2018년 8월 4일
이 프로토콜 하 정확 하 고 확실 하 게 해 부 공간에서 격리 된 마우스 망막 깊은 눈 랜드마크, s opsin immunohistochemistry, Retistruct, 및 사용자 지정 코드의 사용에 대 한 포괄적인 해 부와 분석 가이드를 제공 합니다.
이 해부 프로토콜의 목적은 쥐 망막의 지형 방향에 대한 직근, 맥락막 균열 및 S-opsin 구배와 같은 안구 해부학적 랜드마크를 사용하기 위한 표준화된 방법론을 제공하는 것입니다. 이러한 기술의 주요 장점은 고립된 마우스 망막의 등쪽, 배쪽, 코 및 측두엽을 정확하게 식별할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 것입니다. 먼저 등쪽 각막, 각막 공막 경계 근처, 비강과 측두엽 사이의 한 지점을 확인합니다.
가열된 소작 펜으로 각막을 1초 미만 동안 만지면 방향 확인을 위한 화상 자국을 만들 수 있습니다. 두 번째 눈에 대해 반복합니다. 등쪽 화상의 존재는 상직근을 식별할 수 있게 해줍니다.
적출을 위해 구부러진 집게를 사용하여 안구를 안와에서 부드럽게 밀어내고 아래에서 지구본을 잡습니다. 그런 다음 소켓에서 지구본을 천천히 들어 올리면서 동시에 지구본이 소켓에서 분리될 때까지 왼쪽에서 오른쪽으로 부드럽게 움직입니다. 직근이 부착된 지구본을 해부 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다.
양쪽 눈으로 작업하는 경우 어느 눈이 왼쪽 눈이고 어느 눈이 오른쪽 눈인지 추적해야 합니다. 해부 범위에서 등쪽 각막 화상을 시각적으로 찾고 이와 관련된 상직근을 식별합니다. 해부 가위나 20게이지 바늘을 사용하여 각막의 화상 자국에 구멍을 뚫습니다.
그런 다음 상근을 이등분하기 위해 시신경을 향해 지구본을 깊게 자릅니다. 이 절단이 있는 고립된 망막이 여기에 표시되며, 이 절단으로 재건된 망막이 여기에 표시됩니다. 두 세트의 집게를 사용하여 망막의 일부가 노출될 때까지 천공으로 만든 구멍을 부드럽게 찢어 망막을 분리하기 시작합니다.
그런 다음 공막이 완전히 제거될 때까지 공막과 망막을 분리하십시오. 망막이 완전히 분리될 때까지 홍채, 수정체, 유리체 및 남아 있는 모든 구조를 제거합니다. 등쪽 화상의 존재는 비강 및 측두엽 맥락막 열구를 식별할 수 있게 합니다.
오른쪽 눈으로 작업하는 경우 비강 맥락막 열구는 화상 부위 오른쪽에 있고 측두 맥락막 열구는 화상 부위 왼쪽에 있습니다. 이것은 왼쪽 눈으로 작업하는 것과는 반대입니다. 맥락막 열구 랜드마크를 사용하여 망막 방향을 식별하려면 눈 뒤쪽에서 맥락막 열구를 찾아 식별합니다.
눈이 여전히 마우스에 있는 것처럼 등쪽 화상 표시가 위쪽 극에 위치하도록 지구본의 방향을 지정합니다. 그런 다음 해부 가위나 20게이지 바늘을 사용하여 먼저 등쪽 화상이 있는 지구본에 구멍을 하나 뚫습니다. 다음으로, 등쪽 각막 화상이 있는 시신경을 향해 얕은 완화 절단을 합니다.
그런 다음 시신경 쪽으로 다음 두 번의 깊은 완화 절단을 만듭니다. 하나는 해부 가위의 칼날을 눈 뒤쪽의 측두맥락막 열구선과 나란히 놓는 것이고, 다른 하나는 해부 가위의 날을 눈 뒤쪽의 비강 맥락막 열구선과 나란히 놓는 것입니다. 이러한 절단은 고립되고 재건된 망막에 표시됩니다.
이러한 절단을 한 후 두 세트의 집게를 사용하여 망막의 일부가 노출될 때까지 천공 구멍을 부드럽게 뜯어냅니다. 해부 가위를 사용하여 망막이 평평하게 놓이도록 망막을 네 번 절개합니다. 신경절 세포가 위로 향하게 하여 망막의 각 모서리를 집게로 막에 부드럽게 눌러 니트로셀룰로오스 막에 망막을 장착합니다.
