Name: 생체 외에서 고독한 꿀벌의 양육: 애벌레 위험 요소를 평가 하기 위한 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 학습하세요 고독한 꿀벌 애벌레의 생체 외 양육 방법을 통해 살균제와 미생물 공생체의 상호작용을 평가하는 기술입니다. 이 방법은 꿀벌 건강 위험 요소를 연구하는 데 활용됩니다.

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저자 감사 실험실 박사 카 메 론 커리, 크리스텔 Guédot, 테리 Griswold, 마이클 Branstetter,에 대 한 3 명의 익명 검토자에 몰리 Bidwell, 디스 네 스 빗 및 Osmia 중첩 갈 대를 제공 하기 위한 팀 Krogh, Kimball 클락 원고를 개선 하는 그들의 유용한 의견. 이 작품은 미국 농 무부 농업 연구 서비스 충당 자금 (현재 연구 정보 시스템 #3655-21220-001), 위스콘신 농업의, 무역 및 소비자 보호 (#197199), 국립 과학 재단 (에 의해 지원 되었다 부여 번호 DEB-1442148), 미상 그레이트 호수 Bioenergy 연구 센터 (과학 BER 드-FC02-07ER64494의 암컷 사무실).

1. 살 균 제 노출 실험을 위한 Propiconazole 솔루션 준비
<ol><li>실험의 하루 살 균 물에 상업적으로 구입한 propiconazole 14.3%의 적절 한 볼륨을 용 해 하 여 균 솔루션 x 0.1을 준비 합니다. 모든 치료에 대 한 유일한 갓된 균 솔루션 사용은 확인 합니다.</li>
	<li>꿀벌 수집 꽃가루24 (0.361 PPM 또는 꽃가루의 활성 성분 g-1 의 µ g)에서 이전에 보고 된 propiconazole의 최대 농도를 꽃가루의 그램 당 균 솔루션 x 0.1의 23 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>2. 계란과 호스트 Osmia 갈 대에서 꽃가루 규정을 수확
<ol><li>멸 균된 메스를 사용 하 여, 갓 갈 대 Osmia의 중첩, 개별 실 노출 리드의 길이 따라 두 부분으로 분할 연결 해 부. 참고: 각 둥지는 8 ~ 14 챔버와 챔버 내에서 단일 계란 사이 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>이전에 게시 지침77에 따라 남성 계란을 포함 하는 실을 식별 하는 시각적으로 갈 대를 검사 합니다. 중첩 리드에서 관련된 달걀 함께 각 꽃가루 규정을 제거 하 고 깨끗 한 장소 소독된 구부러진된 바늘을 사용 하 여 보트 무게.</li>
	<li>부드럽게 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 제공에서 계란을 분리 하 고 꽃가루 조항의 신선한 무게 기록 표준 실험실 균형을 사용 하 여 계란. 남성 꽃가루 규정의 평균 중량을 계산 합니다.</li>
	<li>초과 온도 탈수에 노출에서 계란에 손상의 기회를 줄이기 위해 최소 지연으로 다음 단계를 수행 합니다.</li>
</ol>3. 준비 호스트 식물 꽃가루 규정
<ol><li>없는 기생충 현재78되도록 중첩 챔버에서 발굴 임산부 수집된 호스트-식물 꽃가루를 않았는지 살펴보십시오. 어떤 잠재적인 모성 편견을 줄이기 위해 멸 균 페 트리 접시에 단일 대량으로 꽃가루 규정을 결합 하 고 멸 균된 바늘을 사용 하 여 잘 혼합 합니다.</li>
	<li>새로운 꽃가루 규정, 각 재구성의 무게는 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게에 거의 같은 보장에 결합 된 질량을 분할 (의미 ± SE, 0.35 ± 0.01 g, N = 42). 참고: 때문에 Osmia sp. 작은 꽃가루 규정 남성 자손, 여성77에 비해 남성 애벌레의 낮은 몸 무게에이 결과에 할당 합니다. 어떤에 게 섹스의 차이점에서 발생 하는 이러한 바이어스를 방지 하려면 실험에서 남성 계란만 사용 합니다.</li>
</ol>4. 비 호스트 식물 꽃가루 제공 준비
<ol><li>표준 실험실 볼 밀을 사용 하 여 정밀한 분말에 상업적으로 구입한 꿀 꿀벌 수집 꽃가루 격파</li>
	<li>임산부 수집 호스트 꽃가루 규정 (~ 20%)의 함량에 따라 달라 집니다, 꽃가루 가루 반죽 같은 일관성을 형성 하기 위하여 철저 하 게 소독 40% 설탕 솔루션79 및 혼합의 적절 한 볼륨을 사용 하 여 하이드 레이트.</li>
	<li>개별 꽃가루 질량으로 분할 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게와 같은 무게 약 각. 참고: 규정 30 무작위로 선택 된 남성 챔버80에서 꽃가루 규정의 신선 하 고 건조 중량을 비교 하 여 사전에 표준화 될 수 있다 임산부 수집된 호스트 꽃가루 수 분 콘텐츠입니다. 건조 중량을 얻으려면, 꽃가루 규정 한 lyophilizer에서 동결 해야 (1.5 72 h에 대 한 펜 실바 니 아).</li>
