Name: Vivo에서 Microdialysis 메서드를 잘라 높은 분자 무게와 뇌 간 질 성 액체에서 큰 Extracellular 단백질을 수집 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 학습하세요 생쥐 뇌 간질액에서 고분자량 단백질을 수집하는 생체 내 마이크로다이얼시스 기법을 통해 신경신호전달 및 노폐물 제거 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기술은 각성 상태의 자유롭게 움직이는 동물에서 실시간 분자 동태 분석이 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품에 의해 지원 되었다 ' 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 분야 (뇌 단백질 노화와 치 매 Control)(15H01552) 문 부 과학성 및 특정에 대 한 젊은 과학자 (B) (16 K 20969)에서. 저자가이 방법의 개발 기술 자문에 대 한 박사 데이비드 M. Holtzman 및 박사 존 R. Cirrito를 감사.

모든 동물 연구 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 도쿄 대학에서 대학원 학부의 위원회에 의해 승인 했다.
1. 사전 수술
<ol><li>수술 시작 하기 전에 모든 멸 균 상태를 유지 하기 위해 70% 에탄올과 닦아 합니다. 열 지원 난방 패드를 사용 하 여 것이 좋습니다.</li>
	<li>Chloral 하이드 레이트 (400 mg/kg)의 복 주입 하 여 쥐를 anesthetize. 발가락 핀치를 수행 하 여 anesthetization를 확인 합니다. 적어도 24 h에 대 한 meloxicam SR 유도 및 복구 입찰 시 buprenorphine의 사용을 권장 합니다.</li>
	<li>수술 깎기로 머리를 면도. 마우스에 신생아 쥐 어댑터 귀 바와 코 클램프를 사용 하 여 마우스를 수정 합니다. 참고: 그것은 중요 되도록 마우스 머리가이 단계에서 보안 측면-의해-측면을 이동 하지 않습니다.</li>
	<li>수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.</li>
</ol>2. stereotaxic 수술 가이드 정 맥 주입에 대 한
<ol><li>Stereotaxic 장치에 마우스 및 신생아 쥐 어댑터를 설정 합니다. 이상 하 게 절 개 sagittally 피부에 메스를 사용 하 여 두개골.　혈액과 젖은 면봉을 사용 하 여 두개골에 결합 조직 닦아내십시오.</li>
	<li>뇌 아틀라스를 사용 하 여 관심사의 뇌 영역에 대 한 좌표를 결정 합니다. 측정을 시작 하기 전에 있는지 확인 그 중간 스트레이트 드릴 비트 수 있도록 A P을 이동 하 고 전체 시간 중간 봉합에 남아 있다. 참고:이 문서에 대 한 좌표를 사용 하 여 (A / p:-3.1 m m, M/l:-2.5 m m, D/v:-1.2 m m, 12도) 후부 해 마를 대상으로.</li>
	<li>레벨 두개골 A-P<ol>
<li>Stereotaxic 프레임의 조작에 드릴을 연결 합니다. 부드럽게 람다 접촉 될 때까지 훈련을 낮은 고 복 부의 좌표를 기록 합니다. Bregma에 대 한이 절차를 반복 합니다. 참고: 두개골을 파괴 하는 때 bregma의 수직 측정은 람다의. 아니라면, 그에 따라 코 클램프의 높이 조정 합니다. 두개골을 파괴 되 면, 후 bregma에 앞쪽/후부, 측면 좌표를 기록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레벨 해골 왼쪽-오른쪽<ol>
<li>좌표에 드릴 bregma에서 이동 (A / p-3.1 m m, M/l:: + 2.0 m m), 낮은 두개골에 드릴 및 세로 좌표를 기록. 좌표에 대 한 다음이 절차를 반복 (A / p-3.1 m m, M/l::-2.0 m m). 참고: 두개골을 파괴 하는 경우는 중간에서 두 개의 등거리 점의 수직 측정이. 그렇지 않으면, 귀 바의 높이 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대상 좌표에 신중 하 게 버 구멍 (A / p-3.1 m m, M/l::-2.5 m m) 가이드 정 이식 하. 버 구멍의 지름을 가이드 정 맥 주입을 위해 충분히 큰 경우, 첫 번째와 겹치는 다른 구멍을 드릴 합니다. (Contralateral 오른쪽) 정수 리 뼈에 다른 구멍을 드릴 하 고 1.10 (참조 그림 1B)에 치과 시멘트를 확보 하는 데 도움이 뼈 나사를 삽입 합니다.</li>
	<li>면도날에 의해 1.5 mL 원심 분리기 튜브의 뚜껑의 뒷면에서 원형 잠금 조각을 삭감 하 고 '크라운 '. 이 크라운 치과 시멘트 피부에 확산 방지 하기 위해 사용 됩니다. 2.5 단계에서 만든 버 구멍 원 ( 그림 1참조) 내에서 유지 되도록 그것을 두개골에 놓습니다.</li>
