형광 라이브 셀 이미징의 완전 한 식물 세포의 주기 느린 성장 사회 박테리아 Myxococcus xanthus

이 방법은 세포가 DNA를 복제하는 방법, 성장하는 방법, 분열하는 방법과 같은 박테리아 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 살아있는 박테리아 세포를 현미경으로 최소 24시간 동안 모니터링할 수 있으며 이 기술에 특별한 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 이 방법은 Myxococcus xanthus의 성장과 분열에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 느리게 성장하는 다른 박테리아에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

먼저 항생제를 보충한 1%CTT 500마이크로리터에 단일 M.xanthus 콜로니를 멸균 튜브에 다시 현탁시키고 전체 현탁액을 5mL의 1%CTT가 들어 있는 50ml 삼각 플라스크로 옮깁니다. 아가로스 1g과 TPM 완충액 80ml, 1%CTT 배지 20ml를 혼합하여 0.2%CTT를 함유한 1% 아가로스 현미경 용액을 준비합니다. 아가로스가 녹을 때까지 용액을 전자레인지에 돌립니다.

페트리 접시에 약 60ml의 용융 아가로스를 채우고 실온으로 식힙니다. 사용하기 전에 아가로스 패드를 섭씨 32도에서 최소 15분 동안 예열하십시오. 다음으로, 중간에 구멍이 있는 플라스틱 또는 금속 프레임에 멸균 유리 커버슬립을 놓고 테이프를 사용하여 커버슬립을 프레임에 고정합니다.

10-20마이크로리터의 기하급수적으로 성장한 M.xanthus 세포를 커버슬립에 추가합니다. 형광 마이크로스피어를 세포의 기준 마커로 추가하려면 TPM 버퍼를 사용하여 마이크로스피어를 1:100으로 희석합니다. 비드 현탁액을 철저히 흔들고 세포에 5-10 마이크로리터를 첨가합니다.

미리 데워진 1% 아가로스 패드에서 커버 슬립 크기와 비슷한 크기의 작은 패드를 잘라내어 셀 위에 놓습니다. 그런 다음 패드 위에 커버 슬립을 놓아 증발을 방지하고 습한 환경에서 세포를 유지합니다. 현미경 샘플을 섭씨 32도에서 15-20분 동안 배양하여 타임랩스 현미경 기록 전에 세포가 아가로스 패드 바닥에 부착되도록 합니다.

타임랩스 현미경 검사를 수행하려면 현미경을 켜고 현미경 제어 소프트웨어를 시작하십시오. 올바른 objective와 올바른 mirrors 및 filter를 선택하여 위상차 이미지뿐만 아니라 녹색-형광, 적색-형광 또는 황색-형광 단백질의 이미지를 획득할 수 있습니다. 고품질 이멀젼 오일 한 방울을 대물렌즈의 렌즈와 샘플 바닥에 추가합니다.amp섭씨 32도에서 사전 배양.

구멍 쪽이 대물렌즈 쪽을 향하게 하여 샘플이 있는 금속 프레임을 현미경 스테이지에 놓고 샘플을 스테이지 홀더에 단단히 고정합니다. Z-방향으로 스테이지를 대물렌즈에 더 가깝게 이동하여 세포에 초점을 맞춥니다. 대물렌즈의 오일과 샘플이 접촉하면 스테이지를 X/Y 방향으로 이동합니다.

Metamorph 소프트웨어로 전환하고 Acquire 도구를 엽니다. 설정 드롭다운 목록에서 위상 대비를 선택하고 노출 시간을 100밀리초로 설정합니다. Show Live(라이브 표시)를 클릭하고, Grab Cell into Focal Plane(셀을 초점면으로 가져오기)을 클릭하고, 시야에 여러 개의 단일 셀이 표시될 때까지 X/Y 방향으로 스테이지를 이동합니다.

나중에 획득한 이미지를 정렬하기 위해 하나 이상의 형광 마이크로스피어가 시야 영역에 있는지 확인합니다. 다음으로, 현미경 제어 소프트웨어의 다차원 획득 마법사를 열어 현미경이 필요한 경우 여러 파장 및 스테이지 위치에서 이미지를 획득할 수 있도록 하는 타임 랩스 실험을 설정합니다. Main(메인) 탭에서 time-lapse(타임랩스)와 Multiple Wavelengths(다중 파장)를 활성화합니다.

창 왼쪽에 추가 탭이 나타납니다. 저장 탭을 클릭하고 디렉토리 선택을 클릭하여 컴퓨터 하드 드라이브에서 획득한 이미지를 저장할 빈 폴더를 선택한 다음 파일이 있는 경우 기본 이름 증가를 활성화하여 연속 데이터 세트가 이전 데이터 세트를 덮어쓰지 않도록 합니다. 날짜와 함께 실험 이름을 지정하고 실험의 균주 이름 또는 제목을 지정합니다.

타임랩스 탭을 클릭하여 타임랩스 매개변수를 조정한 다음 시간 간격을 20분으로 설정하고 지속 시간을 24시간으로 설정합니다. 시점 수는 자동으로 변경됩니다. 이제 Wavelengths(파장) 탭을 클릭합니다.

숫자를 변경하여 각 시점에서 각 이미지에 대해 획득할 파장 수를 선택합니다. 각 파장에 대해 별도의 하드웨어 기억 AF 위치 허용을 선택합니다. 상단에서 First Wavelength 탭을 클릭합니다.