</ol>5. 준비 Multiwell 세포 배양 배지
<ol><li>압력가 주석 컵 (5 × 9 cm)와 살 균 48-잘 문화 판의 개별 웰 스 라인. 꽃가루 조항을 수용할 수 있도록 살 균 겸 부드럽게 캡슐의 위쪽 테두리 밖으로 감각을 사용 합니다.</li>
	<li>호스트 또는 호스트 비 꽃가루의 단일 대량 치료 그룹에 따라 살 균 도구를 사용 하 여 주석 컵 안에 배치 합니다. 참고: 교차 오염을 피하기 위해, 치료 및 제어 그룹에 대 한 별도 접시를 사용 합니다.</li>
</ol>6. Fungicides를 추가
<ol><li>메 마른 나무 막대기를 사용 하 여 꽃가루 질량 내의 중앙 배치 우울증을 확인 합니다. 새로운 막대기를 사용 하 여 각 꽃가루 조항에 대 한.</li>
	<li>우울증에 (치료)에 대 한 살 균 제 솔루션 또는 살 균 물 (컨트롤)에 대 한 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 핀치는 살 균 제 사이의 표면 접촉을 최소화 하기 위해 살 균 집게를 사용 하 여 우울증의 열기 / 살 균 물과 계란.</li>
	<li>실험적인 디자인의 계승 설정 그 일치 해야 도식 표현 (그림 4)에 묘사 된.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig4.jpg"> 그림 4입니다. 실험적인 체제의 도식 대표. 실험을 완전히 넘어 2 × 2 계승 설정을 나타냅니다. 1 살 균 제 노출 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 균 (N = 10), 그리고 (ii) 균 (N = 10). 2 꽃가루 소스 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 호스트 꽃가루 (N = 8), 그리고 (ii) 비-호스트 꽃가루 (N = 8). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
7. 후방 고 애벌레 관찰
<ol><li>장소 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 꽃가루 규정의 위쪽 표면에 임의로 선택 된 남성 계란. 일단 계란 모든 규정에 배치 되었습니다, 그리고 라벨 모서리에 테이프와 보호 셀 문화 접시의 뚜껑을 대체.</li>
	<li>깨끗 한 쟁반에 잘 접시를 놓고 직접 빛과의 접촉을 방해 어두운 천으로 커버. 장소 6 잘 플레이트의 건조를 방지 하기 위해 트레이 내의 살 균 물 포함 30 mL. 실 온에서 부 화 쟁반 인큐베이터 안에 그대로 둡니다.</li>
	<li>잘 접시의 뚜껑을 제거 하지 않고 해 현미경 매일 잘 접시를 관찰 합니다. 애벌레는 살아 움직임을 확인 하 여 확인 합니다. 아무 움직임을 감지할 경우 죽은 애벌레와 나머지 꽃가루 규정을 포함 하는 주석 컵 폐기. 모든 살아남은 애벌레 prepupal 단계를 도달할 때까지 그대로 잘 플레이트 내에서 개발 하는 것을 허용 한다.</li>
	<li>Prepupal 단계41에 도달 하면 주석 컵에서 유 충을 제거 합니다. 어떤 청소 브러쉬를 사용 하 여 실크 누에고치에서 똥. 신중 하 게 해 현미경을 사용 하 여 실크 누에고치를 극복 하 고 고무 집게와는 prepupa를 추출 합니다.</li>
	<li>Prepupa 도구 소프트 바디 피어스 하지 할 수 있도록 부드럽게 처리 합니다. Prepupa (prepupal 바이오 매스)의 prepupal 단계 (애벌레 발달 시간)에 계란에서 개발 시간 신선한 무게를 기록 합니다. 참고: 모든 죽은 유 충 시신에 남은 꽃가루 조항 원치 않는 미생물 성장을 방지 하기 위해 즉시 삭제 됩니다 해야 합니다. 이 나머지 건강 한 애벌레를 감염의 위험을 줄여줍니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

그들의 자연적인 중첩 갈 대, 실험실 조건 하에서 외부 꿀벌을 양육 애벌레 피트 니스에 관한 여러 가설의 테스트 수 있습니다. 수 정체 불명된 요인 계속 비 사망 원인, 위험 평가 연구 생체 외에서 사용 하 여 실험 수 잠재적인 위협을 식별 하 고 야생 가루 12의이 종 부유한 그룹에 대 한 관리 사례를 알려 ,38,49,76,,8182.
일반적으로 짧은 개발 시간 및 높은 prepupal 바이오 매스 높은 애벌레 피트 니스와 연결 됩니다. 모든 치료에서 애벌레의 개발의 기간 부정적인 prepupal 바이오 매스...