	<li>가이드 정 stereotaxic 어댑터의 짧은 팔에 둬서 stereotaxic 어셈블리를 설정 하 고 캡 너트를 사용 하 여 고정. 전극 클램프 stereotaxic 어댑터의 긴 팔을 설정 합니다. (참조 그림 1A) stereotaxic 기구의 조작에 연결 합니다.</li>
	<li>12도 (참조 그림 1B)에 의해 조작 팔에 D V stereotax 어셈블리를 회전 합니다. 1.6에서 만든 버 구멍 가이드 정을 이동 합니다. 삽입 가이드 정 천천히 두뇌에 1.2 m m로 낮추어. 참고: 조사 각도 특정 해 마; 다른 지역 다른 각도 또는 아무 각도 모두 필요할 수 있습니다. 정확한 좌표 뇌 아틀라스를 참조 하십시오. 때문에, 두개골의 표면 건조 하지 시멘트 충실 하지 것입니다 경우 시멘트 모자 제거 될 수 있다</li>
	<li>완벽 하 게 커버 가이드 정 및 뼈 나사를 그들 만큼의 두 금속 부분에 크라운 내 치과 시멘트를 추가 합니다. 거기 노출 두개골의 일부인 경우 추가 치과 시멘트를 적용 합니다.</li>
	<li>치과 시멘트 완전히 건조 될 때까지 기다립니다 (12 ~ 20 분). 전극 클램프에서 stereotaxic 어댑터를 제거 합니다. 캡 너트를 제거 하 고 더미 프로브 stereotaxic 어댑터를 장착 하 고 캡 너트를 고정.</li>
	<li>Stereotaxic 장치에서 마우스를 놓고 마우스 개별 장에 혼자 집. 참고: 마우스 하지 맡겨야 한다 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. Microdialysis의 날까지 매일 마우스를 확인 합니다. 마우스는 고통에 있을 경우 carprofen 같은 NSAIDs를 받습니다. 2 주 대기 이므로 수 면-각 성 연구에 필요한 마우스 익숙해집니다 새로운 환경10하지만 연구의 짧은 회복 기간 (예를 들어, 1-2 일)를 요구할 수 있습니다.</li>
</ol>3. Microdialysis 설치
<ol><li>검색의 품질 확인: 채우기 증류수 waterand와 일회용 1 ml 주사기 byton 튜브를 사용 하 여 프로브의 콘센트 (짧은 포트)에 연결. 손가락으로 환기 구멍을 커버 하 고 프로브를 물에 부드럽게 주사기 플런저를 우울 하 게. 확인 그 물 프로브 입구에서 나타나고 microdialysis 막의 표면에 아무 누설도 있다.<ol>
<li>활성화 프로브: 프로브 에탄올 (70-100%)에서 막 2 초 동안 잠수함. 그런 다음, 달 이다 증류수 프로브로 다시 주사기로 다시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관류 버퍼의 준비: 대상 분자는 튜브의 접착을 방지 하기 위해 추가 하 여 BSA diluting 인공 CSF (1.3 m CaCl2m, 1.2 m m MgSO4, 3 m KCl m, 0.4 m m KH2포4, 25mm NaHCO3와 4%로 30 %BSA 솔루션 , 122 mM NaCl, pH = 7.35), CSF, 즉시 사용 하기 전에 전해질 농도 밀접 하 게 일치. 0.1 µ m 기 공 크기와 주사기 필터 장치를 통해 관류 버퍼 필터링. 참고: 4 %BSA 단백질을 고정에 대 한 복구 향상 하지만 특히 높은 BSA 바인딩 있는 화합물에 대 한 화합물의 배달을 제한할 수 있습니다. 이것은 특정 인스턴스3BSA (0.15%) 등의 낮은 농도 사용의 장점 중 하나 이다. 유의 하십시오 소용돌이 또는 저 어 접시에 의해 흥분 할 때 BSA 아주 쉽게 집계 수 있습니다. 이러한 집계 프로브 또는 막 숨 구멍 방해할 수 있습니다. 이 집계를 제한 하는 BSA 솔루션을 준비할 때 주의 사용 하 여</li>
	<li>입구와 출구 (참조 그림 1C)에 대 한 두 별도 줄을 준비 하 고 연결 바늘으로 두 라인을 연결. 관류 버퍼 가득 일회용 3 mL 주사기를 무뚝뚝한 끝 바늘을 사용 하 여 튜브의 입구 끝으로 연결. 관류 버퍼 전체 튜브 주사기 펌프를 실행 하 여 입력 합니다.</li>
	<li>주사기 펌프를 중지 하 고 단계 3.3 (참조 그림 1C)에서 활성화 된 microdialysis 프로브 입구 선과 콘센트 선 사이 연결 바늘을 바꿉니다. 이 교체 하기 전에 프로브에 cap 너트를 넣어.</li>
	<li>롤러 펌프에 콘센트 배관에 롤러 튜브를 탑재 합니다. 10 µ L/min에서 주사기 펌프 그리고 약간 느린 흐름 율 (9.5-9.8 µ L/min)에 롤러 펌프를 시작 합니다. 조사 들어가면 복구에 영향을 미칠 수 있습니다 전체 배관에서 모든 기포를 제거 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>1.2 단계에서와 같은 방법에 단계의 1.12 마우스를 anesthetize. 마우스 칼라는 목 주위를 넣어. 캡 너트 및 더미 검색 제거 하 고 천천히 가이드 정 통해 3.4에서 microdialysis 프로브를 삽입 하 고 캡 너트를 고정.</li>