그런 다음 겸자를 사용하여 장착된 망막을 24웰 플레이트의 첫 번째 웰에 포함된 4% 파라포름알데히드 1밀리리터에 담그십시오. 24웰 플레이트를 실온의 오비탈 셰이커에 놓고 정확히 40분 동안 망막을 고정합니다. 고정 후 1ml의 0.1 몰 PBS로 채워진 플레이트의 두 번째 웰로 망막을 옮기고 실온에서 15 분 동안 망막을 세척합니다.
세척이 완료되면 장착된 망막을 1ml의 차단 용액이 들어 있는 다섯 번째 웰로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 토끼 항-S-opsin 1차 항체를 1에서 500의 농도로 차단 용액에 첨가하고 섭씨 4도에서 3일 동안 배양합니다. 3일간의 배양 후, 1ml의 PBS를 채운 6개의 웰에 10분씩 실온에서 순차적으로 넣어 망막에서 여분의 1차 항체를 6회 세척합니다.
그런 다음 세척된 망막을 새 차단 용액이 있는 우물에 넣고 당나귀 항토끼 Alexa 594 2차 항체를 추가합니다. 2차 항체와 함께 망막을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후 이전과 같이 PBS에서 망막을 6회 세척합니다.
겸자를 사용하여 장착된 망막을 PBS가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 망막이 더 이상 붙어 있지 않을 때까지 망막과 막 사이에 집게 끝을 부드럽게 삽입하여 니트로셀룰로오스 막에서 망막을 분리합니다. 유리 현미경 슬라이드를 PBS에 담그고 망막을 슬라이드에 띄우고 망막이 유리에 달라붙을 때까지 집게로 부드럽게 찔러 망막을 슬라이드에 장착합니다.
슬라이드의 망막을 장착 매체로 덮고 1.5 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드를 슬라이드 트레이에 넣고 한 시간 동안 실온에 두십시오. 한 시간 후 슬라이드 트레이를 섭씨 4도에 놓습니다.
슬라이드를 24시간 동안 덮은 후에는 매니큐어를 사용하여 슬라이드 측면을 밀봉하여 건조를 방지하십시오. 이것은 오른쪽 눈에서 분리된 망막이 S-opsin을 표지하기 위해 면역 염색되고 상피 형광 현미경으로 이미지화한 예입니다. 이 망막의 절단은 지형 방향이 S-opsin 구배에 의해 식별될 수 있기 때문에 임의적이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
그런 다음 획득한 망막 이미지는 ReadiStruct 소프트웨어를 사용하여 디지털 방식으로 재구성할 수 있습니다. 이 이미지에서 원본 컷은 의사 색상의 빨간색입니다. 이 프로그램의 출력 파일이 망막을 올바르게 정렬하지 않습니다.
맞춤형 매트 실험실 코드를 통해 망막을 실행한 후, 망막을 회전시켜 가장 높은 농도의 S-opsin 염색이 바닥에 배치되고 복부 망막으로 식별됩니다. 이 이미지는 왼쪽 눈의 망막을 보여줍니다. 측두극은 배쪽 극에서 시계 반대 방향으로 90도 떨어진 곳에 있고 코극은 복부 극에서 시계 방향으로 90도 떨어진 곳에 있습니다.
일단 숙달되면 이러한 해부 기술은 적절하게 수행되면 단 몇 분 만에 쉽게 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 상직근, 맥락막 열구 또는 S-opsin 구배를 랜드마크로 사용하여 마우스 망막의 방향을 정확하고 안정적으로 지정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 프로토콜은 눈의 랜드마크와 면역조직화학을 이용하여 분리된 마우스 망막의 정확한 방향을 지정하고 분석하는 가이드를 제공합니다. 주요 기술에는 특정 해부학적 특징 및 S-옵신 기울기를 통한 등쪽 및 배쪽 극의 식별이 포함됩니다.
Accurate spatial orientation of the mouse retina is critical for reproducible analysis in visual neuroscience, enabling reliable comparison of cell density gradients, directional tuning, and degeneration patterns across studies. Standardizing orientation methods using deep ocular landmarks reduces variability and supports mechanistic de-risking in target validation pipelines. This protocol enhances predictive confidence by ensuring consistent anatomical alignment, a prerequisite for translational biomarker alignment and preclinical model reproducibility.
This method integrates into early discovery workflows by providing a standardized orientation step prior to immunohistochemistry, imaging, and functional assay execution, ensuring data integrity from target validation through preclinical evaluation.