곤충 가루1의 지배적인 그룹으로 서의 역할을 감안할 때, 꿀벌 인구에 있는 글로벌 손실 위협이 식량 안보 및 생태계 안정성2,3,,45,6 ,7. 모두와 야생 꿀벌 인구에 있는 감소 추세 있다 서식 지 파편, 신흥 기생충 및 병원 균, 유전적 다양성의 손실 및 침입 종3의 도입을 포함 한 여러 공유 위험 요인에 기인 ,4,7,8,9,10,,1112. 특히, 증가 (예를 들어, neonicotinoids), 농약의 사용은 꿀벌13,,1415간의 해로운 효과에 직접 연결 되었다. 여러 연구 neonicotinoids 사이의 ergosterol 생 합성 억제 (비) 살 균 제 성분 여러 벌 종16,,1718 에서 높은 사망으로 이어질 수 있습니다. , 19 , 20 , 21 , 22. 그럼에도 불구 하 고, 살 균 제, 긴 ' 비 안전 '으로 간주 많은 감시23없이 꽃에서 작물에 살포 될 계속. 채집 자 벌 려 정기적으로 살 균 제 잔류물24,,2526으로 오염 하는 꽃가루 중 문서화 되었습니다. 같은 살 균 제 ladenpollen의 소비 애벌레 꿀벌27,,2829,30및 성인 꿀벌16 중 하위 치명적인 효과의 제품군 중 높은 사망을 일으킬 수 있습니다. , 31 , 32 , 33 , 34. 최근 연구 제안 fungicides 꿀벌 꽃가루 부담 미생물35사이 중요 한 공생을 방해 함으로써 하이브 저장 꽃가루 내 미생물 커뮤니티를 변경 하 여 비 손실을 발생할 수 있습니다.
고독한 꿀벌은 여러 야생 및 농업 식물36,37,의 수 분에 대 한 중요 한38, 가루의이 다양 한 그룹 연구를 모니터링 하는 농약에 훨씬 덜 관심을 받고 있다. 성인 고독한 여성의 둥지 5-10 봉인된 브루 드 챔버, 각 임산부 수집 꽃가루와 꿀, 그리고 단일 계란39의 유한 질량 갖춰져 있습니다. 후에 부 화, 애벌레 할당 된 꽃가루 규정 그리고 적절 한 영양40,41관련된 꽃가루 부담 microbiota에 의존 합니다. 사회 생활의 혜택, 부족 하기 때문에 고독한 꿀벌 농약 노출42에 더 취약 있을 수 있습니다. 예를 들어, 다음 스프레이 사회 꿀벌에 적자 동안 보상 수도를 일부 노동자에 의해 확장 하 고 새로 가만히 신흥, 단일 성인 고독한 여자의 죽음 끝 모든 생식 활동43. 민감성에 이러한 차이 ecotoxicological 연구와 야생 꿀벌 모두에 대 한 적절 한 보호를 보장 하기 위해 다양 한 비 taxa를 통합할 필요가 강조 표시 합니다. 그러나, 연구의 한 줌, 외 균 노출의 효과에 대 한 조사는 주로에 초점을 맞춘 사회적 꿀벌18,23,32,44,45 ,,4647,,4849.
고독한 꿀벌 속 Osmia (그림 1)에 속하는 몇 가지 중요 한 과일 및 견과 작물39,50,,5153, 의 효율적인 가루로 사용 되었습니다. 53. 다른 관리 pollinator 그룹24,54,,5556,,5758성인 Osmia 꿀벌은 정기적으로 44-꽃 작물 살포 하는 균에 노출. 최근 스프레이 작물에 식량 약탈을 배워 성인 여성 수집 하 고 재고 나중 발전 애벌레에 대 한 유일한 다이어트를 형성 하는 균 라덴 꽃가루와 그들의 브루 드 실 수 있습니다. 오염된 꽃가루 규정 사용 후 살 균 제 잔류물42애벌레를 노출할 수 있습니다. 노출의 위험 몇 가지 밀접 하 게 관련된 호스트 식물59,,6061에 사료 oligolectic 종 가운데 더 높은 수 있습니다. 예를 들어 특정 megachilid 꿀벌 우선적으로 기생62를 줄이는 수단으로 고품질 국화과 꽃가루에 대 한 마 초 나타납니다. 그러나,는 균 중 oligolectic 고독한 꿀벌 애벌레 피트 니스 영향 정도 하지 되었습니다 실험적으로 측정할. 이 연구의 목표 주요 테스트 프로토콜을 개발 하는 것 이며 생체 외에서 의 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 대화형 효과 reared 고독한 꿀벌. 조사, O. ribifloris sensu lato (s.l.)의 계란 얻어질 수 있다 상업적으로 (자료 테이블). 이 인구는 네이티브 pollinator는 지역53,63,64 내 과즙이 풍부한 Mahonia aquifolium (오 레 곤 포도)에 대 한 그것의 강한 취향이로 그것의 중요성 때문에 이상적인 (그림 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg"> 그림 1입니다. 성인 Osmia ribifloris의 고해상도 사진. 사진 박사 짐 지팡이, 연구 곤충학자, 미국 농 무부-ARS 신용 <a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg"> 그림 2입니다. 중첩 중첩 여성 전경. 에 Osmia ribifloris (s.l.) 의 갈 대 Phragmite 챔버 파티션 및 갈 대에 대 한 터미널 플러그 masticated 잎에서 건설 한다. 사진 제공 씨 킴 볼 클락, NativeBees.com <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 연구의 첫 번째 목적은 애벌레 피트 니스 (개발 시간 및 prepupal 생물 측정)에 살 균 제 처리 꽃가루를 사용의 효과 평가 하는 것입니다. 일반적인 적용된 살 균 제 propiconazole에 노출은 여러 종 23,,2432,44,45, 전체 성인 꿀벌 중 사망률 증가에 연결 되었다 하는 동안 은 54,55,56,,5758,65,66,67, 애벌레 꿀벌에 미치는 영향 알려진. 이 연구의 두 번째 목적은 비 호스트 꽃가루 애벌레 체력에 소모의 효과 평가 하는 것입니다. 이전 연구 oligolectic 꿀벌의 애벌레 아닌 호스트 꽃가루68소비 하도록 개발 실패를 나타냅니다. 이러한 결과 변화 비 생리학69, 꽃가루 생화학70, 그리고 자연 꽃가루 규정71와 관련 된 유익한 미생물에 표시 될 수 있습니다. 이 연구의 세 번째 목적은 애벌레 체력에 균 치료와 식이 꽃가루의 대화형 효과 평가 하는 것입니다.