	<li>장소는 새 장에 마우스 무료 이동 시스템 및 밧줄 칼라 마우스 연결. 계속 주사기 펌프 및 롤러 펌프 3.5 이상 1 h 단계에서 표시 된 유량에서 실행. 참고: 깨어 동물에서 ISF 컬렉션을 달성,이 기사 사용 무료 이동 시스템 케이지 자체 왜곡에서 튜브를 유지 하는 동물의 움직임에 응답 합니다. 또는 액체 회전 다양 한 회사에서 사용할 수는 또한 사용 될 수 있다.</li>
	<li>롤러 펌프 먼저 중지 한 다음 주사기 펌프. 원하는 흐름 속도 설정 합니다. 주사기 펌프 20% 롤러 펌프 보다 더 빠르게 실행 합니다. 참고: 예를 들어, 1 µ L/min에서 실행 하는 경우 주사기 펌프에서 작동 1.2 µ L/분 최적의 유량 각 분자에 대 한 실험적으로 결정 되어야 한다.</li>
	<li>ISF 샘플 수집: 냉장된 분수 수집기에 콘센트 배관의 자유로운 끝을 배치. 참고: 적절 한 샘플 볼륨 분석 실험 분석에 사용에 따라 다릅니다.</li>
	<li>실험의 완료 후 프로브를 제거 합니다. (Anesthetize는 마우스 필요에 따라.)  마우스 복구 단계 2.11에서 같은 방식으로 처리 합니다. HPLC 등 ELISA 방법으로 수집 된 ISF를 분석 합니다.</li>
	<li>Microdialysis 후 전체 배관 세척, 입구를 연결 하 고 다시 연결 프로브를 대체 하 여 콘센트 튜브 바늘 및 전체 배관에 희석된 표 백제를 실행 하 고 물으로 플러시. 건조와 반복된 사용을 위해 그것을 저장 합니다. 그러나 참고: 튜브의 다른 유형은 수락 가능 하다,, 관류 버퍼에 BSA는 작은 직경 튜브를 방해할 수 있습니다, 그리고 따라서 이러한 튜브는 단일 사용으로 간주 됩니다. 튜브 착용 될 수 있다 또는 여러 사용 후 막힌 그래서 확인 흐름 속도 일관 된 사용 하기 전에 때마다.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
<li>Kushikata, T., Hirota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+microdialysis+in+free-moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide microdialysis in free-moving animals.</a> Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microdialysis+reveals+age-dependent+decrease+of+brain+interstitial+fluid+tau+levels+in+P301S+human+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).</li>
<li>Ulrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apolipoprotein+E+from+the+brain+interstitial+fluid+using+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+transmission+via+ATP-dependent+K%2B+channels+regulates+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum.</a> Brain. 139 (3), 871-890 (2016).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-competent+high-molecular-weight+tau+species+accumulates+in+the+cerebrospinal+fluid+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model+and+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients.</a> Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).</li>
<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
<li>Kang, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+dynamics+are+regulated+by+orexin+and+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle.</a> Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+regulates+interstitial+fluid+amyloid-beta+levels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.</a> Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).</li>
<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 상관이 있다.

