Name: 어디 당신이 문제: 한 해 부 자르고 눈 랜드마크에서 마우스 망막의 공간적 방향에 대 한 분석 가이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 학습하세요 마우스 망막의 정확한 공간적 방향 분석을 위한 해부 및 면역조직화학 기법. S-opsin 그라데이션과 안구 해부학적 랜드마크를 활용하여 배측, 복측, 비측, 측두측을 식별하는 표준화된 방법론을 익히세요.

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우리는 브리트니 일과 그들의 기술 지원에 대 한 제시카 Onyak와 박사 류 알려주셔서 친절 하 게 그의 epifluorescent 현미경을 사용 하 여 감사 하 고 싶습니다. 지원의 승인: NIH R15EY026255-01 '과 칼 Kirchgessner 재단.

<ol><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
<li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li>
<li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites%3A+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li>
<li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li>
<li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li>
<li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice%3A+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131(2014).</li>
<li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li>
<li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+selectivity+in+the+retina%3A+Symmetry+and+asymmetry+in+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li>
<li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Ikbkap+causes+slow%2C+progressive+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Maiorano, N. A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938(2013).</li>
<li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612(2015).</li>
<li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li>
<li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+and+function+of+the+M4+cell%2C+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+Rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+type%2C+size%2C+and+spacing+can+be+specified+independent+of+homotypic+dendritic+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts.</a> Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).</li>
<li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degeneration+and+apoptosis+patterns+of+cone+photoreceptors+in+rd11+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice.</a> J Ophthalmol. 2017, 9721362(2017).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li>
<li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li>
<li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+vertebrate+eye%3A+Opsins%2C+photoreceptors%2C+retina+and+eye+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li>
<li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina%3A+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921(2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

확인 하 고 해 부 공간에서 격리 된 마우스 망막의 방향을 라벨 없음, 표준화 된 프로토콜이 되었습니다. 프로토콜 상세 표준화 함으로써이 공 허를 채우기 위해 시도 여기 고 깊은 해부학 적 랜드마크를 사용 하는 방법을 자세히 참조 포인트를 안정적으로 망막 방향을 식별 합니다. 그것은이 프로토콜에서 깊은 해 부 랜드마크 방향을 마우스 망막 각 막 화상22같은 피상적인 랜드마크 보다 더 정확 하 고 안정적인 방법을 제공 표시 되었습니다. 따라서, 망막 방향에 대 한 각 막 화상에 의존 해야 하는 연구 방향 곧바로 근육, 맥락 막 균열 등 랜드마크에 의존 해야 하는 연구 보다 큰 오류 했다가지고 수 있습니다. 이 불일치에 대 한 필요성 및 결과 해석 하 고 연구 된 정확한 망막 오리엔테이션 사이 비교에 관하여이 표준화 된 프로토콜의 중요성을 강조 표시 합니다. 전반적으로, 표준화 된 프로토콜 제공할 것입니다 비전 연구자에 따라, 일반적인 방법은 망막을 식별 하기 위한 비 표준화 된 방법의 사용으로 발생할 수 있는 데이터 수집에 혼란 변수의 존재 없다 방향입니다.
여기에 제시 된 방법 쉽게 반복 하 고 실험 프로토콜의 많은 종류에 적용할 수 있습니다. 사실,이 프로토콜의 가장 큰 장점 중 하나는 그것의 적응성입니다. 맥락 막의 균열, s opsin 표현과 곧바로 근육 랜드마크 모든 발견 되었습니다 안정적으로 망막 방향22 를 식별 하기 때문에 랜드마크 실험적인 매개 변수에 가장 적합 한 데이터 수집 (테이블을 최적화 하기 위해 선택 될 수 있다 1). 또한, 해 부의 방법을 더 망막의 방향을 명확히 하기 위하여 결합 될 수 있다. 예를 들어 맥락 막 게 인하 결합 될 수 있다 s opsin immunohistochemistry 망막의 모든 4 개의 극의 방향을 위해: 맥락 막 게 상처, 비 강 및 일시적인 반구를 식별할 수 있습니다 및 s opsin immunohistochemistry 식별할 수 복 부와 등 쪽 반구입니다. 그러나,이 프로토콜의 적응성 생리학 실험의 시간-민감한 성격에 의해 제한 될 수 있습니다. 랜드마크를 식별, 각 막 화상, 고 구호 컷을 실행 하는 데 걸리는 시간 ex vivo 실험에서 중요 한 조직의 죽음 귀 착될 수 있었다, 때문에 일부 이러한 절 개 방법의 최적의 수 있습니다. 다행히도, 깊은 랜드마크를 식별 하 고를 완화 하는 것 맥락 막 균열 또는 우수한 곧바로 근육 해 부 방법, 익숙한 되고있다 일단 인하 해 부 루틴의 일부가 빠르고 크게 추가 하지 마십시오 해 부의 길이입니다. 우리는 여기서 설명 하는 단계 시간에 매우 민감한 실험 시간에 추가할 수 없습니다 인정 할 조직의 생존 능력은 더 이상 문제 (그림 3 때 망막 방향 특별 게시물 에 대 한 s opsin 그라디언트를 사용 하 여 것이 좋습니다. ). S opsin로 모든 4 개의 극을 식별할 수 있는 망막, 하는 효과적인 방법에 대 한 망막을 얼룩이 지기: s opsin 얼룩 망막 등 쪽과 복 부 극으로 나누고 비 강 및 임시의 식별 여부에 따라 기둥을 허용 망막 오른쪽 또는 왼쪽 눈 (그림 3)에서 이다. 따라서, 우리는이 프로토콜 실험적인 매개 변수를 충족 수 있습니다 정확 하 게 망막 방향에 대 한 방법의 안정적이 고 반복 가능한 집합을 제공 믿습니다.
어떤 수정 된 망막 해 부 해 부 방법의 타당성은는 것과 고립 된 조직의 품질의 정확도 의해 제한 됩니다. 어떤 조직을 절 개 하는 동안 손실 됩니다 경우는 망막은 너무 정확한 재건에 대 한 손상, Retistruct 및 MATLAB 프로그램 되지 않습니다 안정적으로 재구성 하거나 망막의 방향을. 그것은 따라서 실험 데이터를 수집 하기 위해 그것을 사용 하 여 전에 절 개 방법을 연습 하는 것이 중요입니다. 해의 종류 설명 여기 어려운 되지 않습니다, 하는 동안 그들은 특정 랜드마크 망막 방향 식별의 반복성을 보장 하기 위해 연습 해야 합니다. 또한, 올바른 랜드마크 특정 게 데이터 수집을 시작 하기 전에 해부학 적 랜드마크를 시각적으로 식별 하는 것 연습 사용이 필수적입니다. 특정 것의 정확성을 확인 하는 방법 중 하나는 어느 맥락 막 균열 수 있도록 인하 또는 우수한 곧바로 근육 하 고 고정된 표식 이며 따라서 dissectio의 정확도에 의존 하지 않습니다 이후 s opsin 그라데이션을 상처의 위치 비교 명. 잠재적인 dissectors 또한 인하는 그림 1 에 표시 된 정확한 랜드마크와 재건된 망막의 예에 그들의 재건된 망막을 비교할 수 있습니다 및 그림 2. 본질적으로, 잠재적인 것 특정 해 부 형식에 대해이 프로토콜에서 설명 하는 단계를 수행 해야 합니다, 여부 우수한 곧바로 근육 또는 맥락 막 균열 방법, 및 s opsin 그라데이션 설정의 유효성을 결과 비교할 수는 특정 것입니다. 것은 랜드마크의 위치에 대해 확실 하지 않으면 망막의 부정확 한 방향으로 될 수 있기 때문에 것입니다 기본적으로 영향을 데이터 수집 및 해석.