모성 신체 크기를 포함 하 여 수많은 생물 학적 특성, 속도, 프로비저닝 구하고 전략과 꽃가루 수량72,,7374,75 알려져 있습니다 고독한 꿀벌 중 애벌레 적합성에 영향을 미칠. 이러한 요소는 애벌레 건강을 평가할 때 방어할 수 있는 실험적인 디자인을 개발에 도전 포즈 갈 대 사이 뜻깊은 가변성을 발생할 수 있습니다. 또한, 애벌레의 개발 된 중첩 갈 대 내부에서 발생, 그 자손에 이러한 가변성의 효과 시각화 하기가 어렵습니다과 계량 없이 치명적이 지 않은 기법 (그림 3). 이 문제를 해결 하려면 모든 가설이이 연구에서 그들의 중첩 갈 대 외부 reared 애벌레를 사용 하 여 테스트 합니다. 실험 설계는 완전히 교차 2 × 2 계승 설정, 각 인자 2 수준; 구성 된 대표 요인 1: 살 균 제 노출 (살 균 제; 아니 살 균 제); 팩터 2: 꽃가루 소스 (호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루). 꿀벌 계란에서 통제 된 실험실 조건에서 살 균 multiwell 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 발생 합니다. 각 잘는 개별적으로 각종 꽃가루 제공 및 단일 계란 표준화 된 양의 있습니다. 해칭, 후 유 충 우물 내에서 할당 된 꽃가루에 피드를 애벌레의 개발을 완료 고 pupation 시작. 과거의 연구 원인 불명된 사망은 야생49,76에서 발생 보다이 인공 양육 환경 내에서 발생 하는 꿀벌 가운데 낮은 나타났습니다. 생체 외에서의 사용-reared 꿀벌 필드 기반 연구를 통해 몇 가지 이점이 있다: 1) 그것은 자연적인 가변성 및 필드 기반 연구;와 일반적으로 관련 된 통제 요인의 혼동 영향을 최소화 2) 그것은 조작 각 factor(s)에 대 한 관심을 동시에 치료 그룹; 테스트의 여러 레벨을 허용 한다 3) 복제의 수를 미리 결정 된, 수 및 각 복제에 대 한 실험적인 요소를 개별적으로 조작할 수 있습니다. 4) 애벌레 응답 변수를 쉽게 시각화 하 고 방해 인접 한 애벌레; 없이 독립적으로 기록 된 수 있다 5) 프로토콜 여러 요인과 반응 변수 관련 된 더 복잡 한 실험 설계에 맞게 수정할 수 있습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg"> 그림 3입니다. 자연 중첩 리드의 내용을 Osmia ribifloris (s.l.). (A) 개별 챔버, 꽃가루 규정 및 파티션, 및 (B)를 갓 보여주는 해 부 리드 수확 꽃가루 규정과 관련 된 계란 (검은 원 표시) 닫습니다. <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>O. ribifloris sensu lato (s.l.)</td><td></td><td></td><td>Kaysville, Davis County, Utah, USA</td></tr><tr><td>Osmia reeds</td><td>Nativebees.com</td><td>NA</td><td>갓 막힌 갈대</td></tr><tr><td>해부 세트</td><td>VWR</td><td>89259-964</td><td>사용 전 살균</td></tr><tr><td>긴 코 펜치</td><td>Husky</td><td>1006</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>멸균 밀봉</td></tr><tr><td>48 우물 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-898</td><td>멸균 밀봉</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25373100</td><td>멸균 밀봉</td></tr><tr><td>정사각형 계량 보트</td><td>VWR</td><td>10770-448</td><td></td></tr><tr><td>낙타 털 브러시</td><td>Bioquip</td><td>1153A</td><td></td></tr><tr><td>주석 캡슐</td><td>EA 소모품</td><td>D1021</td><td>사용 전 살균</td></tr><tr><td>설탕</td><td>VWR</td><td>470302-808</td><td></td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3</td></tr><tr><td>%꿀벌 꽃가루</td><td>꿀벌 활력</td><td>897098001244</td><td>처리되지 않은 천연 천연 꽃가루</td></tr><tr><td>Microbalance</td><td>VWR</td><td>10204-990</td><td></td></tr><tr><td>Pulverisette</td><td>LAB SYNERGY INC.</td><td></td><td></td>30334913</tr><tr><td>나무 막대기</td><td>VWR</td><td>470146908</td><td>사용 전 살균</td></tr><tr><td>밀봉 테이프</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>VWR</td><td>89403-384</td><td></td></tr><tr><td>심기 트레이</td><td>VWR</td><td>470150-632</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>21008936</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 주사기</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-07940-07</td><td></td></tr><tr><td>고무 핀셋</td><td>Amazon</td><td>B0135HWPN4</td><td></td></tr><tr><td>주사기 바늘</td><td>VWR</td><td>89219-334</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>Labcono</td><td>LFZ-1L</td><td></td></tr><tr><td>통계 소프트웨어</td><td>SPSS</td><td>버전 21.0</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 고독한 꿀벌의 양육: 애벌레 위험 요소를 평가 하기 위한 도구

