 하기 전에 70% 에탄올과 버의 끝을 소독. Z 축 0.8-1.0 m m의 X-Y 위치를 변경 하지 않고 따라 두개골을 통해 미니 드릴 비트를 이동 합니다. 메 마른 목화를 사용 하 여 작업 하는 동안 어떤 출혈을 멈추게. 참고: 시추 하는 동안-드릴링과 과도 한 열 발생을 피하기 위해, 드릴링 속도 15000-18000 분당 회전 (RPM), 그리고 자주 드릴 비트 마다 8-10의 버 구멍에서 인출 확인 합니다.</li>
	<li>계속 두 라 노출까지 드릴링. 구부러진된 바늘을 사용 하 여 훈련 하는 동안 생성 되 고 기본 부드러운 뇌 조직 손상 없이 경질에는 작은 구멍을 만들어 모든 뼈 스크랩 제거. 참고: 뇌 조직 손상 되지 않도록, 구부러진된 무딘 바늘 수 또한 대체 잘 무뚝뚝한 겸 자.</li>
	<li>확인 하려면 그 버 구멍 만들어진 제대로 원하는 위치에 정위 적 수술 프레임의 조정에 의해 전극 높이 줄일 고 전극은 전파 장애물을 건드리지 않고의 버는 구멍을 통해 원활 하 게 삽입할 수 있습니다. 그렇다면, 천천히 삽입 전극 1.8 m m는 DG (또는 PP에 대 한 3.0 m m)의 깊이 (PP-DG) dg 중간 PP에 있는 두개골의 표면에서. 참고: 닦아 모든 중추 신 경계 또는 메 마른 목화와 함께 버 구멍에서 혈액 유출 전극 이식의 과정.</li>
	<li>삽입 후 두개골 구멍에 마이크로 와이어 전극 잡고 자리에 작은 주걱을 사용 하 여 적절 한 치과 시멘트로. 시멘트가 복잡로 삽입 된 전극과 좋은 부드러운 모자를 나사 주위 금형. Debride 하 고 상처 가장자리를 소독.</li>
	<li>전극 홀더에서 전극을 분리 합니다. 정위 적 프레임에서 마우스를 제거 하 고 따뜻한 케이지를 반환 합니다. 참고: 수술 후, 그들은 완전히 충분 한 의식으로 마 취에서 회복 될 때까지 그들의 감 금 소에는 동물을 반환을 기다립니다.</li>
	<li>마우스를 자유롭게 이동 하 고 감 금 소에 있는 2 일 동안 복구할 수 그것을 허용 하자. 그런 다음, 연결 하는 전극 이식 마우스에는 프로그래밍 가능한 자극을 통해 뇌 지도. 그림 2에 제시 된으로 소프트웨어 인터페이스를 설정 합니다. 400 Hz에서 6 펄스의 6 열차의 6 시리즈 HFS 매개 변수 설정 (그림 1B, 열차, 20 사이 100 ms 계열 간의 s)28. 200 µ a 자극 강도 설정 합니다.</li>
	<li>시간 설정으로 원하는 기간 동안 한 HFS를 제공 합니다. 자극 2 x 하루 오전 8 시와 오후 8 시에 제공</li>
	<li>컨트롤 그룹에 대 한 생쥐에 전극을 이식 하 고는 자극을 수행 하지 마십시오.</li>
	<li>C-fos 얼룩에 대 한 심하게 자극 실험 쥐 (2 x 하루). BrdU 라벨에 대 한 급성 자극 그룹으로 실험 쥐 분할 (일 당 2 배 적용) 및 만성 자극 그룹 (10 x 5 일에, 일 당 2 배 적용). 자극의 과정, 마우스 깨어 있는지 확인 합니다. 리드는 트위스트 하지 수 있도록 기억 하십시오. 참고: 프로시저의 마지막 날에 급성 자극 그룹에 마우스 했다 자극 동시에.</li>
	<li>자극을 할 때 신중 하 게 전극 홀더 및 녹화 시스템의 커넥터에서 전극 핀을 분리 합니다.</li>
</ol>3. 면역 형광 염색 및29 라벨 Bromodeoxyuridine
<ol><li>C-fos 와 Notch1 얼룩이, 마지막 HF DBS 자극 후 약 3 h pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) 마 취의 수술 비행기를 달성 하기 위해 주입 하 여 쥐를 anesthetize.</li>
	<li>BrdU 라벨에 대 한 마지막 HF DBS 자극 후 약 12 h 2-h 간격 (50 mg/kg 0.9% 식 염 수, I.P.) 컨트롤 및 자극된 쥐에 6 주사 BrdU의을 제공 합니다. 마지막 주입 후 36 h 외과 비행기를 달성 하기 위해 pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.)를 주입 하 여 쥐를 anesthetize.</li>
	<li>절 개 흉 곽 통해 메스를 사용 하 여 마음을 노출 한 다음 22 게이지 무딘 관류 바늘 왼쪽된 심 실에 전달 하 게. 오른쪽 아 트리 움에 작은 절 개를 확인 합니다. Transcardially 찬 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 뒤에 1 x PBS (pH 7.4)에 찬 4 %paraformaldehyde (PFA)의 50 mL 50 mL와 함께 그것을 perfuse. 참고: 전환 PBS는 PFA에는 마우스 피에서 vivo에서 교체 되 고 액체 실행 취소 됩니다. 좋은 관류 간 개간 하 여 재판 될 수 있다. 관류 고정 떨림을 관찰 되었습니다30일단 중지 되어야 합니다.</li>