망막 신경 과학의 중요 하 고 때로는 간과 측면은 전기 생리학 기록 실에서 또는 조직학 슬라이드에 망막의 방향을 적절 한 방향 및 고립 된 전체 마운트 망막의 분석 이다. 이것은 포유류 시각 시스템의 조사에 대 한 가장 널리 사용 되는 모델은 현재 마우스 망막과 관련 된 연구를 위해 특히 중요 하다. 최근의 발견 공개 마우스 망막이 공간적으로 균일 하지만 melanopsin 신경 절 세포, 과도 OFF-알파 신경 절 세포, 원뿔 opsins1,2 등 기능적으로 뚜렷한 망막 세포 유형의 밀도 및 크기 그라디언트는 ,3,,45. 따라서, 망막의 방향을 결정 하는 데 사용 하는 방법 실험 결과 셀 형식 또는 opsin 배포판2,,36을 포함을 영향을 미칠 수 방향 선택의 방향 조정 신경 절 세포7,,89, 그리고 망막 변성10,,1112,13,14의 지형 패턴 . 사실, 안 보고 어떻게 망막 방향을 보고 발생할 수 있습니다 불일치 문학과 혼란에 연구 사이의 데이터를 비교 하려고 할 때. 그것은 따라서 연구팀은 이러한 연구의 결과 정확 하 게 해석 될 수 있도록 망막의 방향을 식별 하는 방법 보고.
망막 방향 일반적으로 안구 enucleation1,3,12,,1516,17 이전 등, 복 부, 비 강 또는 일시적인 각 막 점수 구분 ,,1819 또는 절단 또는 깊은 해 부 눈 아 안구 근육6,7같은 얼룩, 맥락 막 게20,21, 또는 s-opsin 그라데이션2,3. 곧바로 근육 식별 하는 등, 복 부, 비음, 일시적인 망막 우수한 곧바로, 열 등 곧바로, 중간 곧바로, 또는 측면 곧바로 근육, 깊은 구호 컷 하나의 첨부 파일을 양분 하 여 각각 사용할 수 있습니다. 그러나, 대부분의 실험에 대 한 하나의 곧바로 근육을 사용 하 여 망막22방향을 위해 충분 하다. 맥락 막 게 눈 개발의 나머지는 눈의 뒤에 희미 한 가로 라인으로 볼 수 있습니다. 이 선의 각 끝 비음 또는 세계23의 시간 극에서 종료합니다. 마지막으로, s-opsin 식 쥐, 복 부 망막에 비대칭으로 배포 되 고 s opsin 항 체 immunohistochemical 실험1에서 복 부 망막을 사용할 수 있습니다.
최근 작품 Stabio, 외. 22 각 막 화상 등 피상적인 눈 랜드마크는 해 부 공간, 인간의 오류 및 임시 및 중간 사용 하는 경우 각 막 화상에 변화 가능성이 높습니다에 망막 방향을 위한 덜 안정적인 방법 시연 참조 점으로 canthi입니다. 반면, 우수한 곧바로 근육, 맥락 막 균열 및 s opsin 그라데이션 같은 깊은 랜드마크 망막22방향을 위한 더 안정적이 고 정확한 랜드마크 될 표시 되었습니다. 그러나, 이러한 해부학 적 랜드마크의 식별 문학에서 자세히 설명 되지 않은 독특한 절 개 단계를 요구 한다. 따라서,이 프로토콜의 목표는 우수한 곧바로 근육, 맥락 막 균열 및 s opsin 그라디언트를 사용 하 여 마우스 망막의 공간적 방향 정확 하 게 식별 하는 방법에 대 한 포괄적인 자습서를 제공 하는 것입니다. 또한, 우리는 두 s opsin 항 체, s opsin immunohistochemistry에 대 한 프로토콜의 효과의 비교를 포함 했다.
정확 하 게 망막 방향에 의존 하는 연구를 한 추가 도전 wholemount 망막 녹음 실, 접시, 또는 슬라이드에 병합 하는 데 필요한 큰 구호 컷입니다. 이 편평한 2 차원 구조로 군데는 무엇 인지 자연스럽 게 3 차원 구조 분석에 대 한 문제를 발생할 수 있습니다. Retistruct24 라는 프로그램 돌아갑니다 플랫 wholemount 망막의 3 차원 구조 그것에서 수집 된 데이터를 분석 하기 전에 사용할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜의 섹션 Retistruct 소프트웨어를 사용 하 여 s opsin immunostained 마우스 망막을 재구성 하는 데 필요한 단계를 강조 전용입니다. 우리는 또한 s opsin로 얼룩진 정확 하 게 회전 하 고 동양 마우스 망막에 개발 되었다 우리의 사용자 정의 MATLAB 스크립트를 사용 하 여 프로토콜의 섹션을 포함.