막 잘라 높은 분자 무게 Microdialysis 푸시 풀 모드에서 운영 될 수 있다, 따라서 그것은 중요 한 흐름 속도 정확 하 고 일정. 흐름 율에 부정확 공기 거품 생성 및 샘플 농도에 불일치의 원인이 될 수 있습니다. 흐름 일치 하지 않으면 누설에 대 한 모든 연결을 확인 합니다. 문제가 계속 발생 하는 경우 다시 시작 하는 새로운 프로브와 튜브를 필요할 수 있습니다.
Microdilaysis 프로브는 지속적으로 관류 버퍼에 의해 끼얹는다. 따라서, 하지 관류 버퍼에서 전체 균형에 도달 하는 extracellular 분자에 대 한 충분 한 시간이입니다. 결과적으로 dialysate에 농도 ISF에의 실제 농도 보다 훨씬 낮습니다. ISF에 분자의 진정한 농도 예측 하기 위해서는 제로 흐름 메서드는 자주 사용된3,,51...

ISF 총 두뇌 양의 15-20%를 구성 하 고 신호 변환, 기판 운송 및 폐기물 허가1에 대 한 중요 한 microenvironment를 제공 합니다. 따라서, 살아있는 동물에서 ISF 수집 능력 질병 메커니즘 뿐만 아니라 다양 한 생물 학적 과정에 대 한 큰 의미를 제공 합니다. Vivo에서 microdialysis 몇 가지 방법 중 하나는 샘플 및 계량 extracellular 분자 ISF에서 깨어에서 자유롭게 이동 하는 동물 이며 신경 과학 연구 분야2,3에 유용한 도구 역할을 그로 인하여. 이 방법에서는, 반 투과성 막으로 microdialysis 프로브는 두뇌에 삽입 되 고 상대적으로 느린 흐름 속도에서 관류 버퍼와 함께 끼얹는다 (0.1-5 µ L/min). 이 관류 동안 ISF에 extracellular 분자 수 동적으로 농도 기온 변화도 따라 프로브로 확산 하 고 있는 dialysate로 수집 합니다. 이 문서에서는 샘플 두뇌에 ISF에 방법, 원리와 방법을 모두 적용할 수 있습니다 다른 기관에 적절 한 수정에 의해 필요한 경우.
Microdialysis 처음 고용 되었다 1960 년대 그리고 이후 수집 등 아미노산 신경 전달 물질 두뇌에서 작은 분자를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, 차단 막 (100 kDa-3 MDa)는 높은 분자 무게 microdialysis 프로브의 최근 상업적인 가용성 확장 뿐만 아니라4,,56 ISF에 상대적으로 더 큰 단백질에의 응용 7. 이 프로브를 사용 하 여 연구 발견을 주도하 고 있다 그 단백질 등 타우 α-synuclein 오래 있을 생각 했다 독점 세포질은 또한 순수 ISF4,,58에 존재.
Microdialysis 프로브를 사용 하 여 큰 차단 막 (일반적으로 1000 kDa)와 어려움 중 하나는 내부 압력 프로브에 축적 한 유체 손실에 더 취약 하는 것입니다. Microdialysis 프로브는 여기에 사용 되는이 문제를 방지 하려면 독특한 구조가. 압력 것입니다 하지 쌓아이 구조 때문에, 따라서 이러한 프로브 microdialysis perfuse (= push) 프로브 및 프로브 콘센트에서 dialysate 오는 수집 롤러/연동 펌프에 주사기 펌프를 사용 하 여 "푸시-풀" 모드에서 작동 해야 (= 풀) 9 (푸시와 풀 펌프, 압력 프로브에 환기 구멍을 취소 해야 하는 있지만 시스템은 기술적으로 구동 풀 펌프에 의해). 이 문서는 가이드 정 맥 주입의 stereotaxic 수술으로 시작 하 고 1000 kDa 차단 막과 microdialysis 프로브를 통해 ISF를 수집 하기 위해 microdialysis 라인을 설정 하는 방법에 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Univentor 820 Microsampler</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>냉장 분획 수집기</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>롤러 펌프</td><td>Eicom 미세 투석</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Raturn 독립형 시스템</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>자유 이동 시스템</td></tr><tr><td>이중 종 케이지 키트</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>AtmosLM 미세투석 프로브(샤프트 길이 8mm, 멤브레인 길이 2mm)</td><td>Eicom 미세투석</td><td>PEP-8-02</td><td>프로브, 가이드, 듀미 프로브 및 입체식 어댑터의 샤프트 길이는 동일해야 합니다.