	<li>안과 위 마우스를 목을 벨, 피부에 절 개를 확인 하 고 두개골을 노출. 집게를 사용 하 여 두개골에서 약간 칩 하 고 신중 하 게 전체 쥐의 뇌를 해 부. 포스트-ﬁx 4 %paraformaldehyde 추가 2 일에 뇌와 하룻밤 4 ° C에서 30% 자당 해결책에 그것을 전송.</li>
	<li>20 µ m 코로나 섹션으로 머리를 잘라 cryostat를 사용 하 여. 전송 및 브러시와 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 하 고-20 ° c.에서 그들을 저장합니다 참고: 전극 misplacements 또는 과도 한 기계적 손상 동물 이후 분석에서 제외 됩니다.</li>
	<li>일반 PBS (0.1 m M, pH 7.4)에 슬라이드를 전송 없음 정착 액을 포함 하. 씻어 각 어떤 초과 정착 액을 제거 하 5 분에 대 한 3-4 x PBS 가진 조각. BrdU 표시 그룹에 대 한 37 ° C에서 30 분 동안 2 N HCl에 섹션을 품 어 하 고 0.1 M borate 버퍼에 그들을 씻어 (pH 8.4; 10 분). 다음 씻어 슬라이스 2 x PBS에서 5 분. 참고: Immunostaining 다음 수행 합니다.</li>
	<li>보육 실 온 (RT)에서 1 시간에 대 한 솔루션 (1% 정상 염소 혈 청, 3% 소 혈 청 알 부 민 < BSA > 0.5% 트라이 톤 X-100 그리고 0.02% 나트륨 아 지 드 1 x PBS에서) 차단에 의해 분할 영역을 취급 합니다.</li>
	<li>안티-c-fos polyclonal 항 체 (1: 500, 토끼), 안티-Notch1 항 체 (1시 50분; 염소), 또는 안티-BrdU 항 체 (1:800; 쥐) 4 ° C에서 차단 솔루션에서 슬라이스를 밤새 품 어.</li>
	<li>씻어 3 조각에 PBS, x 다음 알 렉 사 Fluor 568 활용 반 토끼 (1: 500), 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 항 염소 (1:1, 000), 그들을 품 어 또는 실시간에 1 시간에 대 한 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 반대로 쥐 (1: 500) 이차 항 체</li>
	<li>워시 샘플 3 PBS (10 분 마다)에 x. DAPI를 포함 하는 안티-페이드 시 약 장착 매체를 사용 하 여 면역 표시 된 뇌 섹션 커버. 조각 건조 및 4 ° c.에 빛 으로부터 보호 저장 하자</li>
	<li>고해상도 멀티 채널 (순차적) confocal 현미경 검사와 뇌의 자극 및 unstimulated 측면에서 hippocampal 분야의 이미지를 취득 합니다. 제어 및 실험 그룹 사이 일관 되 게 이미지 매개 변수를 설정 합니다.</li>
	<li>모자이크 영상 연속 3 차원 (XYZ) 이미지 전동된 스테이지를 사용 하 여 인접 한 필드의 보기의 큰 합성 수 있도록 함께 그들을 꿰 매 적절 한 소프트웨어를 활용 하 고 확대 목표 (20 X 어 목표, 나 0.45)를 사용 하 여 수행 이미지입니다. 참고: 진정한 바느질과 향상 된 완벽 한 이미지에 대 한 옵션을 매끄럽게 타일링 기능 포함 됩니다. 합성 이미지는 신속 하 고 쉽게 준비 넓은 지역 이미지를 바느질 함수를 사용 하 여.</li>
	<li>C-fos 와 Notch1 얼룩, 맞춘된 이미지의 immunofluorescent 밀도21 의 긍정적인 핵 정량 분석을 수행 합니다. 임의로 rostral와 등, 복 부 hippocampal DG 오는 아구에 3 개의 영역을 선택 하 고 이미지 J 소프트웨어 (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31를 사용 하 여 눈 멀게 하는 이중 방식에서 immunofluorescent 밀도 측정.</li>
	<li>BrdU 라벨, 눈 멀게 하는 이중 방식에서 등 해 마는 bregma 상대적인-2.7 mm (-1.7 mm)을 통해 드릴링 지점 슬라이스를 분석 합니다.</li>
	<li>DG에 BrdU 양성 신경만을 계산 합니다. 2 셀 개수에과 립 세포의 직경 안에 누워 셀을 포함 합니다. 참고: 여기, 계산 수행 되었다 공기 목표 X 40을 사용 하 여. 임의로, 동물 당 3-5 섹션 계산 했다, 그리고 카운트 평균 DG19당 수단으로 표현 했다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 수 없다.