<table><tbody><tr><td>0.1 M 인산염 완충 식염수</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan2 에피 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nailpolish</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE 저속 궤도 셰이커</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6780FP</td><td></td></tr><tr><td>Costar TC 처리 24웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티-염소 Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티-래빗 Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 일반 세럼</td><td>Millipore</td><td>566460</td><td>5.2%에서 사용 (52 &mu; L 86 &mu; 20% 트리톤 X-100 및 863 &mu의 L; 블로킹 솔루션 1mL에 대해 0.1M PBS의 L)</td></tr> <tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-s-opsin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>2017</td></tr><tr><td>Graefe Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 또는</td><td>FIJI National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>무료로 사용 가능한 소프트웨어</td></tr><tr><td>Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>최소 버전 2007b 이후</td></tr><tr><td>마이크로 커버 안경&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 슬라이드 트레이</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Moira 초미세 펜치</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714-S</td><td>4%(25 &mu; L 및 875 &mu; 고정제 1mL에 대해 0.1M PBS의 L)</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 바늘 20G(0.90mm x 25mm)&nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glass Petri Dish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>N/A</td><td>무료로 사용 가능한 소프트웨어; 버전 3.4.3 이상</td></tr><tr><td>Rabbit anti-s-opsin</td><td>Millipore ABN1660</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 현미경 카메라</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A 무료로 사용 가능한 소프트웨어&nbsp; Windows 7 또는 Windows 10과 호환 Shandon</td></tr><tr><td>Aqua-Mount Slide Mounting Media</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>사용 1.7% (86 &mu; 20% Triton-X의 L, 52 &mu; 당나귀 노멀 세럼의 L과 863 &mu; 차단 용액 1mL에 대해 0.1M PBS의 L)</td></tr><tr><td>Vannas Spring Dissection Scissors&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>5MP USB 현미경 디지털 카메라</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>Olympus 해부 현미경과 함께 사용</td></tr></tbody></table>