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

고독한 꿀벌 와일드 하 고 관리 되는 작물에 대 한 중요 일 분의 서비스를 제공 하는 있지만이 종 부유한 그룹 크게 간과 되어 농약 규제 연구. 살 균 제 잔류물에 노출의 모험 경우 스프레이 또는 호스트 식물 근처에, 꿀벌은 그들의 둥지를 구축 하는 꽃가루를 수집 하는 동안 특히 높을 것입니다. 꽃가루 식물 (oligolecty)의 선택 그룹에서 사용 하는 Osmia 의 종, 비 호스트 식물에서 꽃가루를 사용 하는 무 능력 살 균 제 관련 독성에 대 한 그들의 위험 요소를 높일 수 있습니다. 이 원고는 성공적으로 oligolectic 메이슨 꿀벌, 표준화 된 실험실 조건에서 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 달걀에서 Osmia ribifloris sensu lato 후면에 사용 되는 프로토콜을 설명 합니다. 생체 외에서-reared 꿀벌 이후 벌 체력에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 효과 조사 하기 위해 사용 됩니다. 2 × 2 완전히 넘어 계승 디자인에 따라 실험 prepupal 바이오 매스, 애벌레 발달 시간 및 survivorship 계량 애벌레 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 근원의 주요 및 대화형 효과 검사 합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 외에서사용 하 여-reared 꿀벌 자연 배경 가변성을 감소 시킨다 고 여러 실험적인 매개 변수의 동시 조작 있습니다. 설명된 프로토콜 가설 꿀벌 건강에 영향을 미치는 요인의 제품군과 관련 된 테스트에 대 한 다양 한 도구를 제공 합니다. 중요 한, 지속적인 성공을 충족 되어야 보존 노력에 대 한 꿀벌 감소를 촉진 하는 생리와 환경 요인의 복잡 한 상호 작용으로 이러한 통찰력 중요할 증명할 것 이다.