HF DBS 기술 널리 사용 되었습니다 강력한 도구로 1990 년대 이후 많은 신경 성 질환의 치료에 대 한. 지금까지, HF DBS의 랜드마크 일 많은 관심과 모두 클리닉 및 사회 과학에 관심을 끌고있다 진전, 파 킨 슨 병의 치료입니다. 특정 신경 및 정신 장애32,33에서 HF-DBS의 치료 응용 프로그램에 대 한 많은 그룹에 의해 지속적인 HF DBS 연구의 다양 한 유형이 있다. 이러한 연구의 일부는 현재 임상2,34의 다양 한 단계에 있습니다. HF DBS 상당한 혜택을 가져다 해야 합니다, 비록 자극도 되돌릴 수 있는 분위기와 생각, 등, 부정적인 변화 같은 뇌의 완벽 한 배치와 함께 발생할 수 있습니다 부작용과의 수정을 피할 수는 자극 설정입니다.
<p class="jove_conte...

HF DBS 18701이후 개발 된 두뇌에 전기 자극에 대 한 신경외과 기술 이다. 1980 년대 후반에, HFS 처음 파 킨 슨 병에 대 한 잠재적인 치료 적 개입으로 사용 하 고 다른 운동 장애2. 지난 몇 십년에서 HF-DBS 점점 더 널리 사용 되었습니다 현재 치료 되지 않은 뇌 질환의 치료에는 전통적인 치료 전략에 의해. 특히, 때문에 HFS 전극, 매우 효과적인 결과, 최소한의 부작용의 정확도 향상, 뇌 장애 HF DBS에 의해 처리 수 크게 증가 지난 수십 년간3,4, 5. 예를 들어 HF-DBS 승인 되었습니다 미국 식품의 약 청 (FDA)에 의해 파 킨 슨 병 (PD), Alzheimer 유형 치 매, 진전, 운동 장애2,6, 의 다른 종류의 치료에 대 한 7. PD 환자에서 dopaminergic 약물 감소 HF DBS8동안 최대 50%. 또한 운동 장애의 성공적인 치료, HF-DBS 또한 보여주었다 정신 질환 클리닉, 그리고 잘2,9, 로 인식 확대의 치료에는 강력한 효과 10 , 11. 환자12많은 약속을 제공 하는 다양 한 단계에서 다른 정신 장애의 치료에 대 한 HFS의 연구는 주목 해야 한다.
많은 학문은 초점 HFS 뇌13를 통해 로컬 및 원격 효과 설명 했다, 비록 효과의 신경 및 분자 메커니즘 애매2,14남아 있습니다. 일반적으로 클리닉, 치료 HF-DBS는 파 킨 슨 병 및 만성 통증, 등 많은 의견 설명 어떤 하나의 가능성 중 HF DBS 치료에 의해 생성 된 개선 발생의 치료에 대 한 장기적인 방식으로 적용 HFS 전류 조절 한다 신경 네트워크 활동을 아마 이식된 HFS 전극 주변 축 삭의 반복적인 도발은 여. 또는, HF-DBS 출력 뉴런 및 예상된 대상의 방전 율 변경 될 수 있습니다. 또한, HF-DBS 이어질 수 있습니다 장기 potentiation (LTP) 장기 불경기 (주식 회사), 등 장기 시 냅 스 변화는 증상 개선에 기여할 수 있습니다. 지금까지, 그것은 아직 불분명 HFS inﬂuences 휴대 규제 키 분자 이벤트 등을 처리 하는 여부 성체 비보로. 여러 줄 연구의 HFS 설치류에 임상 적용된 DBS15,16의 유사한 신경 응답을 모방 수 설명 했다. 이 연구에서 HF-DBS의 기본 셀룰러 메커니즘을 이해 하기 우리 먼저 설정는 vivo에서 HFS 방법론 쥐에서에 급성 (1 일) 또는 만성 (5 일) 방식으로. 둘째, 우리는 HF DBS 납품 후 신경 활동과 성체의 변경 확인 하려면 활성화 분석 방법론을 설정 합니다.
신경 줄기 세포에서 신경 생산 배아 개발 하는 동안 풍부한 이지만 성인 생활 내내 계속, hippocampal subgranular 영역은 신생 발생 하는 주요 지역 중 하나입니다. 성체의 과정은 많은 생리 적 및 병 적인 요인에 의해 영향을 받습니다. 경우에 따라 간 질 hippocampal 신생 극적으로 감소17,18이다. 또한, 단일 electroconvulsive 치료 크게가 이랑19신경 생산을 증가할 수 있었다. 이러한 관측 제안 electrophysiological 활동 성체와 hippocampal 신경에 시 냅 스가 소성의 규칙에 있는 중요 한 역할을 한다. 따라서, 더 신경 활동 및 신생에 HF DBS의 효과 보여, 우리가 처음 실시는 즉시 이른 유전자 (IEG) c-fos 단기 신경 활동에서 결과의 잘 알려진 마커는의 immunostaining 분석 결과 경험20. HFS 배달21,22후 신호 활성화를 모니터링 하 Notch1 신호 감지 됩니다. 또한, 우리 또한 감지 BrdU 다양 한 매너에 HF DBS 유도 후 분석을 라벨에 의해 신경 생산 BrdU 얼룩은 또한 gliogenesis에 대 한 마커 수 있지만.
현재 연구에서 두 HFS 방법론 직접 및 간접적으로 hippocampal DG의 활성화를 대상에 맞게 있습니다. 전극은 DG에 직접 이식 또는 DG 뉴런을 활성화 하는 계획을 보내는 중간 perforant 경로 (PP)로 이식. HF DBS 유도 대 한 프로그래밍 가능한 자극 기는 마우스 머리에 고정된 전극에 지속적인 자극을 통해 에 대 한 제공 됩니다. 신경 활성화와 신경 신생에 HFS의 효과 확인 하려면 immunofluorescent 얼룩이 지 고 hippocampal DG 지역에서 긍정적인 뉴런 BrdU 통합의 수에 의해 c-fos 와 Notch1의 식 감지 후 각각, HFS 치료입니다. 특히,는 DG에서 성체에 HF-DBS의 효과 비교는 급성 및 만성 자극 방식으로, 또는 직접 및 간접적인 자극 방법, 각각.