어디 당신이 문제: 한 해 부 자르고 눈 랜드마크에서 마우스 망막의 공간적 방향에 대 한 분석 가이드

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

시각 신경 과학, 밀도의 분석 및 망막 세포 유형의 크기 그라디언트를 포함 하 여 많은 연구에 대 한 중요 하다 정확 하 고 안정적으로 식별 격리 된 마우스 망막의 공간적 방향 방향 선택의 방향 조정 신경 절 세포와 일부 망막 질병에 지형 변성 패턴의 시험. 그러나, 많은 다른 눈 해 부 문학에서 보고 된 사용 되는 방법이 식별 하 고 레이블을 마우스 망막에서 망막 방향 있다. 방향 등의 연구에 사용 하는 방법 자주 간과 하지 보고 어떻게 망막 방향 결정 됩니다 발생할 수 있습니다 불일치 문학과 혼란에 연구 사이의 데이터를 비교 하려고 할 때. 각 막 화상 등 피상적인 눈 랜드마크는 일반적으로 사용 하지만 최근 곧바로 근육, 맥락 막의 균열, 또는 s opsin 그라데이션 같은 깊은 랜드마크 보다 덜 신뢰할 수 표시 되었습니다. 여기, 우리는 정확 하 게 해 부하 고 격리 된 마우스 망막의 공간적 방향 문서화 깊은 눈 건축물의 사용에 대 한 포괄적인 가이드를 제공 합니다. 우리는 또한 두 s opsin 항 체의 효과 비교 하 고 s opsin immunohistochemistry에 대 한 프로토콜을 포함. S-opsin 그라데이션에 따라 망막의 Retistruct 소프트웨어와 함께 망막 재건 및 회전 사용자 지정 코드를 해야 하므로 우리 모두이 프로그램을 사용 하는 데 필요한 중요 한 단계를 제시 했습니다. 전반적으로,이 프로토콜의 목표 안정적이 고 반복 가능한 가장 실험 프로토콜에는 정확 하 게 망막 방향 위한 메서드 집합을 제공 하는. 이 작품의 지배적인 목표는 망막 방향 방법 미래 연구에 대 한 표준화입니다.

