Name: 데이터베이스 가이드-cytometry 골 골수성 세포 성숙의 평가 위한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: 배우세요 다중매개변수 유세포분석법을 사용하여 골수성 세포 성숙을 평가하고 골수형성이상증후군 진단 정확도를 향상시키는 방법을. 이 기술은 연구자의 주관성을 줄이고 정량적 데이터를 제공합니다.

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이 연구에 사용 된 항 체는 BD 생물 과학에 의해 제공 되었다. 저자는 그들의 동료, 박사 Pascale Flandrin-Gresta에서 부의 분자 생물학, 혈액학 연구소, 대학 병원의 세인트 에티엔느, 프랑스, NGS 데이터의 두 번째에 대 한 해석에 대 한 전문성을 제공 감사 하 고 싶습니다. MDS의 경우입니다. 저자는이 연구에 참여 하도록 그들의 계약에 대 한 건강 한 기증자와 환자에 대 한 그들의 관심과이 연구에 참여 한 임상 hematologists에 대 한 감사. 저자는 또한 간행물에 대 한 재정 지원에 대 한 "Les Amis de 레미" 재단을 감사 하 고 싶습니다.

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<li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li>
<li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group%29%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li>
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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다. Cytometry 부서, 세인트 에티엔느의 대학 병원에서 혈액학 연구소 EuroFlow 컨소시엄의 구성원입니다.

BM aspirate의 품질 최종 결과에 영향을 줄 수 있습니다. BM aspirate의 hemodilution 창시자의 부재로 인해 성숙의 다른 단계에 있는 세포 또는 선구자 세포의 분포를 왜곡 수 있습니다. 아마 채용 방법 lysing 대량 흐름 cytometric 분석에서 hemodilution에 대 한 BM aspirates의 정상화에 도움이 됩니다. 또한, cytometry 의해 BM 골수성 dysplasia의 평가 위한 중요 한 단계는 샘플 처리 및 얼룩, 데이터 수집 및 해석2,3. 샘플 처리 및 얼룩 BM 수확 후 72 h까지 수행 되어야 한다. 데이터 한다 취득, 선호, 얼룩 직후 또는 교류 cytometer에서 측정까지 1 시간 더 이상에 대 한 빛에서 보호 4 ° C에서 샘플을 저장할. 데이터베이스 기반 해석 BM 골수성 세포 성숙의 주관적인 평가 피할 수 있습니다.
<p class="jove_co...