<table><tbody><tr><td>뇌 스테레오택시 기구</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>스테레오택틱 두개내 이식 마우스</td></tr><tr><td>자극기</td><td>A-M 시스템</td><td>모델 3800</td><td>MultiStim 8채널 프로그래밍 가능한 자극기</td></tr><tr><td>치과 드릴러</td><td>Saeshin Precision Co., Ltd</td><td>STRONG 90</td><td>드릴링 및 두개절개용&nbsp;</td></tr><tr><td>Burr</td><td>Meisinger</td><td>HM1 005#</td><td>드릴링 및 두근절개술용&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1550 디지타이저</td><td>분자 장치</td><td>AXON 1550</td><td>고해상도 데이터 수집</td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Cryotome FSE</td><td>표본의 얼어붙은 부분 절단</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV-1200</td><td>Japan, 20x 대물렌즈(NA 0.45)</td></tr> <tr><td>마우스 수술 도구</td> F.S.T.14084-08,11254-20,16109-14 <td></td><td></td><td>가위, 집게, 뼈 절단기, 홀더 등</td></tr><tr><td>펜토바르비탈 나트륨</td><td>R& D 체계</td><td>4579</td><td>20-50mg/kg i.p. 주입</td></tr><tr><td>페니실린 G&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td>75,000 U for i.m.</td></tr><tr><td>주입 Carprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1713</td><td>5-10mg/kg, s.c. 주입</td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드 (PFA)</td><td>Beijing Solarbio Sci-Tech Co.&nbsp;</td><td>P1110</td><td>조직 고정용 스타킹 솔루션</td></tr><tr><td>인산염 완충액(PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td>pH7.4, 500ml in 스타킹</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 화합물</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>수용성 글리콜 및 수지</td></tr><tr><td>제형 항 BrdU 항체</td><td>Abcam ab6326</td><td></td><td>희석:1/800</td></tr><tr><td>항 c-fos 항체</td><td>Abcam ab209794</td><td></td><td>희석: 1/500</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG (Alexa Fluor 568)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11036</td><td>희석 : 1/500</td></tr><tr><td>당나귀 안티 랫 IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-546-150</td><td>희석 : 1/500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>anti-Notch1 항체 (C-20)</td><td>를</td> <td>사용한 카운터 염색sc-6014</td><td>희석액:1/50</td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td>희석액:1/1000</td></tr></tbody></table>