Illumination 드롭다운 목록에서 Phase Contrast를 선택합니다. 노출에 대해 100밀리초를 선택하고 획득 드롭다운 목록에서 모든 시간 지점을 선택합니다. Never를 선택하여 드롭다운 목록에서 Auto Expos를 비활성화하고 Auto Focus에 대한 드롭다운 목록에서 Every Acquisition을 선택합니다.

다음 매개변수를 사용하여 설명한 대로 모든 파장에 대한 노출을 설정합니다. 그런 다음 여러 스테이지 위치에서 이미지를 획득하려면 Main(메인) 탭에서 Multiple Stage Positions(다중 스테이지 위치)를 활성화합니다. Stage 탭을 클릭하고 Live 버튼을 클릭하여 시야를 확인합니다.

ROI가 시야에 있을 때까지 스테이지를 X/Y 방향으로 이동합니다. X 및 Y 좌표를 더하기 기호를 클릭하여 스테이지 탭에 저장합니다. 새 ROI가 발견될 때까지 스테이지를 X/Y 방향으로 다시 이동하고 더하기 기호를 클릭하여 좌표를 다시 저장합니다.

원하는 수의 영역이 저장될 때까지 계속합니다. 저장된 다른 X 및 Y 위치를 클릭하여 셀에 초점이 맞춰져 있는지 한 번 더 확인하고 AFC 홀드를 클릭하여 하드웨어 자동 초점을 시작하여 실험이 진행되는 동안 저장된 Z 위치를 일정하게 유지합니다. Acquire를 클릭하여 현미경 제어 소프트웨어의 Multi-Dimensional Acquisition 마법사에서 타임랩스 기록을 시작합니다.

타임랩스 기록의 처음 몇 가지 시점 후에도 셀에 초점이 맞춰져 있는지 확인하여 이미지의 품질을 최대화하고 필요한 경우 다시 초점을 맞춥니다. 타임랩스 동영상을 생성하고 이미지 정렬을 수행하려면 이미지 분석 및 처리 소프트웨어를 시작합니다. Review Multi-Dimensional Data(다차원 데이터 검토), Select Base File(기본 파일 선택), Select Directory(디렉토리 선택)를 차례로 클릭하여 이미지를 스택으로 연 다음 다차원 데이터가 있는 폴더를 엽니다.

데이터셋을 확인하고 보기를 클릭합니다. 데이터 세트는 시점 1부터 끝까지 단일 이미지로 표시됩니다. 스택을 생성하기 위해 파장을 활성화한 다음 스택에 있어야 하는 모든 이미지를 선택하고 이미지 로드를 클릭합니다.

모든 파장에 대해 이 단계를 반복하고 완료된 스택을 저장합니다. 드리프트를 위해 수정해야 하는 이미지 스택을 활성화합니다. 앱, 자동 정렬을 사용하여 정렬 도구를 엽니다.

Stack을 이미지의 소스로 선택하고 First Plane/Time Point를 참조 평면으로 선택한 다음 Source Stack 버튼으로 스택을 선택하고 Apply를 클릭합니다. 자동 정렬이 완료되면 정렬된 스택을 저장합니다. MOV 또는 AVI 형식으로 동영상을 생성하려면 스택, 동영상 만들기를 통해 동영상 만들기 기능을 엽니다.

Source Stack(소스 스택) 버튼으로 타임랩스 녹화를 선택한 다음 출력 형식, 프레임 속도, 프레임 수를 선택하고 Save(저장)를 클릭합니다. 운동성 DK1622 야생형 세포를 사용한 이 타임 랩스 실험에서 위상차 이미지는 24시간 동안 5분마다 획득되었습니다. 예상했던 대로, 세포는 운동성이 있었고 주로 그룹으로 움직였습니다.

비운동성 Delta-mgIA 세포를 사용한 위상차 라이브 셀 이미징에서 미세식민지 형성 동안 개별 세포의 성장과 분열을 따랐습니다. 24시간 동안 5분마다 이미지를 획득했을 때 단일 세포 해상도에서 235분 더하기 또는 빼기 50분의 분할 시간을 정량화할 수 있었습니다. 장기간에 걸쳐 yfp 표지 단백질을 추적하면서 세포가 정상적으로 성장하는지 조사하기 위해 ParB-YFP를 발현하는 M.xanthus 세포를 추적했습니다.

ParB-YFP는 초기에 아극 세포 영역에 단일 클러스터를 형성했습니다. 세포 분열 직전 또는 직후에 클러스터가 복제되어 한 클러스터는 이전 세포극에 남아 있고 두 번째 클러스터는 새 세포극으로 전위되었습니다. 이 실험에서 FtsZ-gfp를 발현하는 비운동성 세포는 세포 분열의 위치를 지시하는 중간 세포에서 FtsZ-gfp가 강하게 축적되는 것을 보여주었습니다.

FtsZ-gfp는 주로 더 긴 세포에서 중간 세포에 클러스터를 형성했습니다. 세포 분열 2시간 후, FtsZ-gfp는 딸 세포의 중간 세포에 축적되었습니다. 이 기술을 마스터하면 Myxococcus xanthus뿐만 아니라 다른 느리게 성장하는 박테리아에서도 일상적으로 수행할 수 있습니다.

박테리아에 대해 이 절차를 설정할 때 해당 박테리아의 특정 성장 요구 사항을 충족하도록 한천 플레이트의 성장 배지 구성을 조정하는 것이 중요합니다. 모든 박테리아의 경우 광독성을 피하기 위해 노출 시간, 광도 및 이미징 빈도와 같은 최적의 이미징 조건을 결정하는 것이 중요합니다. 또한 형광 표지된 단백질의 경우 광독성과 광표백을 피하기 위해 이미징 조건을 조정해야 합니다.