Phenotypic 마커 골수성 세포에서 발생 하는 MDS 개시 및 진행 하는 동안 dysplastic 변화에 특정의 부재, 새로운 접근의 성숙 경로 (변경 된 식의 평가에 따라 최근 몇 년 동안에서 제안 되었습니다. 성숙한 골수성 세포의 생산 동안 골수성 항) 또는 다른 종류의 세포 골 수 (BM) 내에서 비정상적인 분포의 세포 구획1,2.
이 문서는 BM 골수성 세포 구획 형성 증후군 (MDS) 또는 다른 골수성 혈액 질병에 관련 된에서 dysplastic 변화를 감지 하기 위해 MFC의 표준화 된 응용 프로그램에 대 한 새 메서드를 제공 합니다. 이 연구는 또한 성숙 데이터베이스를 사용 하 여 MFC 데이터 분석에 대 한 유틸리티를 보여 줍니다.
샘플 준비 절차, 데이터 수집, 데이터베이스를 사용 하 여 분석의 표준화 관련 BM 골수성 세포에서 dysplastic 변화에 가장 관련성이 높은 phenotypic 이상 식별을 수 있습니다. 따라서, 잘 분류 하 고 잘 인식 형식 (자동 인구 구분 (AP) 다이어그램, 히스토그램, 점 작)에 따라 통계적으로 선택한 하위 집합은 이후 분석에 사용할 수 있는 분석 전략 개발에 필요한 반올림합니다. MDS에서 강력한 phenotypic 이상이 발견 경우에 함께 또는 최소한의 형태 발육 이상 없이 cytogenetic aberrancies 없이 진단을 쉽게 것 이다. 차별 매개 변수 immunophenotypic 패널의 감소에 대 한 허용의 현재 점수2, 임상 병 리 실험실에서 그들의 적용을 허용 단순화할 수 있습니다.
이 방법으로 MDS 진단3신호 cytometry 데이터의 주관적인 해석을 제한 합니다. 이 단계는 처리 흐름 데이터4를 분석 하기 위한 자동화 도구 개발을 위한 전제 조건입니다.
MDS에 있는 spliceosome 돌연변이를 MDS 형 특정 epigenetic 한정자와 협력 하는 클론 조 혈 줄기 세포 (HSC) 무질서의 이질적인 그룹으로 구성 됩니다. 그것은 지금, HSC 돌연변이, 함께 다른 메커니즘 MDS 이상, 정도 벗어난 면역 중재 염증 등 악성 HSCs는 BM의 실질 microenvironment 사이 상호 작용에에서 관련 된 알려져 있다. 그러나, 이러한 메커니즘 제대로 이해 남아 있다. MDS의 넓은 임상과 생물학이 도전 진단과 최적의 치료의 선택은. 지난 10 년간에서 여러 연구 MFC는 종종 더 많은 형태, 기술적, 경제적 제약 보다 발육 이상2 감지에 민감한 어렵게이 기술을 표준화, 결과 따라 자주 하는 3통역 경험입니다. 또한, 그것은 불분명 얼마나 MFC는 다른 비 클론 BM에서 경우 또는 최소한의 형태 발육 이상 없이 및 cytogenetic 변칙의 부재 또는 hypocellular MDS, 낮은 폭발 카운트와 같은 경계선 경우 MDS 향해 균형 팁 수 있습니다. 골 수 오류 장애 (즉., aplastic 빈 혈). 그것은 또한 급성 골수성 백혈병 (AML) 폭발의 초과 MDS의 경계선 경우를 구분 하기 어려운 남아 있다. 모든 이러한 이유로, MFC 테스트 MDS 최종 진단에 임상 지침 통합 하지 않습니다. 2011 년에 미국 국립 종합 암 네트워크 (NCCN) CD34 + 세포의 비율, 발작 야행성 hemoglobinuria 클론의 검색 및 hypocellular MDS5에서 세포 독성 T 세포 클론의 존재의 추정에 대 한 MFC를 권장. 이러한 두 가지 후자의 경우는 또한 임상 데이터 면역 치료6이러한 환자 들의 좋은 반응을 보여왔다 때문에 치료 목표를 포함 한다. 국제 작업 그룹 (IWG) 권고를 인용 2017 NCCN 가이드라인, 나열 MDS 진단 하지만 모든 사양6하지 않고 공동 기준 사이에서 MFC에 의해 탈 선 immunophenotyping 탐지. 또한, 최근 발표 된 WHO 분류 규정 MFC 결과 혼자 결정적인 형태학 및 cytogenetic 데이터7의 부재에서 MDS의 기본 진단 설정 충분 하지 않습니다. 그러나 MFC 골수성 세포의 dysregulation 성숙 패턴을 보여주는 고 질병 과정에서 특정 시간에 환자에 대 한 정상에서 "거리"를 측정 하는 추가 테스트로 사용할 수 있습니다.
이 방법은 MFC immunophenotyping를 사용 하 여 MDS 또는 dysplastic 이상으로 다른 골수성 질환에서 진단 구체화 BM 골수성 세포에서 형성 평가에 관심이 있는 임상 실험실에서 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>SN:</td> V33896301336 <td>3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td></tr><tr><td>Awel C48-R Centrifuge</td><td>AWEL Industries, FR</td><td>SN: 910120016; 모델 번호 : 320002001</td><td>저속 원심 분리기; 용량 60 FACS 튜브</td></tr><tr><td>10 &micro의 피펫; L 및 200&마이크로; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 팔콘 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리 프로필렌 튜브 FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 Anti-Human HLA-DR</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>655874</td><td>클론 L243 마우스 BALB / c IgG2a, &kappa; Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD45</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>560777</td><td>클론 HI30 Mouse IgG1, &kappa; Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD16</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656146</td><td>클론 CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD13</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>347406</td><td>클론 L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &kappa; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>347222</td><td>클론 8G12 Mouse BALB/c IgG1, &kappa; Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD117</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>339217</td><td>클론 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD11b</td><td>BD Biosciences, 미국 캘리포니아333143</td><td></td><td>클론 D12 마우스 BALB/c IgG2a, &kappa; D12, 형광 색소 APC (예 : 최대 650 nm / Em max 660nm</td></tr><tr><td>마우스 Anti-Human CD10</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>646783</td><td>클론 HI10A Mouse BALB / c IgG1, &kappa; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD35</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>555452</td><td>클론 E11 Mouse IgG1, &kappa; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD64</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>644385</td><td>클론 10.1 Mouse BALB/c IgG1, &kappa; 형광 색소 PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>마우스 Anti-Human CD300e</td><td>Immunostep</td><td>IREM2A-T100</td><td>클론 UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>마우스 Anti-Human CD14</td><td>BD Biosciences, 미국 캘리포니아641394</td><td></td><td>클론 MoP9 마우스 BALB/c IgG2b, &kappa; 형광 색소 APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD36</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656151</td><td>클론 CLB-IVC7 Mouse IgG1, &kappa; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD105</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>560839</td><td>클론 266 Mouse BALB/c IgG1, &kappa; Fluorochrome PE (Ex 최대 496 nm/ Em 최대 578 nm)</td></tr><tr><td>마우스 Anti-Human CD33</td><td></td><td>345800</td><td>클론 P67.6 마우스 BALB/c IgG1, &kappa; Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD71</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>655408</td><td>클론 M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>용해 용액 10x Concentrate (IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>FACSFlow Sheath Fluid</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva CS& T IVD beads</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656046</td><td></td></tr><tr><td>RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td><td>Cytognos, Salamanca, Spain</td><td>SPH-RCP-30-5A</td><td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td></tr><tr><td>보상 입자 Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td><td></td></tr><tr><td>Diva 소프트웨어 버전 6.1.2 및 6.1.3</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제</td><td>R& D Systems, 미국 미니애폴리스</td><td>5564</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민&nbsp;( BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide 99%</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>199931</td><td></td></tr><tr><td>Infinicyt 소프트웨어 버전 1.8.0.e</td><td>Cytognos, Salamanca, Spain</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