고주파 자극에 의해 마우스가 뇌의 활성화에 대 한 침략 적 방법

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

전기-고주파 자극 (HFS), 이식된 전극 다양 한 두뇌 지역 타겟팅을 사용 하 여 다양 한 신경 및 정신 질환에 대 한 효과적인 치료로 입증 되었습니다. 또한 라는 깊은 뇌 자극 (DBS), 뇌의 깊은 지역에서 HFS 임상 시험에서 점점 더 중요 해지고 있다. 높은 주파수 (HF-DBS) DBS 수술의 분야에서 최근 진행 주요 우울증 장애 (MDD), 강 박 장애 (강 박 증)에 대 한 치료와 같은 다른 상황에이 침략 적인 기술 활용의 가능성을 확산 하기 시작 했다 그래서 .
이러한 확대 징후에도 불구 하 고 HF-DBS의 유익한 효과의 기본 메커니즘 수수께끼 남아 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 한 가지 방법은 사용 하는 이식된 전극 띄엄띄엄 HFS에 의해 뉴런의 분산된 모집단을 활성화 하는. 그것은 알려졌다 시상의 앞쪽 핵에서 HFS 내 화 간 질 클리닉에서의 치료를 위해 사용 될 수 있습니다. 기본 메커니즘 증가 신생 관련이 있을 수도 있습니다 하 고 신경 활동을 변경. 따라서, 우리는 HFS 치료 전후 생리 변경 마우스가 이랑 (DG)에서 성체 신경 활동의 탐지에 의해 탐험에 관심이 있습니다.
이 원고에서 우리가 직접 또는 간접적으로, 급성 또는 만성 방식 마우스에 DG의 활성화를 목표로 HFS에 대 한 방법론을 설명 합니다. 또한, c fos 와 얼룩 신경 활동을 모니터링 하 고 활성화 신호 immunofluorescent Notch1 및 bromodeoxyuridine (BrdU) 결정을 라벨에 대 한 뇌 조각의 준비를 위한 상세한 프로토콜 설명 합니다 HF DBS 유도 후의 신경 신생 HF DBS 치료 후 신경 활동과 성체의 활성화 직접 neurobiological 증거 및 잠재적인 치료 혜택을 제공합니다. 특히,이 방법론 수정 하 고 기초 중추 등 다른 관심된 뇌 영역 및 시상 지역 병원에서 특정 뇌 질환에 대 한 대상에 적용 될 수 있습니다.

Hippocampal DG 하위 직접 또는 PP 하위는 DG를 직접 활성화 하기 위해 HF DBS 자극 통해 삽입 전극을 사용 하 여 정위 적 조정, 설치류 pentobarbital로 취 했다 고 3 h 샘플링 후 c-fos 와 Notch1 immunostaining에 대 한 마지막 HF DBS 자극. BrdU 얼룩, 1 일 또는 HF DBS 자극의 5 일 후 마지막 BrdU 주입 후 36 h에 대 한 설치류 뇌 섹션의 준비에 대 한 pentobarbital로 취 했다. 그림 3 c-fos 의 표정을 DG의 동측 측에서 크게 증가 했다 보여줍니다. 또한,는 DG의 contralateral 측에 c fos 식 또한 upregulated 보였다 c fos 신호의 식이 거의 없는 노-HF-DBS 자극 컨트롤에 비해 했다. Notch1 전용 im...

이 프로토콜에는 생쥐에서 신뢰할 수 있는 HFS 메서드를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. Hippocampal가 뇌 전체 신경 전기 HFS 직접 및 간접적으로 비보에 의해 자극 된다. 신경 활동 및 분자 신호 검사 c-fos 와 Notch1 immunofluorescent 얼룩, 각각; 성체는 bromodeoxyuridine 분석 결과 라벨에 의해 정량 이다.