정확 하 고 확실 하 게 우수한 곧바로 근육을 양분 하는 하나의 구호 컷 등 쪽 망막 (그림 1)를 식별 합니다. 맥락 막 게 정확 하 고 안정적으로 시간적 및 비 강 맥락 막 균열 (그림 2)에 따라 깊은 구호 상처와 비 강 및 일시적인 망막을 식별합니다. 이 예제에서는 구호 컷도 했다 등 망막에 식별 (그림 2D, 수직 화살표) 망막의 등/복 부 축. 이 프로세스의 단계는 미래 dissectors에 의해 복제의 목적을 위해 표시 됩니다. S-opsin immunohistochemistry의 조합 (그림 3A 및 3D), Retistruct 소프트웨어 (3B, 3E)와 개조와 사용자 지정 MATLAB 코드 (3 C, 3 층)와 함께 정확한 회전 수는 비 강 및 일시적인 극 알려져 있다 (그림 3) 오른쪽 또는 왼쪽 눈에서 망막 인지 하는 경우는 망막의 복 부와 등 쪽으로 식별. 우리는 또한 라벨 s opsin 콘 (그림 4A-D)에 효과 대 한 두 가지 일반적으로 사용 되는 s opsin 기본 항 체 비교: 두 염소 안티-s-opsin 기본 항 체와 토끼 안티-s-opsin 1 차적인 항 체 효과적으로 라벨 동일한 마우스에서 s opsin 콘 (그림 4E)
덜어 컷 s opsin immunostained 재건 망막에 발견 했다 하 고 그들의 위치 s opsin 그라데이션에 의해 결정 하는 방향으로 비교 했다. 우리의 사용자 정의 MATLAB를 사용 하 여 코드 ( 보충 자료참조), 망막 s opsin 얼룩의 높은 농도 ventrally, 따라서 진정한 배치 되도록 회전 정확 하 게 했다 (대 한 우수한 곧바로) 90 °, 0 ° (코에서 진정한 코 등 맥락 막 게) 180 ° (시간적 맥락 막 게)에서 임시 진정한. 각도 잘라 덜어 각각의 값은 후 망막 s opsin 그라데이션에 따라 회전 했다 ImageJ의 각 도구를 사용 하 결정 했다. 각 구호 컷 유형 평균 각도 계산 하 고 각 구호 컷된 타입의 평균 값 다음 극좌표 플롯 (그림 6)에 표시 했다. 평균적으로, 우수한 곧바로 근육 상처 확인 96.3 ± 4.3 °에 지 극 (n = 11) (그림 6). 비 강 맥락 막 게 식별 6.7 ± 5.8 °에서 비 강 극 하 고 시간적 맥락 막 게 식별 172.0 ± 4.4 °에 측 두 엽 극 (n = 9; 그림 6)입니다.
<img alt="안구 구조의 현미경 분석; 등쪽 화상 효과; 신경해부학 다이어그램; 연구 데이터." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 우수한 곧바로 근육을 사용 하 여 정확 하 게 식별 하는 오른쪽 눈의 등 쪽 망막에. (A)로 팁 펜 (흰색 화살표)로 만든 scleral 각 막 국경 근처 등 각 막 화상의 예. 우수한 곧바로 근육이이 보기 (흰색 화살표)에 표시 이기도합니다. (B)는 전체 예는 구호와 함께 탑재 된 망막 잘라 우수한 곧바로 근육을 양분 하 여 등 쪽 망막에 만든. 화살표 등 망막에 우수한 곧바로 근육을 양분 하 여 만든 컷을 덜어 깊은 묘사. 망막은 1 차적인 항 체 염소 안티-s-opsin 물 ( 재료의 표참조) 및 이차 항 체 당나귀 안티 염소 알 렉 사 594 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오 여기: 590 nm; 방출: 620 nm) (청록색). 망막은 텍사스 레드 필터 epifluorescent 현미경으로 몇 군데 (595 nm). (C) A 망막 Retistruct 재건축 및 MATLAB 코드를 사용자 정의 회전 ( 보충 자료참조)는 우수한 곧바로 근육을 덜어 볼 수 컷 (흰색 화살표)와 함께. D: 등, v: 복 부, t: 시간, n: 비음. 스케일 바 = 1 m m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="눈 발달 분석; 등쪽 화상 및 맥락막 균열; 현미경 이미지; 해부학적 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 오른쪽 눈의 망막의 비 강 및 시간 폴란드를 정확 하 게 식별 하는 맥락 막 게를 사용 하 여. (A)로 팁 펜으로 만든 scleral 각 막 국경 근처 등 각 막 화상의 예. (B)는 맥락 막 게 sclera (흰색 화살표)에 눈의 뒤에 보이는. 등 각 막 화상 또한 시간적 맥락 막 균열에서 약 90 °에 위치한이 보기에 표시 됩니다. Scleral 각 막 경계에 시 신경에서 여행 sclera 눈의 뒷면에 표시 (C) 맥락 막의 균열. (D) A 망막 염소 안티-s-opsin 물 ( 재료의 표참조) 및 이차 항 체 당나귀 안티 염소 알 렉 사 594 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오 여기: 590 nm; 방출: 620 nm) 맥락 막 게 인하 (가로 (녹청) 화살표) (수직 화살표)를 잘라 등 완화. 망막은 텍사스 레드 필터 epifluorescent 현미경으로 몇 군데 (595 nm). (E)는 망막 Retistruct에 재건 된 고 등 구호 컷와 비 강 및 시간적 맥락 막 게 컷 표시 (흰색 화살표) 사용자 지정 MATLAB 코드 (보충 자료 참조)와 함께 회전. D: 등, v: 복 부, t: 시간, n: 비음. 스케일 바 = 1 m m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="망막 매핑 다이어그램; 오른쪽 및 왼쪽 망막 분석; 회전되지 않은 시각화 및 회전된 시각화." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: s-opsin 그라디언트를 사용 하 여 망막의 모든 4 개의 기둥을 식별 하. (A)는 망막의 예는 오른쪽 눈 immunostained s opsin 레이블이 되었으며 텍사스 레드 필터 epifluorescent 현미경으로 몇 군데에서 해 부 (595 nm). 이 망막에 상처는 임의 지형 방향 s opsin 그라데이션에 의해 결정 됩니다. (B) Retistruct와 A에 망막을 재구성의 결과. 그 s opsin 그라데이션 올바르게 정렬 되지 망막 사용자 지정 MATLAB 코드 ( 보충 자료참조)를 통해 실행 하지 않은 때문에 알 수 있습니다. (C) 회전 하는 사용자 지정 코드 A에서 망막의 결과. 망막은 s opsin 얼룩의 높은 농도 하단에 회전 하 고 복 부 망막으로 식별. 오른쪽 눈에서 망막 이므로 일시적인 극은 지 느 러 미 극에서 시계 반대 방향으로 위치 90 ° 이며 비 극 위치 90 ° 등 극에서 시계 방향으로. (D)는 망막의 예 s opsin 라벨 immunostained 되었으며 텍사스 레드 필터 몇 군데 왼쪽된 눈에서 해 부 (595 nm). 