데이터베이스 가이드-cytometry 골 골수성 세포 성숙의 평가 위한

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

프랑스 Cytometry 협회 (AFC)에서 시작 하는 작업 그룹 프랑스에서 골수성 질환 진단을 위한 multiparameter cytometry (MFC) 응용 프로그램을 조화 하기 위하여 개발 되었다. 여기에 제시 된 프로토콜 6 프랑스 진단 실험실 (대학 병원의 세인트 에티엔느, 그 르노 블, 클레르몽페랑, 니스, 그리고 릴과 인 바울은 Calmettes에 합의 하 고 2013 년 9 월과 11 월 2015 사이의 적용 했다 마르세유) 골 수 샘플 준비 및 데이터 수집의 표준화를 허용. 3 성숙 데이터베이스 neutrophil, monocytic, 및 erythroid 계보 골 수 기증자가 "건강 한" 개인 (개인 조 혈 질환의 증거 없이)에서 함께 개발 되었다. 각 골수성 혈통에 대 한 분석의 강력한 방법 일상적인 진단 사용 하기 위해 적용 해야 합니다. 새로운 경우 동일한 방식으로 분석 하 고 일반적인 데이터베이스와 비교 수 있습니다. 따라서, 양적 및 질적 phenotypic 이상이 확인 될 수 있다 고 정상적인 골 수 샘플의 데이터와 비교 하는 2SD 위에 병 리의 지표로 고려 되어야 한다. 주요 제한은 hybridoma 기술에 기반 하 고 현재 임상 진단에 사용 되는 방법으로 얻은 단일 클론 항 체를 사용 하 여 달성 하는 데이터 간의 높은 가변성입니다. 데이터 취득 기술 유효성 검사에 대 한 기준을 설정 MDS 진단에 대 한 MFC의 유틸리티를 개선할 수 있습니다. 이러한 기준의 설립 데이터베이스에 대 한 분석을 요구 한다. 데이터 분석에서 조사 주관의 감소는이 방법의 중요 한 장점입니다.