</td></tr><tr><td>미세 투석 가이드 (샤프트 길이 8mm)</td><td>Eicom 미세 투석</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>미세 투석 더미 프로브 (샤프트 길이 8mm)</td><td>Eicom 미세 투석</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>뼈 나사</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Super bond C & B 세트</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>치과 시멘트</td></tr><tr><td>디지털 디스플레이 콘솔이있는 소형 동물 입체 기기</td><td>Kopf</td><td>모델 940</td><td>입체 운동 장치</td></tr><tr><td>마우스 및 신생아 쥐 어댑터</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>표준 이어 바 및 마우스 용 고무 팁 입체</td><td>Stoelting</td><td>51648</td><td></td></tr><tr>소 혈청 <td>시그마</td><td></td><td>의 알부민 용액A7284-50ML</td><td>30% BSA 용액</td></tr><tr><td>FEP 튜빙 (70 cm)</td><td>Eicom 미세투석</td><td>JF-10-70</td><td>내부 부피 = 0.5 &마이크로; L/cm</td></tr><tr><td>테프론 튜빙 (50 cm)</td><td>Eicom 미세투석</td><td>JT-10-50</td><td>내부 부피 = 0.08 &마이크로; L/cm</td></tr><tr><td>Byton 튜브</td><td>Eicom 미세 투석</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>인트라메딕 루어 찌르기 어댑터 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>무딘 끝 바늘</td></tr><tr><td>롤러 튜브</td><td>Eicom 미세 투석</td><td>RT-5S</td><td>내부 볼륨 = 4 &마이크로; L</td></tr><tr><td>캡 너트</td><td>Eicom 미세 투석</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>0.25 mL 마이크로 원심분리기 튜브(캡 포함</td>) <td>QSP</td><td>503-Q</td><td>튜브 분획 수집기</td></tr>용 <tr><td>스테로택시 어댑터(샤프트 길이 8mm)</td><td>Eicom 미세 투석</td><td>PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>연결 바늘</td><td>Eicom 미세 투석</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>마우스 동물 목걸이</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>고속 로터리 마이크로 모터 키트</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>드릴</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>뼈 나사 용</td><td></td><td></td><td></td>스크류 드라이버</tr><tr><td>메스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술 용 클리퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vivo에서 microdialysis 메서드를 잘라 높은 분자 무게와 뇌 간 질 성 액체에서 큰 extracellular 단백질을 수집 조사