이 망막에 상처는 임의 지형 방향 s opsin 그라데이션에 의해 결정 됩니다. (E) 디지털 d Retistruct와 망막을 재구성의 결과. 그 s opsin 그라데이션 올바르게 정렬 되지 때문에 망막에는 사용자 지정 코드에 의해 회전 되지 알 수 있습니다. (F) 사용자 지정 코드와 함께 d에서 망막 회전의 결과. 망막은 s opsin 얼룩의 높은 농도 하단에 회전 하 고 복 부 망막으로 식별. 왼쪽된 눈에서 망막 이므로 코 극 위치 90도 시계 반대 방향으로 지 느 러 미 극에서 이며 일시적인 극 등 극에서 시계 방향으로 위치한 90 ° 이다. D: 등, v: 복 부, t: 시간, n: 비음. 스케일 바 = 1 m m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="염소 토끼 항-S-옵신 면역염색 현미경 이미지; 조직학 단면; 데이터 차트" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: 라벨 s opsin 콘에서 두 개의 기본 s opsin 항 체의 비교. (A) A 망막 염소 안티-s-opsin 1 차적인 항 체 물 ( 재료의 표참조). (B) 같은 마우스의 다른 망막 토끼 항 체 안티-s-opsin 기본으로 물 ( 재료의 표참조). (C) A 대표 지역 (0.1 x 0.1 m m2) 염소 안티-s-opsin 1 차 항 체로 얼룩진 망막에서. 40 X 확대 epifluorescent 현미경에 찍은 이미지. (D) A 대표 지역 (0.1 x 0.1 m m2)는 망막에서 토끼 안티-s-opsin 물 ( 재료의 표참조), 기본 항 체 대체. 이미지는 40 X 확대 epifluorescent 현미경에서 촬영 됐다. (E) 두 항 체의 콘 외부 세그먼트의 동일한 수 라벨 immunopositive s-콘은 염소 안티-s-opsin와 토끼 안티-s-opsin 테스트 망막에서 스테인드 수에 상당한 차이가 있기 때문에 기발 (n = 2; ANOVA와 임시 게시 Bonferroni 테스트; p &gt; 0.05). 스케일 바 = 1 mm (A-B); 25 µ m (C-D) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="정적 평형 분석, 구조 및 결과를 보여주는 이미징 데이터와 소프트웨어 인터페이스 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: 망막 immunostained s opsin로 재구성 하는 Retistruct 소프트웨어를 사용 하는 비주얼 가이드. (A) A 망막 표시 개요 Retistruct에 열 하 고는 "눈물" 추가. "눈물"의 포인트는 겹쳐 흰색 화살표와 함께 표시 됩니다. 이 망막에 모든 상처는 임의 아니 특정 랜드마크 해 부 동안 망막 방향을 표시 하는 데 사용 되었다 있습니다. 중요 한 버튼은 빨간색으로 설명 되어 있습니다. 모든 "눈물" 추가 (B) 망막 그리고 망막의 가장자리에 "D"로 식별 하는 등 망막. "재구성 망막" 버튼 표시는 알. 중요 한 버튼은 빨간색으로 설명 되어 있습니다. (C)는 망막을 재구성 하는 과정. 재건축된 망막의 극 작 녹청 (파란색 화살표 컷된 위치를 명확 하 게 겹쳐)에 상처를 덜어 표시 오른쪽에 표시 됩니다. (D)는 망막 Retistruct 통해 실행의 최종 결과. 원래 wholemount 망막 왼쪽에 남아 있고 재건된 망막 오른쪽에 나타납니다. 덜어 삭감 녹청 (흰색 화살표 컷된 위치를 명확 하 게 겹쳐)에서 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="안구 근육 방향을 보여주는 방사형 차트; 상직근, 맥락막 균열(비강, 측두부) 데이터." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6: 우수한 곧바로 근육 및 맥락 막 게 마우스 망막 하 정확 하 게 사용할 수 있습니다. 어느 우수한 곧바로 근육 상처를 덜어에서 얻은 각도의 극좌표 플롯 또는 Retistruct로 재구성 된 망막에 맥락 막 게 인하. 덜어 컷 s opsin immunostained 재건 망막에 발견 했다 하 고 그들의 위치 s opsin 그라데이션의 위치를 비교 했다. 코 (비 강 맥락 막 균열에 대 한 0 °)를 true와 시간적 (180 ° 시간적 맥락 막에 대 한 진정한 s opsin 얼룩의 높은 농도 ventrally 위치, 진정한 지 (90 ° 우수한 곧바로)는 망막을 정확 하 게 회전을 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용 하 여, 게) 각 망막에 대 한 결정 했다. 각 개별 덜어 컷된 각도 ImageJ에 평균 각도 결정 했다의 값 형식 잘라 덜어 각 산출 되었다. 우수한 곧바로 근육 상처 확인 96.3 ± 4.3 °에 지 극 (n = 11). 비 강 맥락 막 게 식별 6.7 ± 5.8 °에서 비 강 극 하 고 시간적 맥락 막 게 식별 172.0 ± 4.5 °에 측 두 엽 극 (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>깊은 랜드마크</td>
			<td>각 막 화상 위치</td>
			<td>식별 하는 망막의 극</td>
			<td>실험적인 응용 프로그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>탁월한 곧바로</td>
			<td>지 느 러 미</td>
			<td>지 느 러 미</td>
			<td>라이브 또는 고정</td>
		</tr>
<tr>
<td>비 강 맥락 막 게</td>
			<td>지 느 러 미</td>
			<td>코</td>
			<td>라이브 또는 고정</td>
		</tr>
<tr>
<td>시간적 맥락 막 게</td>
			<td>지 느 러 미</td>
			<td>임시</td>
			<td>라이브 또는 고정</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsin 그라데이션</td>
			<td>없음</td>
			<td>등, 복 부, 비 강, 시간적</td>
			<td>고정</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 깊은 랜드마크, 망막의 극 그들은 식별, 그리고 여부 그들은 라이브 또는 고정 조직의 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜 하 정확 하 고 확실 하 게 해 부 공간에서 격리 된 마우스 망막 깊은 눈 랜드마크, s opsin immunohistochemistry, Retistruct, 및 사용자 지정 코드의 사용에 대 한 포괄적인 해 부와 분석 가이드를 제공 합니다.

