Name: HEK 세포에서 Mitoribosome의 신속한 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 질소 캐비테이션을 이용한 HEK293S 세포에서 미토리보솜 대규모 정제 방법을. 이 기술은 고해상도 구조 연구와 미토콘드리아 단백질 합성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 전략 연구 (미래 지도자 그랜트 FFL15:0325), 라 그 나 Söderberg 재단 (친목 의학 M44/16), 스웨덴 연구 위원회 (시작 그랜트 NT × 2015 04107), FEBS 장기 친교 (SA)에 대 한 스웨덴 재단에 의해 지원 H2020-MSCA-ITN-2016 프로젝트 721757 (대).

모든 포유류 세포의 문화 일 생물 안전 캐비닛 안에 수행 되어야 합니다. 셀과 살 균 장비 접촉 하는 경우 사용 합니다. 니트 릴 장갑 및 실험실 외 투를 착용 하 고 좋은 조직 문화 사례를 따라.
1. 세포 배양
<ol><li>HEK293S 현 탁 액 셀에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 항생물질 무료 소 혈 청 (FBS), 5 μ g/mL blasticidin와 200 μ g/mL Azithromycin, 37 ° C, 5% CO2보충을 유지 합니다.</li>
	<li>최대 9 x T175 플라스 크를 확장 합니다. 90 %confluency에서 세포를 수확 하 고 스핀 그들 다운 500 x g 5 분 Resuspend에서 Freestyl 5%와 보충에 수송과 세포 항생물질 무료 FBS. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 고 1.5 x 106 셀/mL 발명된 떨고 플라스 크에 세포 농도 조정 합니다. 참고:이 일반적으로 1000 mL 발명된 플라스 크 300ml의 시작 볼륨에 대응 됩니다.</li>
	<li>셀 120 rpm (떨고 지름 50 m m)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 떨고 인큐베이터에 품 어.</li>
	<li>2 일 후 셀 고 셀 밀도 106 셀/mL x 3.0 이상 사용 하는 경우 셀을 분할 하려면 진행. 2 x 10 mL 신선한 매체에서 Resuspend 셀 2 x 150 mL 세포 배양 5 분에 대 한 500 g 2 x 250 mL 원뿔 병에 아래로 회전 시켜 셀을 분할 하 고 발명된 플라스 크의 최종 셀 밀도 대 한 적절 한 볼륨을 포함 하는 2 x 1, 000 mL로 전송 1.5 106 셀/mL, 예를 들어 시작에서 2 x 300 mL x 3.0 x 106 셀/mL의 조밀도 세포.</li>
	<li>셀 120 rpm (떨고 지름 50 m m)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 떨고 인큐베이터에 품 어.</li>
	<li>2 일 후 셀 고 셀 밀도 106 셀/mL x 3.0 이상 사용 하는 경우 셀을 분할 하려면 진행. 4 x 150 mL 세포 배양 5 분에 대 한 500 g 4 x 250 mL 원뿔 병에 아래로 회전 하 여 셀 셀 2 x 10 mL 신선한 매체에서 Resuspend 및 전송 2 x 2000 mL 발명된 플라스 크 1.5 x의 마지막 셀 밀도 대 한 적절 한 볼륨을 포함 하는 분할 106 셀/mL, 예 106 셀/mL x 3.0의 시작 셀 밀도에서 2 x 700 mL.</li>
	<li>셀 120 rpm (떨고 지름 50 m m)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 떨고 인큐베이터에 품 어.</li>