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

Vivo에서 microdialysis 투 석 원리에 따라 깨어, 자유롭게 행동 동물에서 ISF를 수집 하는 강력한 기술입니다. Microdialysis은 상대적으로 작은 분자 아미노산 신경 전달 물질 등을 측정 하는 설립된 방법, 하는 동안 그것은 최근 사용 되었습니다 또한 ISF 잘라 높은 분자 무게를 가진 프로브를 사용 하 여 더 큰 분자의 역학을 평가 하 막입니다. 이러한 프로브 사용 시 microdialysis 프로브 내부 축적 된 압력을 피하기 위해 푸시 풀 모드에서 실행할 수 있다. 이 문서 단계별 프로토콜을 stereotaxic 수술 등 ISF에서 단백질을 수집을 microdialysis 라인을 설정 하는 방법을 제공 합니다. Microdialysis, 동안 체계적으로 또는 ISF에 직접 주입 하 여 마약 관리 될 수 있습니다. 역 microdialysis ISF에 화합물을 직접 주입 하는 기술입니다. Microdialysis 관류 버퍼에서 약물의 포함 ISF를 동시에 수집 하는 동안 프로브를 통해 ISF로 확산 수 있습니다. 예를 들어 타우 단백질을 측정 하 여 저자 picrotoxin의 역 microdialysis에 의해 자극 신경 활동 시의 레벨 변경 되는 방법을 보여 줍니다. 장점 및 microdialysis의 제한 사항 설명 확장된 응용 프로그램 함께 다른 비보에 방법을 결합 하 여 합니다.

자극 또는 반전 microdialysis11,,1213, picrotoxin, GABAA 수용 체 길 항 제 또는 테트로도톡신에 신경 활동을 억제, 나+ 채널 차단제 사용 되었습니다. 그것은 타우 릴리스 자극 되 면 신경 활동13,14의 증가 의해 표시 되었습니다. 이러한 일관 된 이전 관측, 50 µ M picrotoxin (PTX) 깨어 C57B6/J 쥐에 역 microdialysis (더 자세한 내용 참조)를 통해 투여 될 때 증가 ISF 생 타우 차량 제어 (DMSO) (ELISA로 측정 레벨 비교 그림 2</stron...

Vivo에서 microdialysis는 깨어, 자유롭게 행동 하는 동물에서 뇌 중간 유체 (ISF)에 존재 하는 분자의 컬렉션을 사용할 수 있습니다. ISF에 상대적으로 큰 분자를 분석 하기 위해 현재 문서 막 잘라 높은 분자 무게를 가진 프로브를 사용 하 여 microdialysis 프로토콜에 특히 초점을.

