고주파 자극에 의해 마우스가 뇌의 활성화에 대 한 침략 적 방법

이 실험의 전반적인 목표는 신경 발생의 신경 활동에 대한 고주파 자극의 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 뉴런 활동의 유도 및 해마의 신경 발생과 같은 고주파 뇌 심부 자극의 정렬된 세포 및 분자 메커니즘에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 고주파 TBS가 성인 뇌의 뉴런 활동과 신경 발생에 미치는 강력한 효과를 입증한다는 것입니다.

이 방법은 고주파 TBS가 쥐 치상회에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 임상에서 뇌 장애를 위한 기저핵 및 시상하 영역과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 마우스를 정위 프레임에 놓습니다. 이어밴드를 머리에 맞추고 중앙에 있는 머리를 지지하도록 부드럽게 조입니다.

귀 앞쪽의 피부를 잡고 두개골 위로 약 1제곱센티미터 정도 제거합니다. 그런 다음 면봉으로 두개골 위에 있는 근육 및 기타 부착물을 제거하여 두개골 표면을 노출시킵니다. 다음으로, 과산화수소 용액을 바르고 두개골을 건조시켜 시상선과 람다 봉합선을 확인합니다.

그런 다음 브레그마와 람다를 식별합니다. 브레그마 포인트는 핵 위치를 설정하기 위한 원래 포인트로 사용됩니다. 그런 다음 이 두 점을 사용하여 수평면에서 두개골의 수평을 맞춥니다.

이 두 점의 높이가 등쪽 복부 평면에서 거의 같은지 확인하십시오. 또한 두개골이 내측 측방에서 수평을 이루고 있는지 확인하십시오. 다음으로, 집에서 만든 2채널 구리 마이크로 와이어 전극을 정위 수술 프레임의 회전 전극 홀더에 장착합니다.

전극을 브레그마 바로 위에 놓고 원래 위치로 설정합니다. 그런 다음 전극을 건드리지 않고 두개골 위의 올바른 위치로 부드럽게 움직입니다. 정위 수술 프레임의 디지털 디스플레이를 사용하여 전방 후방, 내측 측면 및 배복부 위치를 표시합니다.

전극 삽입에 대해 원하는 위치가 확인되면 검은색 마커로 위치를 표시합니다. 그런 다음 배복부 정위 조정을 사용하여 전극 홀더를 올립니다. 그런 다음 드릴 비트를 70% 에탄올로 살균합니다.

휴대용 마이크로 매니퓰레이터 보조 드릴을 사용하여 표시된 위치에 정확하게 버 구멍을 만듭니다. 멸균 면봉을 사용하여 수술 중 출혈을 멈추십시오. 듀라가 노출될 때까지 드릴링을 계속하십시오.

구부러진 바늘을 사용하여 드릴링 중에 생성된 뼈 조각을 제거하고 아래에 있는 부드러운 뇌 조직을 손상시키지 않고 경막에 핀홀을 만듭니다. 버 구멍이 원하는 위치에 제대로 만들어졌는지 확인하려면 전극을 내려 장애물을 건드리지 않고 버 구멍을 통해 부드럽게 삽입되는지 확인하십시오. 저항이 감지되지 않으면 두개골 표면에서 목표 깊이까지 전극을 천천히 삽입합니다.

그런 다음 작은 주걱을 사용하여 치과용 시멘트를 바르고 전극을 제자리에 고정합니다. 시멘트가 두꺼워지면 삽입된 전극과 다른 뼈 나사 주위에 시멘트를 성형하여 멋지고 부드러운 캡을 만듭니다. 그런 다음 전극 홀더에서 전극을 분리합니다.

정위 프레임에서 마우스를 제거하고 따뜻한 케이지에 다시 넣습니다. 쥐가 자유롭게 움직이고 케이지에서 이틀 동안 회복되도록 합니다. 자극을 전달하려면 리드를 통해 이식된 전극을 프로그래밍 가능한 자극기에 연결하십시오.

소프트웨어 인터페이스를 설정합니다. 그런 다음 HFS 파라미터를 400Hz에서 6개의 펄스로 구성된 6개의 트레인으로 구성된 6개의 시리즈와 200밀리암페어의 자극 강도로 설정합니다. 설정된 대로 원하는 기간 동안 HFS를 제공합니다.

대조군의 경우, 어떠한 자극도 주지 않고 마우스에 전극을 이식합니다. CFAS 염색의 경우 실험용 마우스를 하루 동안 두 번 자극합니다. BrdU 라벨링의 경우, 급성 자극 그룹과 만성 자극 그룹 모두에 적절한 자극을 적용합니다.