	<li>2 일 후 셀 고 셀 밀도 106 셀/mL x 3.0 이상 사용 하는 경우 셀을 분할 하려면 진행. 2 x 700 mL을 붓는 의해 셀 분할 2800 mL x 2로 세포 배양 통풍 플라스 크 및 2 x 1 나의 볼륨에 도달 2 x 300 mL 신선한 매체와 토 핑</li>
	<li>셀 120 rpm (떨고 지름 50 m m)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 떨고 인큐베이터에 품 어.</li>
	<li>24 시간 후 셀 고 셀 밀도 3.0-4.0 x 106 셀/mL 사이 있으면 셀을 수확.</li>
</ol>2. 미토 콘 드리 아 절연
<ol><li>버퍼 필요 참고: 수량 2 L 세포에서 준비를 위해 제공 됩니다. 미토 콘 드리 아 절연 버퍼 (MIB), 자당/마 니 톨 버퍼 (SM4), 실험적인 버퍼 (MIBSM), 물의 resuspension 버퍼 (SEM)에 대 한 미리 다음 재고 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>확인 0.5 L MIB 버퍼: 50 mM HEPES-코, pH 7.5, 10mm KCl, 1.5 m m MgCl2, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 1mm DTT, protease 억제제.</li>
		<li>100 mL SM4 버퍼 확인: 280 mM 자당, 840 m m 마 니 톨, 50 mM HEPES-코, pH 7.5, 10mm KCl, 1.5 m m MgCl2, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 1 m M DTT, protease 억제제.</li>
		<li>만들기 160 mL MIBSM 버퍼: 120 mL MIB 버퍼 + 40 mL SM4 버퍼.</li>
		<li>4 ° c.에서 200 mL PBS 저장</li>
		<li>5 mL SEM 버퍼 확인: 250 m m 자당, 20 mM HEPES-코, pH 7.5, 1 mM EDTA.</li>
		<li>4 x 10 mL 20 mM HEPES 코, pH 7.5, 1 mM EDTA 및 60 %stepwise 자당 기온 변화도 대 한 재고 솔루션 / 32% /23 %와 15% 자당, 각각.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미토 콘 드리 아 절연 참고: 그것은 신속 하 게 작업 절차에 걸쳐 얼음에 모든 것을 유지 하는 것이 중요입니다.</li>
	<li>사용 하기 질소 공동 현상은 챔버 전에 쿨<ol>
<li>7 분, 4 ° c.에 대 한 1000 x g에서 원심 분리 하 여 2 x 1 L 세포 (3-4 원심 분리기 튜브 당 109 셀 x) 수확</li>
		<li>신중 하 게는 상쾌한 가만히 따르다와 수송과 셀 2 x 100 mL PBS에 신속 하 게 resuspend. 셀을 풀.</li>
		<li>1200 x g 10 분, 4 ° c.에 resuspended 세포를 원심</li>
		<li>신중 하 게는 상쾌한 가만히 따르다와 펠 릿 (~ 20 g)를 무게.</li>
		<li>120 mL MIB 버퍼에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>10 분 동안 차가운 방에 부드럽게 교 반에 의해 팽창에 셀 수 있습니다.</li>
		<li>얼음에 질소 공동 현상은 챔버를 놓고 질소 공동 현상은 실로 치명적된 셀을 전송 합니다. 45 mL SM4 버퍼 추가 (resuspended 셀, 약 140 mL, 저조한 70mm 자당 및 210 m m 마 니 톨의 최종 농도의 최종 볼륨의 1/3).</li>
		<li>고정 질소 공동 현상은 챔버 및 질소로 채우기 압력 500 psi에 도달할 때까지. 도청 및 20 분 동안 얼음에 고립 된 계속 닫습니다.</li>