Vivo에서 Microdialysis 메서드를 잘라 높은 분자 무게와 뇌 간 질 성 액체에서 큰 Extracellular 단백질을 수집 조사

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

이 방법은 신호 전달 기질 수송 및 폐적 간격이 뇌 세포 외 공간에서 발생하는 방법에 대한 신경 과학 연구 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 잠에서 자유롭게 움직이는 동물의 세포 간 유체 또는 ISF에서 큰 세포외 분자의 샘플링 및 정량화를 허용한다는 것입니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 마취 마우스의 두개골에서 머리를 제거하고 어댑터에 고정 동물을 안전하게 귀 막대와 코 클램프를 사용합니다.동물의 눈에 연고를 바르고 어댑터를 스테레오탁스 장치에 놓습니다. 메스를 사용하여 두개골 위에 피부 절개를 적시하고 스테레오탁스 프레임의 조작체에 드릴을 부착합니다. 드릴이 람다에 부드럽게 닿을 때까지 드릴을 낮추고 드릴의 DV 좌표를 0으로 재설정합니다.그런 다음 AP 및 ML 좌표를 0으로 재설정하기 위해 드릴을 bregma로 이동합니다. 드릴을 bregma에서 수직 좌표로 이동합니다. 드릴을 두개골로 낮추고 DV 좌표를 다시 0으로 설정합니다.세 번째 좌표에 대한 절차를 반복한 후, 대상 좌표에서 버 구멍을 조심스럽게 뚫고 정수리 뼈의 모순된 면에 두 번째 구멍이 들어오게 됩니다. 두 번째 구멍에 뼈 나사를 삽입하고 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브 뚜껑에서 잠그는 조각을 두개골에 배치하여 버 구멍이 원 내에 있도록합니다. 다음으로, 스테레오탁스 어댑터의 짧은 팔에 가이드 캐뉼라를 놓고 캡 너트로 캐뉼라를 고정시하십시오.전극 클램프에 스테레오탁스 어댑터의 긴 팔을 설정하고 스테레오탁스 장치의 조작기에 팔을 부착한다. 조작기 암의 DV 스테레오탁스 어셈블리를 12도 회전하고 가이드 캐뉼라를 버 구멍으로 옮습니다. 그런 다음 가이드 캐뉼라를 뇌로 1.2 밀리미터 천천히 낮춥춥니까.가이드 캐뉼라의 금속 부분, 뼈 나사 및 노출된 두개골이 덮여 고정되어 시멘트가 건조할 때까지 크라운에 치과 시멘트를 추가합니다. 12-20분 후 전극 클램프에서 스테레오탁틱 어댑터를 제거하고 캡 너트를 제거하고 스테레오탁어댑터를 더미 프로브로 교체합니다. 그런 다음 캡 너트를 재포장하고, 스테레오탁스 장치에서 마우스를 방출하고, 개별 케이지에 마우스를 단독으로 보관한다.미세 투석을 설정하기 전에 일회용 1 밀리리터 주사기를 증류수로 채우고 바이톤 튜브를 사용하여 주사기를 미세 투석 프로브의 콘센트에 연결합니다. 통풍구 구멍을 수동으로 덮고 주사기 플런저를 부드럽게 우울하여 프로브에 물을 주입합니다. 물이 프로브 입구에 나타나고 미세 투석 막의 표면에 누출이 있는지 확인합니다.프로브를 활성화하려면 프로브 멤브레인을 70-100%에 2초 동안 담근 다음 두 번째 증류수 주입을 합니다. 하나의 입구와 하나의 콘센트 라인에 연결 바늘을 연결하고 갓 준비 관류 버퍼와 일회용 3 밀리리터 주사기를로드합니다. 무딘 엔드 바늘이 장착된 주사기를 튜브의 입구 끝에 연결하고 주사기 펌프를 사용하여 관류 버퍼로 튜브 전체를 채웁니다.튜브가 가득 차면 입구와 콘센트 라인 사이의 연결 바늘을 활성 미세 투석 프로브와 캡 너트로 교체하고 롤러 펌프의 출구 튜브에 롤러 튜브를 장착하십시오. 분당 10 마이크로리터에서 주사기 펌프를 시작하고 롤러 펌프는 분당 9.5-9.8 마이크로리터로 시작합니다. 이제 마취 가이드 캐뉼라 이식 동물의 목에 칼라를 놓고 캡 너트와 더미 프로브를 제거합니다.가이드 캐뉼러를 통해 미세 투석 프로브를 천천히 삽입하고 캡 너트를 고정시하십시오. 그런 다음 마우스를 자유 이동 시스템에 연결된 케이지에 넣고 마우스를 칼라로 묶습니다. 적어도 1시간 후, 롤러 펌프와 주사기 펌프를 순차적으로 멈추고, 주사기 펌프로 펌프를 재시동하여 롤러 펌프보다 20% 더 빠르게 설정하고, 냉장 된 분획 수집기에 콘센트 튜브의 자유 끝을 배치하여 뇌 ISF를 수집합니다.적절한 실험 적 부피가 획득되면 프로브를 제거하고 방금 입증 된 대로 마우스 복구를 처리하십시오. 이전 관측과 일치하여, 50 마이크로몰러 피크로톡신이 깨어 있는 C57B6J 마우스에서 입증된 바와 같이 역미세투석을 통해 투여될 때, 차량 제어로 처리된 동물에서 측정된 수준에 비해 간질 내인성 타우 레벨의 증가가 관찰된다. 약물 투여 이외에, 마이크로 투석은 신경 활동이 ISF에 있는 기판 농도에 어떻게 영향을 미치는지에 관하여 추가 질문에 대답하기 위하여 EEG 기록 또는 광유전학 같이 그밖 생체 내 방법과 결합될 수 있습니다.

in-vivo-microdialysis-method-to-collect-large-extracellular-proteins

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

자유롭게 동물을 이동 고유 뇌 세포 지역에서 신경 전달 물질 수준의 모니터링 신경 전달 물질 방출과 행동 사이의 링크에 통찰력을 제공합니다. 그리고 기초 neurotransmission가 약리 또는 생리적 조작에 의해 변경하는 방법에 대한 정보, 전기 탐지와 결합하여 생체내 microdialysis 우수한 해부 학적 및 화학적 해상도를 제공합니다.