애벌레 피트 니스 3 통계 (i) 애벌레 발달 시간, (ii) prepupal 바이오 매스, 그리고 (iii) %survivorship 사용 하 여 정량 했다. 양방향 ANOVA 균 노출을 사용 하 여 실시 되었다 (2 레벨: 아니 살 균 제, 살 균 제) 및 꽃가루 소스 (2 레벨: 호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루) 독립 변수와 종속 변수 애벌레 발달 시간으로. 살 균 제 노출에 대 한 주요 효과 (F1,28 = 1.24, P = 0.28)는 살 균 처리 (평균 ± SE) 사이 중요 한 비 (28.14 ±1.98 d, N = 14), 및 치료 (25.39 ± 1.65 d, N = 18) 그룹. 그러나 꽃가루 소스에 대 한 주요 효과, 애벌레 호스트 꽃가루에 대 한 개발 시간 사이 상당한 차이가 표시 (20.00 ± 0.50 d, N = 16) 및 비-호스트 꽃가루 (3...

꽃 식물에 균 스프레이 고독한 꿀벌 꽃가루 부담 균 잔류물의 높은 농도에 노출 될 수 있습니다. 실험실 기반 실험 체 외에관련 된을 사용 하 여-reared 꿀벌 애벌레,이 연구 균 처리 꽃가루 호스트와 호스트 비 식물에서 파생 된 소모의 대화형 효과 조사.