자극이 진행되는 동안 마우스가 깨어 있는지 확인하십시오. 리드가 꼬이지 않도록 하는 것을 잊지 마십시오. 자극이 완료되면 기록 시스템 커넥터의 전극 홀더에서 전극 핀을 조심스럽게 분리합니다.

CFAS 및 노치 원 염색의 경우, 마지막 HFDBS 후 약 3시간 후에 펜토바르비탈을 주입하여 마우스에 마취하여 수술 마취 평면을 달성합니다. BrdU 라벨링의 경우, 마지막 HFDBS 자극 후 약 12시간 후에 대조군과 자극된 마우스에 2시간 간격으로 BrdU를 6회 주사합니다. 마지막 주사 후 36 시간, 펜토 바르비탈로 쥐를 깊이 마취하고 차가운 PBS 50 밀리리터에 이어 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 50 밀리

머리를 제거하고 피부를 절개하여 기술을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 두개골을 약간 깎아내고 조심스럽게 뇌 전체를 제거합니다. 그런 다음 뇌를 수정 후 추가로 이틀 동안 4%의 파라포름알데히드를 투여하고 하룻밤 동안 섭씨 4도의 30% 자당 용액으로 옮깁니다.

저온 유지 장치를 사용하여 뇌를 20미크론의 관상 절편으로 자릅니다. 브러시를 사용하여 섹션을 유리 슬라이드로 옮기고 장착하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 그런 다음 슬라이드를 고정제가 포함되지 않은 일반 PBS로 옮깁니다.

PBS로 섹션을 5분씩 3-4회 세척하여 과도한 고정액을 제거합니다. BrdU 표지 그룹의 경우, 섭씨 37도에서 30분 동안 2개의 어금니 HCL로 절편을 배양하고 0.1 몰 붕산염 완충액으로 헹굽니다. 10분 후 PBS에서 5분씩 두 번 세척합니다.

그 후, 실온에서 1 시간 동안 차단 용액에 절편을 배양합니다. 그런 다음 항 CFAS 다클론 항체, 항 노치 원 항체 또는 항 BrdU 항체를 하룻밤 동안 섭씨 4도의 차단 용액에 담아 절편을 배양합니다. PBS에서 매번 10분씩 3회 절편을 배양한 후, Alexa Fluor 568 conjugated anti-rabid, Alexa Fluor 488 conjugated anti-goat 또는 Alexa Fluor 488 conjugated anti-rat secondary antibody로 실온에서 1시간 동안 배양하였다.

PBS에서 매번 10분 동안 섹션을 세 번 나눴습니다. 그런 다음 DAPI를 함유한 퇴색 방지 시약 장착 배지를 사용하여 면역 표지된 뇌 단면을 덮습니다. 섹션을 자연 건조시키고 섭씨 4도의 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.

여기에 표시된 것은 DG에서 BrdU 표지된 증식 뉴런 생성에서 HFS 치료에 대한 실험 패러다임입니다. 동물들은 서로 다른 패턴의 자극을 받기 위해 급성 그룹과 만성 그룹으로 나뉘었습니다. 그 후, 두 그룹의 동물에게 6일째에 BrdU를 주사했습니다. 여덟 번째 날에, 동물들은 마취되고 저온 유지 장치 절편을 준비하기 위해 주입되었습니다.

다음은 DG에서 HFDBS 후 BrdU 면역형광 염색 이미지입니다. 뉴런 생성에 대한 정량적 분석은 DG의 급성 자극이 신경 발생을 향상시킬 수 없다는 것을 나타냈습니다. DG의 만성 자극은 신경 발생을 크게 조절했습니다. 대조군과 비교했을 때, BrdU 표지 세포의 수는 동측 및 반대측 반구 모두에서 만성 그룹에서 크게 증가했습니다.

다음은 PP 하위 영역에서 HFDBS 후 BrdU 면역형광 염색 이미지의 이미지입니다. 신경 세포 생산에 대한 정량적 분석은 PP의 급성 또는 만성 자극이 신경 발생을 크게 향상시킬 수 없음을 나타냈습니다. BrdU 라벨링 세포의 수는 HFS 처리 유무에 관계없이 비교적 안정적이었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 전극을 올바르게 배치하고 자극을 성공적으로 전달하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후,이 기술은 모델에 등록 된 신경 과학 고주파 자극 분야의 연구자들을위한 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 뇌심부 핵에 고주파 자극을 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.