June 14th, 2018
여기 우리는 vivo에서높은 spatio 시간적 해상도에서 라이브 이미징 상처 복구와 관련 된 염증 반응에 대 한 프로토콜을 제시. 이 메서드는 초파리 개발 장기 이미징 및 시간이 지남에 따라 특정 세포 인구의 추적을 가능 하 게 하의 번데기 단계를 활용 하 고 효율적인 RNAi 중재 유전자 비활성화와 호환 됩니다.
이 새로운 번데기 모델의 장기적인 이미징 잠재력을 초파리의 유전적 다루기 힘과 함께 활용함으로써, 이 방법은 상처 치유 및 선천성 면역 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 번데기 단계는 기존의 초파리 상처 치유 모델에 비해 라이브 이미징에 대한 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 예를 들어, 번데기는 훨씬 더 오랜 기간에 걸쳐 이미지화할 수 있고, 더 많은 조직 영역을 실험적 조작에 사용할 수 있으며, 이 단계에서 더 많은 혈구가 존재합니다.
또한 이러한 번데기 단계에서 RNAi 매개 유전자 불활성화의 효율성이 상당히 향상되어 많은 유전자가 조직 또는 시간에 특정한 방식으로 녹다운될 수 있습니다. 번데기 컬렉션을 설정하기 위해 20명의 처녀 암컷과 20명의 수컷이 있는 바이알을 설정합니다. 그런 다음 이미징 세션 18시간 전에 바이알에서 새로 형성된 흰색 pre-pupae를 최소 10개 수집합니다.
번데기를 수집하려면 집게나 가는 페인트 브러시를 사용하여 내부 바이알 표면에서 번데기를 제거하고 새 플라이 바이알의 측면으로 조심스럽게 옮깁니다. 번데기가 원하는 시점으로 발달한 후 유리 슬라이드에 장착된 양면 접착 테이프 조각으로 옮깁니다. 이제 명시야 해부 현미경으로 케이스에서 번데기를 조심스럽게 꺼냅니다.
번데기의 배쪽이 테이프에 단단히 붙도록 번데기를 배치합니다. 집게를 사용하여 번데기의 가장 앞쪽 부위를 먼저 절개합니다. 이 부위의 번데기 케이스가 비어 있고 번데기 조직이 없는지 확인하십시오. 번데기는 초기 번데기 발달 중에 케이스 내에서 줄어들 것이기 때문입니다.
다음으로, 번데기가 갈색의 불투명한 부서지기 쉬운 케이스에서 완전히 자유로워질 때까지 집게나 마이크로 가위를 사용하여 번데기 케이스를 앞쪽에서 뒤쪽 방향으로 조심스럽게 찢거나 자릅니다. 이 번데기는 매우 연약하니 주의하세요. 이제이 단계에서 집게와 마이크로 가위가 번데기 표면에 구멍을 뚫지 않는 것이 중요합니다.
주변 케이스를 제거할 때 번데기 자체를 만지지 마십시오. 이제 헵탄 접착제를 사용하여 손상되지 않은 번데기를 유리 바닥 접시에 장착합니다. 먼저 10마이크로리터 분취액에서 준비된 헵탄 접착제 라인을 증착합니다.
그런 다음 5초 동안 건조시킨 후 집게를 사용하여 절개된 번데기를 접착제에 조심스럽게 옮깁니다. 학습할 때 번데기를 최대 5개까지 정렬합니다. 경험을 쌓아 더 많은 것을 준비할 수 있습니다.
집게를 사용하여 번데기를 굴려 번데기를 장착하여 날개가 덮개 유리에 평평하고 날개 표면의 대부분이 덮개 유리와 직접 접촉하도록 합니다. 마지막으로 탈수를 방지하기 위해 증류수에 적신 흡수성 여과지 조각을 유리 바닥 접시 측면에 추가합니다. 그런 다음 접시를 덮고 레이저로 인한 상처 절차를 진행합니다.
장착된 번데기를 조정 가능한 레이저 절제 시스템이 장착된 광시야 현미경으로 옮깁니다. 적절한 염료 셀을 사용하여 pulsed-UV 공냉식 질소 펌핑 절제 레이저를 원하는 파장으로 조정합니다. 최적의 상처를 위해 펄스 반복률을 40헤르츠로 설정하십시오.
이제 40배 또는 63배 대물렌즈와 명시야를 사용하여 현미경 스테이지 컨트롤을 조정하여 첫 번째 상처를 입은 번데기의 번데기 날개를 찾습니다. 유리 덮개 슬립에서 가장 가까운 번데기 날개 상피의 평면에 초점을 맞춥니다. 상처를 입힐 부위를 절제 레이저의 알려진 표적 부위와 정렬합니다.
이렇게 하려면 현미경 접안렌즈 내의 십자형 마커를 활용하십시오. 다음으로, 현미경의 에너지 밀도 감쇠기 슬라이드를 조정하여 레이저의 출력을 조정합니다. 클릭 정지점을 활용하여 설정을 재현할 수 있도록 합니다.
이제 상처를 만들려면 수동 제어를 빠르게 클릭하여 절제 레이저를 활성화하십시오. 그런 다음 절제 부위에 일시적인 기포가 나타나는지 확인하는데, 이는 상처와 함께 정상입니다. 상처를 입히는 데 실패하면 초점면을 변경해 보십시오.