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

이 실험의 전반적인 목표는 신경 발생의 신경 활동에 대한 고주파 자극의 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 뉴런 활동의 유도 및 해마의 신경 발생과 같은 고주파 뇌 심부 자극의 정렬된 세포 및 분자 메커니즘에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 고주파 TBS가 성인 뇌의 뉴런 활동과 신경 발생에 미치는 강력한 효과를 입증한다는 것입니다.이 방법은 고주파 TBS가 쥐 치상회에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 임상에서 뇌 장애를 위한 기저핵 및 시상하 영역과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 마우스를 정위 프레임에 놓습니다. 이어밴드를 머리에 맞추고 중앙에 있는 머리를 지지하도록 부드럽게 조입니다.귀 앞쪽의 피부를 잡고 두개골 위로 약 1제곱센티미터 정도 제거합니다. 그런 다음 면봉으로 두개골 위에 있는 근육 및 기타 부착물을 제거하여 두개골 표면을 노출시킵니다. 다음으로, 과산화수소 용액을 바르고 두개골을 건조시켜 시상선과 람다 봉합선을 확인합니다.그런 다음 브레그마와 람다를 식별합니다. 브레그마 포인트는 핵 위치를 설정하기 위한 원래 포인트로 사용됩니다. 그런 다음 이 두 점을 사용하여 수평면에서 두개골의 수평을 맞춥니다.이 두 점의 높이가 등쪽 복부 평면에서 거의 같은지 확인하십시오. 또한 두개골이 내측 측방에서 수평을 이루고 있는지 확인하십시오. 다음으로, 집에서 만든 2채널 구리 마이크로 와이어 전극을 정위 수술 프레임의 회전 전극 홀더에 장착합니다.전극을 브레그마 바로 위에 놓고 원래 위치로 설정합니다. 그런 다음 전극을 건드리지 않고 두개골 위의 올바른 위치로 부드럽게 움직입니다. 정위 수술 프레임의 디지털 디스플레이를 사용하여 전방 후방, 내측 측면 및 배복부 위치를 표시합니다.전극 삽입에 대해 원하는 위치가 확인되면 검은색 마커로 위치를 표시합니다. 그런 다음 배복부 정위 조정을 사용하여 전극 홀더를 올립니다. 그런 다음 드릴 비트를 70% 에탄올로 살균합니다.휴대용 마이크로 매니퓰레이터 보조 드릴을 사용하여 표시된 위치에 정확하게 버 구멍을 만듭니다. 멸균 면봉을 사용하여 수술 중 출혈을 멈추십시오. 듀라가 노출될 때까지 드릴링을 계속하십시오.구부러진 바늘을 사용하여 드릴링 중에 생성된 뼈 조각을 제거하고 아래에 있는 부드러운 뇌 조직을 손상시키지 않고 경막에 핀홀을 만듭니다. 버 구멍이 원하는 위치에 제대로 만들어졌는지 확인하려면 전극을 내려 장애물을 건드리지 않고 버 구멍을 통해 부드럽게 삽입되는지 확인하십시오. 저항이 감지되지 않으면 두개골 표면에서 목표 깊이까지 전극을 천천히 삽입합니다.그런 다음 작은 주걱을 사용하여 치과용 시멘트를 바르고 전극을 제자리에 고정합니다. 시멘트가 두꺼워지면 삽입된 전극과 다른 뼈 나사 주위에 시멘트를 성형하여 멋지고 부드러운 캡을 만듭니다. 그런 다음 전극 홀더에서 전극을 분리합니다.정위 프레임에서 마우스를 제거하고 따뜻한 케이지에 다시 넣습니다. 쥐가 자유롭게 움직이고 케이지에서 이틀 동안 회복되도록 합니다. 자극을 전달하려면 리드를 통해 이식된 전극을 프로그래밍 가능한 자극기에 연결하십시오.소프트웨어 인터페이스를 설정합니다. 그런 다음 HFS 파라미터를 400Hz에서 6개의 펄스로 구성된 6개의 트레인으로 구성된 6개의 시리즈와 200밀리암페어의 자극 강도로 설정합니다. 설정된 대로 원하는 기간 동안 HFS를 제공합니다.대조군의 경우, 어떠한 자극도 주지 않고 마우스에 전극을 이식합니다. CFAS 염색의 경우 실험용 마우스를 하루 동안 두 번 자극합니다. BrdU 라벨링의 경우, 급성 자극 그룹과 만성 자극 그룹 모두에 적절한 자극을 적용합니다.자극이 진행되는 동안 마우스가 깨어 있는지 확인하십시오. 리드가 꼬이지 않도록 하는 것을 잊지 마십시오. 자극이 완료되면 기록 시스템 커넥터의 전극 홀더에서 전극 핀을 조심스럽게 분리합니다.CFAS 및 노치 원 염색의 경우, 마지막 HFDBS 후 약 3시간 후에 펜토바르비탈을 주입하여 마우스에 마취하여 수술 마취 평면을 달성합니다. BrdU 라벨링의 경우, 마지막 HFDBS 자극 후 약 12시간 후에 대조군과 자극된 마우스에 2시간 간격으로 BrdU를 6회 주사합니다. 