K-EDTA 응고 제에는을 걷이 54 BM 샘플 연구에 포함 됐다. MFC 데이터는 환자에 대 한 어떤 정보가 없을 경우에 분석 되었다. 회고전 연구 BM 샘플 (5 남성 및 47.4 [35-48]의 중간 나이 2 여성, 11 (8 남성과 57.9 [35-72]의 중간 나이로 3 여성) 조 혈 질환의 증거 없는 개인과 다양 한 36 경우 7 건강 한 기증자 로부터 나타났다 병 적인 조건: 1 경우 빈 혈과 낮은 크 수준, 3의 경우 빈 혈과 높은 크 수준, 빈 혈, 염증의 경우 8 1 경우 빈 혈으로 인 한 비타민 B12 결핍, 빈 혈 ± 4 경우 기인한 다른 cytopenias 간 손상, 자가 면역 용 혈 3 경우, idiopathic thrombocytopenic 혈관 5 경우, 대 식 세포 활성화 증후군 1 경우, 림프 종 치료 (최소 잔여 질병 &lt; 0.01%) 후 완전 한 사 함 3 경우, 7의 경우 혈액 장애 (4 MDS, 1 급성 골...

MDS 진단 기준 형태학 또는 비 유익한 세포 유전학의 부재에 어렵습니다. MFC는 MDS 진단 과정을 구체화 도움이 될. 임상 연습에 유용 될, MFC 분석 기반으로 해야 합니다 매개 변수 충분 한 특이성 및 감도, 그리고 데이터 다른 연산자 사이 재현 되어야 합니다.