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

고독한 꿀벌 종은 지구상에서 가장 다양한 꿀벌 그룹을 대표하지만 고도로 통제된 조건에서 유충을 성공적으로 기르는 것은 매우 어려울 수 있습니다. 우리는 고독한 꿀벌 종의 체외 배양을 위한 방법을 개발하여 미생물 공생체와 관련된 위험 요인을 분리하고 측정할 수 있습니다. 특정 줄기 둥지 고독한 꿀벌 종의 경우 배양 기술이 어린 유충과 꽃가루에서 태어난 미생물 공생체를 수용하는 것이 중요합니다.여기에서 우리는 여러 스트레스 요인의 주요 상호 작용 효과를 조명하여 스트레스 요인이 주로 단독으로 작용하는지 아니면 함께 작용하는지 식별할 수 있도록 했습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 Molly Bidwell과 Prarthana Dharampal입니다. 멸균된 메스를 사용하여 갓 막힌 Osmia 둥지 갈대를 해부합니다.갈대를 세로로 두 부분으로 나누어 개별 챔버를 노출시킵니다. 둥지는 일반적으로 8-14개의 방으로 구성되어 있으며 방당 하나의 알이 있습니다. 표준 방법을 사용하여 수컷 난자를 식별합니다.이 실험에서는 꽃가루 제공 크기의 성별 편향 때문에 수컷 난자만 사용되었습니다. 남성 조항은 일반적으로 여성 조항보다 작습니다. 그런 다음 멸균된 기구를 사용하여 관련 난자와 함께 각 꽃가루 공급물을 제거하고 깨끗한 계량 보트에 넣습니다.계량 보트에서 계란을 식량에서 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 꽃가루 공급량과 난자를 따로 계량합니다. 오스미아 알을 재빨리 다루어 꽃가루가 없는 시간을 최소화하십시오.숙주 꽃가루 제공 준비를 위해 먼저 둥지에서 발굴된 모체로 수집된 숙주 식물 꽃가루에 기생충이 있는지 육안으로 검사합니다. 그런 다음 잠재적인 모성 편견을 줄이기 위해 꽃가루 공급을 단일 덩어리로 결합하고 멸균된 바늘을 사용하여 혼합합니다. 다음으로, 숙주 꽃가루를 표준 질량의 새로운 조항으로 나눕니다.숙주가 아닌 식물 꽃가루를 준비하기 위해 시중에서 구입한 꿀벌에서 채취한 꽃가루를 표준 실험실 뼈 분쇄기를 사용하여 미세한 가루로 분쇄합니다. 그런 다음 숙주 꽃가루 공급의 수분 함량에 따라 살균된 설탕 40% 용액을 사용하여 꽃가루 가루를 수화합니다. 이것을 반죽 같은 농도로 섞습니다.그런 다음 모체가 채취한 식량과 동일한 무게의 비숙주 꽃가루 공급을 만드십시오. 처리 플레이트의 경우 48웰 배양 플레이트의 개별 웰에 오토클레이브 주석 컵을 라이닝합니다. 치료 그룹과 대조군을 위해 별도의 플레이트를 준비합니다.그런 다음 멸균 집게를 사용하여 컵의 상단 가장자리를 부드럽게 펴서 꽃가루 공급을 수용할 수 있도록 합니다. 다음으로, 단일 꽃가루 식품을 깡통 컵에 넣습니다. 이제 각 꽃가루 덩어리 내에서 멸균 나무 막대기를 사용하여 중앙에 배치 된 움푹 들어간 곳을 만듭니다.각 꽃가루 공급에 대해 새 막대기를 사용하십시오. 우울증에 방제를 위해 살균제 및 멸균수와 같은 적절한 양의 처리 용액을 추가하십시오. 추가할 때마다 깨끗한 멸균 집게를 사용하여 닫힌 함몰부를 꼬집습니다.시작하려면 각 처리 플레이트에 무작위로 선택된 수컷 난자를 잘 넣으십시오. 깨끗하고 고운 붓을 사용하여 꽃가루 공급 위에 놓습니다. 계란이 놓이면 모서리에 테이프를 사용하여 접시에 뚜껑을 고정합니다.그런 다음 준비된 각 플레이트를 실온으로 유지되는 인큐베이터에 넣습니다. 건조를 방지하기 위해 멸균수가 적재된 6웰 플레이트 1개를 포함합니다. 플레이트를 인큐베이터 내부에 그대로 두십시오.뚜껑을 제거하지 않고 해부 현미경으로 매일 플레이트를 확인하십시오. 유충이 살아 있으면 움직일 것입니다. 움직임이 감지되지 않으면 죽은 유충과 남은 꽃가루가 들어 있는 양철 컵을 버리십시오.유충이 번데기 전 단계에 도달하면 양철 컵에서 유충을 제거하고 브러시를 사용하여 실크 고치를 닦아냅니다. 그런 다음 해부 현미경을 사용하여 실크 고치를 조심스럽게 자르고 깃털처럼 가벼운 집게를 사용하여 프레퓨파를 추출합니다. 프레퓨파는 본체가 손상되지 않도록 부드럽게 다루십시오.이제 prepupa의 질량과 알에서 prepupal 단계까지의 발달 시간을 기록하십시오. 유충 적합성은 유충 발달 시간과 번데기 전 바이오매스를 사용하여 정량화되었습니다. 살균제를 투여한 그룹과 처리되지 않은 그룹 사이에서 유충 발달 시간과 번데기 전 바이오매스 사이에는 상당한 음의 상관관계가 있었습니다.비숙주 꽃가루에서 자란 유충에 대해서는 유의한 음의 상관관계가 있었지만, 숙주 꽃가루에서 자란 유충에 대해서는 그러한 관계가 관찰되지 않았습니다. 꽃가루 공급원은 꿀벌 적응도에 중요한 주요 영향을 미쳤습니다. 숙주가 아닌 꽃가루에서 자랐을 때 유충 발달 시간은 크게 증가한 반면, 숙주 꽃가루에서 자란 유충에 비해 살균제 처리 그룹과 처리되지 않은 그룹 모두에서 번데기 전 바이오매스는 크게 감소했습니다.살균제 노출은 체력에 유의한 주된 영향을 미치지 않았다. 살균제 투여군과 미투군 그룹에서 숙주 꽃가루와 비숙주 꽃가루에서 자란 치료에 대한 발달 시간과 번데기 전 바이오매스에는 통계적으로 유의미한 차이가 없었다. 살균제 노출과 꽃가루 공급원이 유충 발달 시간과 번데기 전 바이오매스에 미치는 유의미한 상호 작용 효과는 없었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 시험관 조건에서 고독한 꿀벌 유충을 성공적으로 사육하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면 이 기술을 사용하여 난자에서 번데기 단계까지 체외 조건에서 꿀벌을 키우는 동시에 스트레스 처리로 인한 사망률을 최소화할 수 있습니다. 이 절차를 사용하는 동안 계란이나 아주 어린 유충을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이것은 유충이 거의 전적으로 다이어트 처리의 의도된 조작에 따라 사육되도록 합니다. 이 프로토콜은 다른 여러 종의 고독한 꿀벌과 말벌로 확장될 수 있으며 꽃가루 매개자의 건강에 영향을 미치는 여러 위험 요인의 주요 상호 작용 효과를 테스트하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 고독한 꿀벌 유충을 위한 체외 배양 수단을 제공함으로써 이 기술은 취약한 꿀벌 개체군에서 이전에 알려지지 않은 위험 요인을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 이 프로토콜에 기반한 일부 실험은 생체이물 스트레스 요인에 대한 다양한 정도의 저항력을 부여하는 꽃가루 마이크로바이옴의 역할을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 접근 가능하고 저렴한 기술인 이 프로토콜은 연구자가 자신의 연구 목표를 해결하기 위해 쉽게 수정할 수 있는 가설 테스트를 위한 다목적 도구를 나타냅니다.

in-vitro-rearing-solitary-bees-tool-for-assessing-larval-risk

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

꿀벌(Apis mellifera)을 위해 개발된 코확장반응(PER) 조절프로토콜은 많은 곤충 종에서 여러 가지 학습 메커니즘을 연구하기 위한 생태학적으로 관련성이 있고 쉽게 정량화할 수 있는 수단을 제공합니다.