마지막 주사 후 36 시간, 펜토 바르비탈로 쥐를 깊이 마취하고 차가운 PBS 50 밀리리터에 이어 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 50 밀리리터로 경심 투여합니다.머리를 제거하고 피부를 절개하여 기술을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 두개골을 약간 깎아내고 조심스럽게 뇌 전체를 제거합니다. 그런 다음 뇌를 수정 후 추가로 이틀 동안 4%의 파라포름알데히드를 투여하고 하룻밤 동안 섭씨 4도의 30% 자당 용액으로 옮깁니다.저온 유지 장치를 사용하여 뇌를 20미크론의 관상 절편으로 자릅니다. 브러시를 사용하여 섹션을 유리 슬라이드로 옮기고 장착하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 그런 다음 슬라이드를 고정제가 포함되지 않은 일반 PBS로 옮깁니다.PBS로 섹션을 5분씩 3-4회 세척하여 과도한 고정액을 제거합니다. BrdU 표지 그룹의 경우, 섭씨 37도에서 30분 동안 2개의 어금니 HCL로 절편을 배양하고 0.1 몰 붕산염 완충액으로 헹굽니다. 10분 후 PBS에서 5분씩 두 번 세척합니다.그 후, 실온에서 1 시간 동안 차단 용액에 절편을 배양합니다. 그런 다음 항 CFAS 다클론 항체, 항 노치 원 항체 또는 항 BrdU 항체를 하룻밤 동안 섭씨 4도의 차단 용액에 담아 절편을 배양합니다. PBS에서 매번 10분씩 3회 절편을 배양한 후, Alexa Fluor 568 conjugated anti-rabid, Alexa Fluor 488 conjugated anti-goat 또는 Alexa Fluor 488 conjugated anti-rat secondary antibody로 실온에서 1시간 동안 배양하였다.PBS에서 매번 10분 동안 섹션을 세 번 나눴습니다. 그런 다음 DAPI를 함유한 퇴색 방지 시약 장착 배지를 사용하여 면역 표지된 뇌 단면을 덮습니다. 섹션을 자연 건조시키고 섭씨 4도의 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.여기에 표시된 것은 DG에서 BrdU 표지된 증식 뉴런 생성에서 HFS 치료에 대한 실험 패러다임입니다. 동물들은 서로 다른 패턴의 자극을 받기 위해 급성 그룹과 만성 그룹으로 나뉘었습니다. 그 후, 두 그룹의 동물에게 6일째에 BrdU를 주사했습니다. 여덟 번째 날에, 동물들은 마취되고 저온 유지 장치 절편을 준비하기 위해 주입되었습니다.다음은 DG에서 HFDBS 후 BrdU 면역형광 염색 이미지입니다. 뉴런 생성에 대한 정량적 분석은 DG의 급성 자극이 신경 발생을 향상시킬 수 없다는 것을 나타냈습니다. DG의 만성 자극은 신경 발생을 크게 조절했습니다. 대조군과 비교했을 때, BrdU 표지 세포의 수는 동측 및 반대측 반구 모두에서 만성 그룹에서 크게 증가했습니다.다음은 PP 하위 영역에서 HFDBS 후 BrdU 면역형광 염색 이미지의 이미지입니다. 신경 세포 생산에 대한 정량적 분석은 PP의 급성 또는 만성 자극이 신경 발생을 크게 향상시킬 수 없음을 나타냈습니다. BrdU 라벨링 세포의 수는 HFS 처리 유무에 관계없이 비교적 안정적이었습니다.이 절차를 시도하는 동안 전극을 올바르게 배치하고 자극을 성공적으로 전달하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후,이 기술은 모델에 등록 된 신경 과학 고주파 자극 분야의 연구자들을위한 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 뇌심부 핵에 고주파 자극을 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Selvakumar, T., et al., 전시상핵의 심부 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석. J. vis. 경험. (2015년)이 비디오는 쥐의 뇌에 전극을 이식하여 신경 활동을 조절하고 해마와의 의사소통을 강화하여 신경 생존 및 신경 발생을 지원하는 심부 뇌 자극(DBS)을 적용하는 절차를 보여줍니다.