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

이 방법은 골수성 세포 혈통의 성숙 이상으로 진화하는 골수증 증후군 또는 그밖 혈액학 질병과 같은 골수성 질병의 진단에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석 및 해석에서 조사자의 주관성을 감소시키는 것입니다. 이 방법은 myelodysplasia에 대 한 가장 차별 매개 변수에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.그것은 정상적인 골수성 세포 집단에서 차이의 정량화를 허용합니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 박사 후 동료 인 Tiphanie Picot가 될 것입니다. 먼저 1차 세포 샘플의 600마이크로리터를 15밀리리터의 세정 버퍼와 혼합하여 15밀리리터 원심분리및 세척당 10밀리리터의 신선한 세척 버퍼를 넣습니다.두 번째 세척 후, 400 마이크로리터의 신선한 세척 완충제에서 펠릿을 다시 중단하고, 백본 항체의 전체 패널을 포함하는 5밀리리터 폴리프로필렌 FACS 튜브로 세포 현탁액의 350 마이크로리터를 이송한다. 세포를 철저히 혼합한 후, 파이펫은 세포 항체 용액의 동일한 부피를 3개의 새로운 폴리프로필렌 튜브로 가져와 필요에 따라 신선한 세척 버퍼로 최대 200 마이크로리터의 각 튜브에 최종 부피를 가져옵니다. 다음으로, 혼합과 관심있는 세포 표면 마커에 대한 적절한 항체의 적절한 부피를 실내 온도에서 30 분 배양하여 빛으로부터 보호합니다.인큐베이션이 끝나면 라이싱 용액 2밀리리터를 혼합하여 실내 온도에서 10분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 원심분리에 의해 용액 세포를 수집하고 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브의 마지막 50 마이크로 리터를 제외한 모든 것을 폐기하십시오. 나머지 상수체에 펠릿을 다시 일시 중단하고 부드러운 혼합으로 각 샘플에 신선한 세척 버퍼 2 밀리리터를 추가합니다.두 번째 세척 후, 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브에 약 50 마이크로 리터 잔류 볼륨을 남기고, 슈퍼 나탄을 폐기하십시오. 즉각적인 분석을 위해 PBS의 200 마이크로 리터에서 혼합을 통해 펠릿을 다시 중단합니다. 유동 사이토미터에서 샘플을 읽으려면 먼저 유동 사이토미터 소프트웨어에서 새 실험을 열고 이름, 샘플 유형 및 날짜에 따라 실험이름을 바꿉니다.3개의 튜브에 대한 새로운 표본을 만들고 실험 레이아웃에서 각 튜브에 사용되는 항체를 지정한다. 사이토미터 설정을 열고 응용 프로그램 설정을 선택하여 월별 설정에서 얻은 값을 적용합니다. 새로운 글로벌 워크시트를 열고 단일 세포를 게이팅하는 데 적합한 점 플롯을 만들뿐만 아니라 과립구, 단세포, 폭발 및 림프구 집단을 만듭니다.보상 컨트롤에 대한 새 전역 워크시트를 만듭니다. 그런 다음, 각 튜브에서 500, 000 이벤트를 중간 획득 속도로 획득하여 기술 검증 후 FCs 3.0 파일로 데이터를 내보냅니다. 새 분석을 시작하기 전에 일반 골수 데이터를 포함하는 cyt 파일을 다운로드하여 호중구, 단낭식 및 핵적 인 적색 혈통및 분석 파일을 inp 형식으로 다운로드하십시오.그런 다음 데이터를 데스크톱에 저장합니다. 호중구 성숙을 데이터 베이스에 저장하기 위해 먼저 Infinicyt 소프트웨어를 열고 호중구 성숙 데이터에 해당하는 cyt 파일을 엽니다. APS 그래프에 성숙 경로를 그리고 호중구의 성숙 경로를 데이터베이스에 저장합니다.분석해야 하는 호중구 혈통 성숙을 위한 fcs 파일을 엽니다. 프로파일 탭에서 호중구 성숙 성 개시 파일을 업로드합니다. 이 계보에 대한 분석은 세 단계로 나뉩니다.CD34 양성, 호중구 커밋 된 폭발의 선택으로 시작합니다. 이를 목표로 7개의 게이트의 교차를 사용하여 CD34 긍정, CD117 긍정, HLADR 로우, CD10 음수, CD13 양성, CD11b-음수 이벤트를 선택할 수 있도록 합니다. CD117 양성, CD34 음성 호중구 전구체의 선택으로 분석을 계속한다.더 성숙한 호중구 세포의 선택으로 분석을 계속합니다. 다음으로, 단핵 계보 세포의 분석을 보여 준다. APS 그래프에 성숙 경로를 그립니다.성숙감을 나타내는 화살표가 미성숙, 단세포 세포, CD14 음성, IREM2 음성, 성숙한 단핵구, CD14 양성, IREM2 양성으로부터 지향되는지 확인한다. 데이터베이스에 단화 혈통에 대한 성숙 경로를 저장합니다. 분석해야 하는 단화 계보 성숙을 위해 fcs 파일을 엽니다.단화 계보 분석을 위해 프로필을 업로드합니다. 단세포 계보 세포를 식별하려면 CD64 긍정 하이, CD117 긍정, CD117 음수, HLADR 양성 이벤트를 선택할 수 있는 4개의 게이트의 교차점을 사용합니다. 이러한 이벤트를 모집단 계층 구조 트리의 단화 탭에 할당합니다.NRC 데이터베이스에 저장해야 하는 NRC cyt 파일을 엽니다. APS 그래프에 성숙 경로를 그리고 핵으로 된 적혈구 성숙 경로를 데이터베이스에 저장한다. 분석해야 하는 FC 파일을 엽니다.프로파일에서 핵적 인 적혈구에 대한 분석 템플릿을 업로드합니다. 