또는 원하는 상처 크기가 달성될 때까지 감쇠기 슬라이드를 사용하여 레이저 출력을 점차적으로 증가시킵니다. 번데기 날개 가장자리에 상처를 입힌 후 유리 바닥이 있는 접시를 시간 저속 이미징을 위한 적절한 현미경으로 빠르게 옮깁니다. 그런 다음 적절한 이미지 캡처 소프트웨어를 엽니다.
소프트웨어에서 적절한 레이저를 켜고 출력과 게인/오프셋을 조정하여 픽셀 포화 없이 충분한 형광 신호를 얻습니다. 일반적으로 5%에서 20% 범위의 가능한 가장 낮은 레이저 출력이 광표백을 최소화하는 데 가장 적합합니다. 저배율에서 번데기 날개 전체에 초점을 맞추거나 고배율에서 상처에 초점을 맞춰 상처 복구를 조사합니다.
복구 상피와 염증 세포 동원을 모두 캡처하려면 먼저 제어판의 미세 초점 조정을 사용하여 현미경을 Z 스택을 기록하도록 설정합니다. 상처 입은 상피에서 이동하는 혈구가 들어 있는 아래의 세포 외 공간까지 스캔합니다. 다음으로, 번데기 날개를 통해 3미크론마다 또는 더 좁은 간격으로 z 슬라이스를 기록하도록 소프트웨어를 설정합니다.
타임랩스 이미징의 경우 최소 1시간 동안 최소 30초마다 Z 스택을 기록합니다. 이미징 중에 세포 하위 집합을 선택적으로 포토 변환하고 라벨링하기 위해 포토 컨버터블 프로브를 사용하는 경우, 이미징 소프트웨어 내에서 적절한 모듈을 열어 포토 변환을 수행하고 405 나노미터 레이저를 활성화합니다. 그런 다음 선택 도구를 사용하여 FRAP 소프트웨어 내에서 사진 변환할 셀을 선택합니다.
다음으로 사진 변환 시간 경로를 단일 반복 프레임으로 설정하고 405나노미터 레이저를 20% 레이저 출력으로 설정합니다. 그런 다음 실험 시작을 클릭하여 사진 변환을 수행합니다. 완료되면 FRAP 모듈을 종료하고 원래 이미징 화면으로 돌아갑니다.
사용 중인 형광단에 레이저를 조정하고 타임랩스 기록을 사용하여 광으로 변환된 세포와 그렇지 않은 광으로 변환된 세포를 이미지화합니다. 번데기 형성 후 18시간 후에 Drosophila 번데기의 상처 입은 날개를 컨포칼 타임랩스 현미경을 사용하여 이미지화했습니다. 번데기 날개 상피에 대한 레이저 유도 손상은 혈구(hemocyte)라고 하는 초파리 선천성 면역 세포의 빠른 이동을 자극하여 상처 부위로
이동시켰습니다.혈구는 핵 마커와 세포질 또는 세포골격 마커로 라벨링되어 각각 추적 및 형태 관찰을 허용했습니다. 혈구 핵 궤적을 추적하면 염증 반응의 복잡한 시공간 역학을 알 수 있습니다. 상처 입은 지 30분 이내에 부상 부위에서 가장 가까운 혈구가 상처를 향해 직접 이동하기 시작합니다.
결국, 부상에서 점진적으로 더 멀리 떨어진 혈구는 상처를 향해 이동하기 시작합니다. 사진 컨버터블 형광체(photo convertible fluorophor Kaede)를 이용하여 이러한 철새 날개 혈구의 하위 집단을 선택적으로 라벨링했습니다. 이 방법은 첫 번째 상처에 동원된 혈구가 90분 후에 생성된 두 번째 상처에 일시적으로 둔감해지는 것을 보여주기 위해 사용되었습니다.
GFP를 가진 세포질 부착 접속점 내의 E-cadherin를 레테르를 붙이기에 의하여, 상처 가장자리는 쉽게 식별할 수 있고 이것은 부상 치유 역학의 분석을 허용합니다. 대부분의 상처는 부상 후 한 시간 이내에 상피화가 다시 시작됩니다. 상처 가장자리는 안쪽으로 진행되고 상처는 궁극적으로 3시간 이내에 치유됩니다.
이 기술을 마스터하면 단 10분 이내에 여러 번데기를 라이브 이미징을 준비할 수 있지만, 이 절차를 시도하는 동안 번데기 케이스에서 해부되면 번데기는 손상과 탈수에 매우 취약하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 선천면역 분야의 연구자들이 컴퓨터 생물학자와 협력하고 보다 정교한 수학적 모델링을 적용하여 염증 세포 동원을 담당하는 상처 유인 신호의 행동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 그리고 훨씬 더 최근에는 레이저로 인한 부상에 대한 반응을 따르기 위해 대체 세포 유형도 라벨링되었으며, 이는 초파리 지방체 세포인 지방 세포 세포도 이 시스템 내의 상처에 반응한다는 것을 밝혔습니다.
이 기사는 Drosophila 번데기의 상처 치료 및 염증 반응에 대한 생체 영상 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 특정 세포 집단의 장기간 영상 촬영 및 추적을 가능하게 하여 상처 치료 및 선천성 면역의 연구를 향상시킵니다.
This protocol enables high-resolution, long-term imaging of inflammatory cell dynamics in a genetically tractable model, supporting mechanistic de-risking in target validation and assay development for innate immunity pathways. By capturing real-time hemocyte migration and wound healing dynamics, it provides quantitative, reproducible data that enhances predictive confidence in early discovery stages. The approach facilitates cross-functional collaboration between discovery biology and computational modeling teams to explore wound attractant signals and cellular behavior relevant to therapeutic intervention.
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions in early-stage programs.