설치류에 살아서 Stereotaxic 외과

직접 intrahippocampal microinjection에 의해 hippocampally에 의존 공간 작업 기억의 변조는 함께하고...

Hippocampal 인슐린 Microinjection 및<em&gt; 생체에</em공간 메모리 테스트 기간 동안&gt; Microdialysis

이 동영상은 미세 투석 프로브를 사용하여 마우스 뇌의 간질액(ISF)에서 세포 외 단백질을 수집하는 과정을 보여줍니다. 고분자량 컷오프 반투과성 멤브레인이 장착된 미세 투석 프로브는 이식된 가이드 캐뉼라를 통해 마취된 마우스의 뇌에 삽입됩니다. 펌프에 연결된 프로브는 생리학적 완충액이 뇌 조직을 관류하고 ISF와 혼합할 수 있도록 합니다. ISF의 단백질은 반투과성 멤브레인을 통해 확산되고 분석을 위해 수집됩니다.

세포 외 단백질을 분리하기 위한 생쥐 뇌의 간질액의 미세투석

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

미세 투석은 신경 과학 연구에 일반적으로 사용되는 기술이다. 따라서 상업 프로브는 큰 demand.In에 프로브 어셈블리가 $ 10 미만의 신뢰성, 동심, 맞춤형 미세 투석 프로브를 구축 상세하게 설명이 작품이다.

주문 제작 미세 투석 프로브 디자인

여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.

신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

여기, vivo에서 microdialysis 뇌 파 기록 함께에서 간 질 및 간 질 비 쥐의 복 부 해 마에 aspartate 및 조미료 자료를 분석 하는 방법을 설명 합니다. Extracellular 농도 aspartate 및 조미료의 질병의 다른 단계와 상관 될 수 있습니다.

자유롭게 이동 하는 쥐에서 뇌 파 기록 하는 동안 흥분 성의 아미노산의 Microdialysis

여기서 프로토콜은 미세 투석 시스템을 사용하여 깨어 있는 쥐의 해마에서 세포외액의 상세한 실시간 동적 샘플링을 제공합니다.

Microdialysis System을 사용한 의식이 있는 쥐의 해마 세포외 유체의 실시간 동적 수집

생체 내에서 교모세포종(GBM)과 같은 많은 중추신경계 질환의 세포 간 통신은 측정과 특성 규명이 매우 어렵습니다. 여기서는 GBM 종단 동물 모델에서 간질성 액체 성분을 샘플링하기 위해 사용할 수 있는 뇌 개방형 유동 미세관류(cOFM) 절차를 설명합니다.

교모세포종 동물 모델에서 간질액의 종단적 수집을 위한 뇌 개방형 미세관류 사용

anesthetized 쥐의 실리콘 프로브를 사용하는의 연결 활동의 세포외 녹음이 설명됩니다. 이 기법은 동시에 100 개 이상의 뉴런에서 여러 뇌 영역에 걸쳐 정보를 얻을 수 있습니다. 그것은 여러 지역의 회로에의 연결을 ensembles 역학에 대한 단세포 해상도 정보를 제공합니다.

Anesthetized 쥐의 실리콘 프로브와 함께 대규모의 연결 Ensembles 녹음하기

학습하세요 생쥐 뇌 간질액에서 고분자량 단백질을 수집하는 생체 내 마이크로다이얼시스 기법을 통해 신경신호전달 및 노폐물 제거 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기술은 각성 상태의 자유롭게 움직이는 동물에서 실시간 분자 동태 분석이 가능합니다.

Vivo에서 Microdialysis 메서드를 잘라 높은 분자 무게와 뇌 간 질 성 액체에서 큰 Extracellular 단백질을 수집 조사

더 많은 동영상 탐색