쥐 모델에서 해마 신경 활동에 대한 심부 뇌 자극의 효과

출처: Zhao, Z. et al. 고주파 자극에 의한 마우스 치상 회류의 활성화를 위한 침습적 방법. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 마우스 해마 치상회에 고주파 심부 뇌 자극을 전달하는 프로토콜을 보여주며 신경 활성화, 시냅스 가소성 및 신경 발생에 미치는 영향을 자세히 설명합니다.

마우스 치상 회랑의 신경 활성화 및 신경 발생을 강화하기 위한 고주파 자극

이 비디오는 GABAergic 내측 중격 뉴런에 빛에 민감한 이온 채널이 있는 유전자 조작 마우스 모델에서 세타 진동을 조절하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 광 펄스를 해마에 전달함으로써 뉴런 활동을 동기화하고 국소 자기장 전위로 기록되는 세타 진동을 생성하는 것을 목표로 합니다.

마우스 모델에서 Theta Oscillations의 선택적 조작

이 비디오는 청각 자극을 처리하는 마우스 뇌의 특정 영역에서 신경 세포 활동에 대한 연구를 보여줍니다. 이 기술은 억제성 신경 전달 차단제를 적용하고 약물이 국소 뇌 영역에 적용되기 전과 후의 청각 자극에 대한 신경 반응을 비교하는 것을 포함합니다.

억제성 신경전달물질 차단제가 있는 상태에서 깨어 있는 쥐의 청각 신경 반응 조사

이 비디오는 마우스 모델의 해마에 와이어 전극 어레이와 광섬유를 정위 이식하는 방법을 보여줍니다.

전극 배열과 광섬유를 마우스 해마에 이식

신경 질환의 유전자 변형과 녹아웃 마우스 모델은 정상 및 비정상 신경 생리학에있는 유전자의 역할을 공부하는 데 유용합니다. 이 문서는 장기 상승 작용, 유전자 변형에, 학습과 기억의 기초 및 신경 병리학의 마우스 모델을 행동 자유롭게 녹아웃 수있는 세포 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

자유롭게 마우스를 동작에 문제가있는 Perforant 통로 - 치아 이랑 (dentate gyrus) 시냅스의 장기 강화 작용

연구에 따르면 음극 경두개 직류 자극은 약물 내성 발작을 억제하는 효과를 낼 수 있습니다. 본 연구에서는 생쥐의 뇌 절편 제제에서 직류 자극 및 발작과 같은 활동의 다전극 어레이 기록을 평가하는 시험관 실험 설정을 고안했습니다. 직류 자극 매개변수를 평가했습니다.

마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록

이 프로토콜 로컬 필드 전위 선형 실리콘 프로브 멀티 생크와의 녹음을 설명 합니다. 현재 소스 밀도 분석을 사용 하 여 신호 변환 마우스 해 마에 지역 전기 활동의 개조를 허용 한다. 이 기술을 공간적으로 제한 된 뇌 진동 자유롭게 마우스를 이동에 공부 될 수 있다.

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

여기에서 우리는 마우스에 있는 화학유전학을 사용하여 만성적으로 신경 활동을 통제하는 2개의 비침범성 방법을 기술합니다. 점안액은 클로자핀-N-산화물(CNO)을 매일 전달하는 데 사용되었습니다. 우리는 또한 식수에서 CNO의 장기간 투여를위한 두 가지 방법을 설명합니다. 만성 신경 조절을 위한 이러한 전략은 동물의 스트레스를 줄이는 최소한의 개입이 필요합니다.

공포 대조 신경 활동의 만성 조작을 위한 비침범성 전략

이 보고서는 형질전환 VGAT-Cre 마우스의 전기적 점화를 기반으로 측두엽 간질 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 점화된 VGAT-Cre 마우스는 간질의 원인을 파악하고 새로운 치료법을 스크리닝하는 데 유용할 수 있습니다.

측두엽 간질에 대한 모델을 생성하기 위해 전기적으로 점화되는 VGAT-Cre 마우스를 위한 전극의 준비 및 이식

밀리미터 크기의 코일과 결합된 저비용 뇌파 기록 시스템은 생체 내에서 마우스 뇌의 경두개 자기 자극을 유도하기 위해 제안되었습니다. 맞춤형의 유연한 다중 전극 어레이 기판이 있는 기존의 나사 전극을 사용하여 경두개 자기 자극에 대한 반응으로 마우스 뇌에서 다중 부위 기록을 수행할 수 있습니다.

생체 내에서 마우스 뇌를 경두개로 자극하기 위해 밀리미터 크기의 코일과 결합된 저비용 뇌파 기록 시스템

배우세요 마우스 해마에서 고주파 자극(HFS)을 이용한 신경 활성화 및 신경 발생 연구 방법을. c-fos와 BrdU 염색으로 분자 신호를 분석하여 뇌 질환 치료에 활용할 수 있는 인사이트를 제공합니다.

고주파 자극에 의해 마우스가 뇌의 활성화에 대 한 침략 적 방법

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