		<li>천천히 질소 현상 약 실에 있는 압력을 놓고는 lysate 수집 (약 185 mL).</li>
		<li>원심 lysed 소재 셀 파편과 15 분, 4 ° c.에 대 한 800 x g에서 핵을 제거 하</li>
		<li>수집 상쾌한 비 커에는 투박한 무명을 통해 그것을 붓는 의해 얼음에 보관. 펠 릿을 버리지 마십시오.</li>
		<li>90 mL MIBSM 버퍼에 펠 릿을 resuspend (1/2 이전 볼륨). 테 플 론/유리 Dounce 균질 화기를 사용 하 여 homogenize 하 고 15 분, 4 ° c.에 대 한 800 x g에서 원심 분리를 반복</li>
		<li>수집 상쾌한 비 커에는 투박한 무명을 통해 그것을 붓는 의해 얼음에 보관. 이 상쾌한 2.2.11 단계에서 상쾌한와 함께 결합.</li>
		<li>1000 x g 15 분, 4 ° c.에 결합된 supernatants 원심</li>
		<li>수집 상쾌한 비 커에는 투박한 무명을 통해 그것을 붓는 의해 얼음에 보관.</li>
		<li>펠 릿을 삭제 하 고 15 분, 4 ° c.에 대 한 10000 x g에서 원유 미토 콘 드리 아를 포함 하는 상쾌한 원심 참고: 펠 릿 일반적으로 이루어져 있을 것 이다 두 부분: 느슨하게 하 고 꽉.</li>
		<li>신중 하 게 단단한 부분을 방해 하지 않고 느슨한 펠 릿 세척 한다. 10 mL MIBSM 버퍼에 단단한 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>단백질 농도 분석 결과 상업적인 단백질 분석 실험 키트 또는 유사한 메서드를 사용 하 여 수행 합니다. 2 L 문화 시작에서 일반적인 농도 수율은 ~ 2 mg/mL.</li>
		<li>200 단위의 RNase 무료 DNase를 추가 하 고 균등 하 게 genomic DNA의 제거를 위한 DNase를 섞어 20 분에 대 한 차가운 방에 롤러 회전을 떠나.</li>
		<li>10000 x g 15 분, 4 ° C에서 centrifuge 고 2 mL SEM 버퍼에 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 작은 테 플 론/유리 Dounce 균질 화기를 사용 하 여 모든 나머지 집계 resuspend 균질. 이상의 5 위아래 패스 파손을 피하기를 수행 합니다. 얼음에 계속.</li>
		<li>신중 하 게 60% 자당 재고 버퍼의 1.5 mL 튜브의 하단에 pipetting으로 14 ml에서 자당 기온 변화도 SW40 튜브를 준비 합니다. 신중 하 게 그것을 방해 하지 않고 60% 밴드 위에 32% 자당 재고 버퍼의 4.5 mL를 추가 합니다. 23% 자당 재고 버퍼의 1.5 mL와 함께 다시 15% 자당 재고 버퍼의 1.5 mL를 반복 합니다.</li>
		<li>자당 기온 변화도 위에 전체 미토 콘 드리 아 정지 (약 3 mL)을 로드 합니다.</li>
		<li>원심 139에서 SW40 회전자, 065 x g 60 분.</li>
		<li>조심 스럽게 갈색 밴드 전송 피 펫, 일반적으로 2-3 mL를 사용 하 여 32%와 60% 자당의 인터페이스에 수집 합니다.</li>
		<li>액체 질소와-80 ° c.에 게 스냅-동결 순화 된 미토 콘 드리 아</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Mitoribosome 준비
<ol><li>버퍼 필요 참고: 세포의 용 해 버퍼, 자당 쿠션/그라디언트 및 물의 resuspension 버퍼에 대 한 미리 다음 재고 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>10 mL 세포의 용 해 버퍼 확인: 25mm HEPES-코, pH 7.5, 150 m m KCl, 50 mM MgOAc, 2% 폴 리 에틸렌 글리콜 octylphenyl 에테르, 2mm DTT, protease 억제제.</li>