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

이 해부 프로토콜의 목적은 쥐 망막의 지형 방향에 대한 직근, 맥락막 균열 및 S-opsin 구배와 같은 안구 해부학적 랜드마크를 사용하기 위한 표준화된 방법론을 제공하는 것입니다. 이러한 기술의 주요 장점은 고립된 마우스 망막의 등쪽, 배쪽, 코 및 측두엽을 정확하게 식별할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 것입니다. 먼저 등쪽 각막, 각막 공막 경계 근처, 비강과 측두엽 사이의 한 지점을 확인합니다.가열된 소작 펜으로 각막을 1초 미만 동안 만지면 방향 확인을 위한 화상 자국을 만들 수 있습니다. 두 번째 눈에 대해 반복합니다. 등쪽 화상의 존재는 상직근을 식별할 수 있게 해줍니다.적출을 위해 구부러진 집게를 사용하여 안구를 안와에서 부드럽게 밀어내고 아래에서 지구본을 잡습니다. 그런 다음 소켓에서 지구본을 천천히 들어 올리면서 동시에 지구본이 소켓에서 분리될 때까지 왼쪽에서 오른쪽으로 부드럽게 움직입니다. 직근이 부착된 지구본을 해부 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다.양쪽 눈으로 작업하는 경우 어느 눈이 왼쪽 눈이고 어느 눈이 오른쪽 눈인지 추적해야 합니다. 해부 범위에서 등쪽 각막 화상을 시각적으로 찾고 이와 관련된 상직근을 식별합니다. 해부 가위나 20게이지 바늘을 사용하여 각막의 화상 자국에 구멍을 뚫습니다.그런 다음 상근을 이등분하기 위해 시신경을 향해 지구본을 깊게 자릅니다. 이 절단이 있는 고립된 망막이 여기에 표시되며, 이 절단으로 재건된 망막이 여기에 표시됩니다. 두 세트의 집게를 사용하여 망막의 일부가 노출될 때까지 천공으로 만든 구멍을 부드럽게 찢어 망막을 분리하기 시작합니다.그런 다음 공막이 완전히 제거될 때까지 공막과 망막을 분리하십시오. 망막이 완전히 분리될 때까지 홍채, 수정체, 유리체 및 남아 있는 모든 구조를 제거합니다. 등쪽 화상의 존재는 비강 및 측두엽 맥락막 열구를 식별할 수 있게 합니다.오른쪽 눈으로 작업하는 경우 비강 맥락막 열구는 화상 부위 오른쪽에 있고 측두 맥락막 열구는 화상 부위 왼쪽에 있습니다. 이것은 왼쪽 눈으로 작업하는 것과는 반대입니다. 맥락막 열구 랜드마크를 사용하여 망막 방향을 식별하려면 눈 뒤쪽에서 맥락막 열구를 찾아 식별합니다.눈이 여전히 마우스에 있는 것처럼 등쪽 화상 표시가 위쪽 극에 위치하도록 지구본의 방향을 지정합니다. 그런 다음 해부 가위나 20게이지 바늘을 사용하여 먼저 등쪽 화상이 있는 지구본에 구멍을 하나 뚫습니다. 다음으로, 등쪽 각막 화상이 있는 시신경을 향해 얕은 완화 절단을 합니다.그런 다음 시신경 쪽으로 다음 두 번의 깊은 완화 절단을 만듭니다. 하나는 해부 가위의 칼날을 눈 뒤쪽의 측두맥락막 열구선과 나란히 놓는 것이고, 다른 하나는 해부 가위의 날을 눈 뒤쪽의 비강 맥락막 열구선과 나란히 놓는 것입니다. 이러한 절단은 고립되고 재건된 망막에 표시됩니다.이러한 절단을 한 후 두 세트의 집게를 사용하여 망막의 일부가 노출될 때까지 천공 구멍을 부드럽게 뜯어냅니다. 해부 가위를 사용하여 망막이 평평하게 놓이도록 망막을 네 번 절개합니다. 신경절 세포가 위로 향하게 하여 망막의 각 모서리를 집게로 막에 부드럽게 눌러 니트로셀룰로오스 막에 망막을 장착합니다.그런 다음 겸자를 사용하여 장착된 망막을 24웰 플레이트의 첫 번째 웰에 포함된 4% 파라포름알데히드 1밀리리터에 담그십시오. 24웰 플레이트를 실온의 오비탈 셰이커에 놓고 정확히 40분 동안 망막을 고정합니다. 고정 후 1ml의 0.1 몰 PBS로 채워진 플레이트의 두 번째 웰로 망막을 옮기고 실온에서 15 분 동안 망막을 세척합니다.세척이 완료되면 장착된 망막을 1ml의 차단 용액이 들어 있는 다섯 번째 웰로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 토끼 항-S-opsin 1차 항체를 1에서 500의 농도로 차단 용액에 첨가하고 섭씨 4도에서 3일 동안 배양합니다. 3일간의 배양 후, 1ml의 PBS를 채운 6개의 웰에 10분씩 실온에서 순차적으로 넣어 망막에서 여분의 1차 항체를 6회 세척합니다.그런 다음 세척된 망막을 새 차단 용액이 있는 우물에 넣고 당나귀 항토끼 Alexa 594 2차 항체를 추가합니다. 2차 항체와 함께 망막을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후 이전과 같이 PBS에서 망막을 6회 세척합니다.겸자를 사용하여 장착된 망막을 PBS가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 망막이 더 이상 붙어 있지 않을 때까지 망막과 막 사이에 집게 끝을 부드럽게 삽입하여 니트로셀룰로오스 막에서 망막을 분리합니다. 유리 현미경 슬라이드를 PBS에 담그고 망막을 슬라이드에 띄우고 망막이 유리에 달라붙을 때까지 집게로 부드럽게 찔러 망막을 슬라이드에 장착합니다.슬라이드의 망막을 장착 매체로 덮고 1.5 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드를 슬라이드 트레이에 넣고 한 시간 동안 실온에 두십시오. 한 시간 후 슬라이드 트레이를 섭씨 4도에 놓습니다.슬라이드를 24시간 동안 덮은 후에는 매니큐어를 사용하여 슬라이드 측면을 밀봉하여 건조를 방지하십시오. 이것은 오른쪽 눈에서 분리된 망막이 S-opsin을 표지하기 위해 면역 염색되고 상피 형광 현미경으로 이미지화한 예입니다. 이 망막의 절단은 지형 방향이 S-opsin 구배에 의해 식별될 수 있기 때문에 임의적이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다.그런 다음 획득한 망막 이미지는 ReadiStruct 소프트웨어를 사용하여 디지털 방식으로 재구성할 수 있습니다. 이 이미지에서 원본 컷은 의사 색상의 빨간색입니다. 이 프로그램의 출력 파일이 망막을 올바르게 정렬하지 않습니다.맞춤형 매트 실험실 코드를 통해 망막을 실행한 후, 망막을 회전시켜 가장 높은 농도의 S-opsin 염색이 바닥에 배치되고 복부 망막으로 식별됩니다. 이 이미지는 왼쪽 눈의 망막을 보여줍니다. 측두극은 배쪽 극에서 시계 반대 방향으로 90도 떨어진 곳에 있고 코극은 복부 극에서 시계 방향으로 90도 떨어진 곳에 있습니다.일단 숙달되면 이러한 해부 기술은 적절하게 수행되면 단 몇 분 만에 쉽게 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 상직근, 맥락막 열구 또는 S-opsin 구배를 랜드마크로 사용하여 마우스 망막의 방향을 정확하고 안정적으로 지정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 눈 해부의 정식 데모는 망막 안료 상피의 전체 마운트의 결과.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