이 계보에 대한 분석은 두 단계로 나뉩니다. CD34 양성의 선택으로 시작, 에리스로이드 커밋 폭발.여기서, CD34 긍정, CD117 긍정, HLADR 로우, CD105 긍정, CD33 네거티브, CD36 양성, CD71 양성 이벤트를 선택할 수 있도록 7개의 게이트의 교차를 사용합니다. 이러한 이벤트를 인구 계층구조의 NRC 탭에 할당합니다. 가시성에서 CD34 포지티브 에리스로이드 커밋된 폭발을 제거합니다.더 성숙한 적혈구를 식별하려면 CD45 음수 및 CD45 양성 낮은, 측면 산란 저, CD36 양성 높은 CD71 의 차별을 허용하는 네 개의 게이트의 교차점을 사용합니다. 이어서, CD36 높은 측산란을 핵적적 세포로부터 낮은 혈소판을 제거하고, NRC 탭에 이 집단을 할당한다. 골수 구획에서 골수성 성숙을 평가하기 위해 평가해야 하는 경우로부터 관심의 계보에 해당하는 시동 파일을 엽니다.모집단 계층 구조 트리에서 호중구 탭에 할당된 이벤트만 표시합니다. APS 그래프에 성숙 경로를 그리고 일반 골수에서 호중구의 성숙에 대응하는 데이터베이스를 로드하고 데이터를 비교합니다. 데이터가 적어도 부분적으로 호환되는 경우 소프트웨어는 성숙 차이를 시각화하기 위해 정규화된 성숙 차이 다이어그램과 매개 변수 대역을 만듭니다.골수 구획의 단핵구 성숙을 비교하기 위해, 단핵세포 데이터베이스를 포함한 정상 골로의 데이터와 함께 새로운 케이스에 대해 단핵 세포 계보에 해당하는 cyt 파일을 엽니다. 모집단 계층 구조 트리의 단핵구 탭에 할당된 이벤트만 표시하고 APS 그래프에 성숙 경로를 그립니다. 일반 골격 에 단핵구 성숙에 대응하는 데이터베이스를 로드하고 데이터를 비교합니다.골수 구획에서 핵으로 된 적혈구 성숙을 비교하기 위해, 새로운 경우, NRC 데이터베이스에 포함된 정상 골로의 데이터와 함께 NRC의 혈통에 해당하는 cyt 파일을 엽니다. 인구 계층 구조 트리의 NRC 탭에 할당된 이벤트만 표시합니다. 그리고 APS 그래프에 성숙 경로를 그립니다.정상적인 골격 에 NRC 성숙에 해당하는 데이터베이스를 로드하고 데이터를 비교합니다. 그런 다음 데이터베이스에 포함된 새 파일과 데이터 간의 차이점의 중요성을 시각화하려면 정규화된 성숙 차이 및 확대/축소를 클릭합니다. 흐름 사이토메트릭 데이터 분석에서 계층적 분류 알고리즘을 사용하는 방법은 세포 집단 중복에 포함되지 않기 때문에 매우 주관적이고 본질적으로 부정확하다는 것을 기억하십시오.골수성 정상 성숙 데이터베이스에 대하여 MDS인 것으로 의심되는 사이토페니아의 새로운 케이스의 평가는, 세포학 또는 세포원 이상 없이 조차 호중구, 단세포 및 NRC 혈통의 비정상적으로 표현된 성숙 항원의 확인을 허용합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 표준화 된 방식으로, 월별 사이토미터 설정, 일일 검사를 수행하고, 사용하기 전에 항체를 엄격하게 피펫하고, 염색 시간을 존중하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 나침반과 같은 다른 방법은 다른 사례 그룹을 비교하고 특정 사례 그룹에 대한 최종 타이픽 인쇄물과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 이형성 공정에 안정적으로 관련된 최종 타이픽 변화를 식별하기 위해 불확실한 잠재력의 클로널 혈종의 경우, 골수성 세포 성숙 패턴을 탐구에 관심이 연구자에 대한 길을 포장. 건강한 기증자의 데이터 수가 증가함에 따라 데이터베이스를 업데이트하면 분석의 견고성이 향상될 수 있습니다.

database-guided-flow-cytometry-for-evaluation-bone-marrow-myeloid

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

여기에 제시된 것은 세포 분열 수, 표면 세포 표현형 및 세포 친족 관계를 동시에 측정할 수 있는 유세포 분석 기반 기술입니다. 이러한 속성은 순열 기반 프레임워크를 사용하여 통계적으로 테스트할 수 있습니다.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

본 프로토콜은 마우스에서 매우 균일한 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)를 정제, 확장 및 특성화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 증식 및 분화 가능성이 높은 BMSC를 대량으로 획득할 수 있도록 하여 마우스 모델을 지원하고 전임상 연구를 발전시킵니다.

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

이것은 골수양 유래 억제 세포 (MDSC)를 immunophenotyping 및 GR-1 풍요로운의 신속하고 포괄적인...

유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성

배우세요 다중매개변수 유세포분석법을 사용하여 골수성 세포 성숙을 평가하고 골수형성이상증후군 진단 정확도를 향상시키는 방법을. 이 기술은 연구자의 주관성을 줄이고 정량적 데이터를 제공합니다.

데이터베이스 가이드-cytometry 골 골수성 세포 성숙의 평가 위한

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