		<li>10 mL 자당 쿠션 버퍼 확인: 1 M 자당 (34 %w / v), 20 mM HEPES-코, pH 7.5, 100 m KCl, 20 mM MgOAc, 1% 폴 리 에틸렌 글리콜 octylphenyl 에테르, 2mm DTT m.</li>
		<li>5 mL 물의 resuspension 버퍼 확인: 20 mM HEPES-코, pH 7.5, 100 m m KCl, 20 m m MgOAc, 2mm DTT</li>
		<li>TLS 55 폴 리 카보 네이트 튜브에 15%-30% 선형 자당 기온 변화도 물의 resuspension 버퍼를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mitoribosome 정화<ol>
<li>얼음에 냉동된 미토 콘 드리 아 녹</li>
		<li>세포의 용 해 버퍼의 2 개를 추가,예를 들어 3 mL 미토 콘 드리 아를 6 mL 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 즉시 혼합.</li>
		<li>세포를 지원 하는 세포를 완료 하는 얼음에 5-10 분 동안 품 어 작은 테 플 론/유리 dounce 균질 화기와 균질.</li>
		<li>Lysed 자료 (약 9 mL) 30000 x g 20 분, 불용 성 물질을 제거 하 4 ° C에서 원심. 펠 릿에서 신중 하 게 상쾌한 가만히 따르다와 펠 릿을 삭제.</li>
		<li>30000 x g에서 원심 분리는 상쾌한의 되도록 4 ° C에서 20 분 동안 반복 합니다. 펠 릿에서 신중 하 게 상쾌한 가만히 따르다와 펠 릿을 삭제.</li>
		<li>TLA 120.2 튜브 (매우 명확한) 자당 쿠션 준비: 튜브 당 0.4 mL 자당 쿠션. Lysed 소재의 mL 당 1 개의 관을 준비 합니다.</li>
		<li>자당 쿠션 lysed 미토 콘 드리 아 레이어: 튜브, lysate는 결과 당 약 1 mL: 매니아도의 쿠션 비율.</li>
		<li>원심 231에서 샘플, 4 ° c.에 TLA120.2로 터에서 45 분 550 x g</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 잔여 자당을 제거 하는 물의 resuspension 버퍼의 100 µ l로 순차적으로 튜브를 헹 굴.</li>
		<li>총 100 µ l 물의 resuspension 버퍼에 산 탄을 resuspend.</li>
		<li>30에 대 한 느린 속도에 소용돌이 나머지 집계 해산 microtube 원심 분리기에서 4 ° c.에서 10 분 17,949 x g에서 원심을 s</li>
		<li>신중 하 게는 상쾌한을 수집 하 고는 원심 분리를 반복.</li>
		<li>A260에서 mitoribosome 흡수를 측정 합니다. 참고: 전형적인 수확량은 7 A260, A260와: 1.3 A280 비율.</li>
		<li>단일 선형 자당 그라데이션 튜브에 전체 샘플을 로드 합니다. 213에서 TLS 55 회전자, 4 ° c.에 120 분 626 x g에서 원심</li>
		<li>그라데이션 충분치 A260 에서 광학 밀도 결정 하 고, 함께 핵 산 피크에 해당 하는 분수 수영장. 참고: 일반적인 A260: 피크의 A280 비율 > 1.6.</li>
		<li>필요한 경우, 선택의 방법을 사용 하 여 버퍼를 교환 합니다. 변환 1 A260 을 사용 하 여 최종 농도 계산 = 0.1 mg/mL.</li>