출처: Jagodzinska, J., et. al., Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo. J. Vis. 특급. (2017) &lt;br /&gt; 이 비디오에서는 SD-OCT(spectral-domain optical coherence tomography)를 사용하여 망막층을 이미지화하고 시신경병증이 있는 유전자 변형 마우스 모델의 구조적 변화를 평가하는 방법을 보여줍니다.

광간섭 단층촬영(Optical Coherence Tomography)을 사용한 마우스 망막의 In vivo 이미징

또한 안구 적출술라는 눈의 제거는, 그것은 돌이킬 수없는 부분 (단안) 또는 전체 (쌍안) 시력 손실을 유발하기 때문에 포유류의 시각 시스템에 따라 시각, 크로스 모달, 발달 가소성의 측면을 연구하기위한 유용한 전략을 제공합니다. 여기에서 우리는 생체 안구 적출술에서 수행 할 수있는 높은 재현성 및 간단한 방법을 설명합니다.

높은 재현성과 단순 명료 한 방법이 수행하는 생체 안구 탈핵

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

이 원고는 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월)와 마우스 망막의 비보에 이미징에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 몇 가지 검색 및 측정 방법 설명 peripapillary 지역에서 망막 신경 절 세포 (RGC)에 초점을 맞추고.

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

이 보고는 면역성 화학을 위한 동결된 마우스 망막 단면도를 준비하기 위한 포괄적인 방법을 기술합니다 (IHC).  설명된 방법은 안구 후방 컵의 해부, 파라포름알데히드 고정, 최적 절삭 온도(OCT) 매체 및 조직 배향에 포함, 단면화 및 면역 염색을 포함한다.

면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

여기에서는 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 생체 내 망막 및 안구 구조를 시각화하기 위해 스펙트럼 도메인 광학 간섭 단층 촬영 (SD-OCT)을 사용하는 방법을 설명합니다.

광학 간섭 단층 촬영을 사용한 설치류 모델에서 안구 질환의 생체 내 구조 평가

여기에서는 마우스에서 망막병증의 진단 및 정량적 측정을 용이하게 하기 위해 광학 간섭 단층 촬영을 사용하는 생체 내 이미징 기술에 대해 설명합니다.

망막병증의 마우스 모델에 대한 광학 간섭 단층 촬영의 적용

이 논문은 설치류의 안구 미세 해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 과정에는 니티팅 멤브레인(즉, 세 번째 눈꺼풀)과 함께 안구의 적출술이 포함됩니다. 그런 다음 후방 안구 컵과 전방 안구 컵을 분리합니다.

설치류 눈의 미세 해부

본 프로토콜은 in vivo 이미지에서 관찰된 망막 신경절 세포 축삭 다발 형태를 검증하기 위한 목적으로 in vivo 가시광선 광간섭 단층 촬영 fibergraphy(vis-OCTF) 이미지를 동일한 마우스 망막의 ex vivo 공초점 이미지와 정렬하는 단계를 설명합니다.

Align of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina(가시광선 광간섭 단층 촬영 파이버그램과 동일한 마우스 망막의 컨포칼 이미지 정렬)

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

학습하세요 마우스 망막의 정확한 공간적 방향 분석을 위한 해부 및 면역조직화학 기법. S-opsin 그라데이션과 안구 해부학적 랜드마크를 활용하여 배측, 복측, 비측, 측두측을 식별하는 표준화된 방법론을 익히세요.

어디 당신이 문제: 한 해 부 자르고 눈 랜드마크에서 마우스 망막의 공간적 방향에 대 한 분석 가이드

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