코 확장 응답 곤충의 행동 소성을 조사하기위한 프로토콜 : 기본, 바이오 메디컬에 응용 프로그램, 및 농업 연구

이 프레젠테이션의 목표는 생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 양육을위한 체외 기술에 증명하는 것입니다. 체외 방법이 풍부한 한천 미디어를 활용하는 반면, 생체 내 방법, 곤충 호스트와이 선충의 양육을 고려하십시오.

생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 체외 양육 (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)

여기에서 우리는 제시   방법은 개별 꿀벌과 벌집 콜로니 모두 농약 오염 된 식품을 공급한다. 절차는 기본 유생 다이어트 생체 공급함으로써, 또한 벌집 콜로니의 자연 상태에서 개별 꿀벌의 살충제 효과를 평가한다.

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

이 프로토콜에서 근 친 십자가 실시 하 고 그 십자가의 성공을 평가 하기 위한 메서드가 개미 Vollenhovia emeryi에 대 한 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 실험 Hymenoptera에 섹스 결정 시스템의 유전 기초를 이해 하기 위한 중요 합니다.

유도 및 개미, Vollenhovia Emeryi 를 사용 하 여 근 친 십자가의 평가

여기서, 우리는 1) 연방 멸종 위기에 처한 마이애미 블루 나비(Cyclargus thomasi bethunebakeri)의실험실 포로 전파에 대한 프로토콜을 제시하고, 2) 미숙한 발달 시간 및 애벌레 스타디아의 수와 같은 기본적인 생활 역사 정보를 평가. 두 방법 모두 다른 ex situ 보존 프로그램과 함께 사용하도록 조정할 수 있습니다.

생명역사 지식과 효과적인 Ex Situ 보존 기술을 향상시키기 위한 위험에 처한 나비 포로 전파 프로그램

여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.

꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)

이 프로토콜은 농약이 꿀벌(아피스 멜라이프라)재생에 미치는 이해를 향상시키기 위해 개발되었으며, 꿀벌 여왕과 그 노동자 관리인을 통제 된 실험실 환경에서 농약에 노출시키는 방법을 확립하고 관련 반응을 주의 깊게 모니터링합니다.

꿀벌 여왕을 짝짓기하는 농약적 위험 평가

본 프로토콜은 고독한 꿀벌 인 Osmia excavata의 유충에게 살충제로 오염 된 조항을 먹이는 방법을 설명합니다. 이 절차는 독방 꿀벌의 유충에 대한 살충제의 생태 독성을 검사합니다.

살충제가 독방 꿀벌의 유충에 미치는 영향 평가

여기에서, 날파리의 유충과 암컷에서 먹이 공급원과 산란 선호도를 평가하기 위한 두 가지 프로토콜이 상세히 설명된다. 이들은 두 가지 상호 작용 요소, 즉 기판 유형과 온도의 네 가지 선택으로 구성됩니다. 이 분석을 통해 유충의 먹이 공급원 선호도와 암컷의 산란 부위 선호도를 결정할 수 있습니다.

생활사 선택 탐색: 날파리 유충과 암컷 선호도에 대한 상호 작용 요인으로 온도 및 기질 유형 사용

우리는 현장에서 채취한 꿀벌을 안전하게 취급하기 위한 검증된 방법을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 샘플링 중에 수집된 꽃가루를 통해 식물-곤충 상호 작용의 신속한 조작, 식별, 유전자 샘플링 및 확인을 수행할 수 있습니다. 쉽게 적응할 수 있는 이 접근 방식은 희귀 곤충 그룹을 연구하는 데 비용 효율적이고 치명적이지 않은 수단을 제공합니다.

현장에서 꿀벌을 가두고 안전하게 다루는 신속한 방법

학습하세요 고독한 꿀벌 애벌레의 생체 외 양육 방법을 통해 살균제와 미생물 공생체의 상호작용을 평가하는 기술입니다. 이 방법은 꿀벌 건강 위험 요소를 연구하는 데 활용됩니다.

생체 외에서 고독한 꿀벌의 양육: 애벌레 위험 요소를 평가 하기 위한 도구

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