		<li>스냅 고정 물의 resuspension 버퍼에-80 ° c.에 게 순화 mitoribosome 샘플</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

하지만 미토 콘 드리 아의 풍부한 원천이 될 것으로 알려진 동물의 조직의 비교적 쉬운 가용성은 그것에 게 mitoribosomes3,5,12,에 대 한 인기 있는 선택 시작 물자의 소스에 대해서 13, 유전자 수정 및 여 실험실에서 쉽게 복제 수 없습니다. 따라서, 균질로 경작 된 인간 세포 라인을 포함 하는 프로토콜 개발에 대 한 명확한 실용적인 필요가 하다. 주요 차이점 프로토콜 간의 조직 및 배양된 세포 세포의 용 해 및 균질의 모드입니다. 배양된 세포를 단층으로 성장에 대 한 일반적인 메서드는 테 플 론/유리 dounce 균질14입니다. 원래 준비 프로토콜 동안 효율적인 작은 비늘15개발 되었다. 그러나 500 mL의 수 용량을 가진 균질 화기를 채용을 직접 확장 가능한11,, 그것은 ~ 2 h 80% 세포를 달성 하기 위해 육체 노동의 필요 합니다. 이 3 개 이상 문제 도입: 긴 대기 시간으로 인해 세포, 큰 그릇의 바닥에 침 몰 하는 무거운 소재 인 비 균질 세포의 여러 획의 필요성 때문에 샘플의 난방. 따라서, 세포의 바람직 방법에서 가압된 용기16,17감압에 따라 질소 현상을 활용 합니다. 이 방법에서는, 세포는 세포를 부드럽게 하 고 그들을 세포에 더 취약 하 게 추운 방에 먼저 부 어. 그들은 질소 현상 장치에 배치 됩니다 자당과 마 니 톨을 포함 하는 버퍼 미토 콘 드리 아를 그대로 유지 하는 데 도움이 됩니다 삼투성 압력을 유지 하기 위해 추가 됩니다. 질소 공동 현상은 장치 다음 셀에 녹이 고는 산소가 없는 질소의 큰 볼륨으로 압력. 압력은 세포 막의 파열 결과로 솔루션에서 나온된 질소 거품. 이 방법은 다음과 같이 전단 응력과 마찰과 관련 된 기계적 균질 화 방법에 비해 몇 가지 장점이: 1) 셀에 외부 물리적 스트레스를 피할 수 있다; 2) 단 열 확장 하는 샘플을 냉각, 열 손상 세포; 3) 셀 구성 요소; 불활성 질소 가스에 의해 산화에서 보호 된다 4) pH 변경 중단 매체; 5) 과정은 균일 하 고 재현성 같은 파괴적인 세력 각 셀 내 고 샘플;에 걸쳐 적용 되기 때문에 6) 과정 빨리이 고 20-30 분 이내 완료 될 수 있다.
경작된 한 세포와 조직에서 미토 콘 드리 아의 절연 문학에서 광대 하 게, 설명 하고있다 그리고 그것은 부드러운 세포 파쇄 차동 centrifugations의 시리즈 뒤에 기반. 현재 사용된 중인 프로토콜의 대부분18세기 한가운데에 개발 된 원래 절차를 따릅니다. 기본적인 생 화 확 적인 접근은 정확한, 문학에서 강조 하 고 들 키 지 않고 남아 있는 몇 가지 오해가 있습니다. Mitoribosomes에 대 한 프로토콜을 최적화 하려면 우리가 체계적으로 조사 보고 된 일반 원칙 및 결론: 1)의 Mg2 + 포함 및 K+ 버퍼에 중요 하지 않습니다. 그러나 그것은 세포질 단백질 젤19,, 형성에서 방지 하기 위해 KCl 도움이 우리의 프로토콜에 설명 된 대로 충분 한 희석이이 현상이 발생 하지 않습니다 제공 주장 하고있다. 배제 Mg2 + 세포질 리보솜20; 오염 감소에 유용 또한, 2) 포 삼 투 환경에서 나온된 세포를 보호 하기 위해 중간 셀의 최대 가능한 볼륨 비율을 유지 필요가 없습니다입니다. 우리의 프로토콜에 삼 투 지원 충분히 자당 포함 된 버퍼와 미토 콘 드리 아 절연 버퍼에 포함 된 셀의 희석에 의해 제공 됩니다 (단계 2.II.5)은 대규모 준비에 세포의 효율적인 분리에 대 한 중요.
미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 pH는 생리 적 가치, 즉 7.5, 가까이 또한 다음 mitoribosome 준비에 대 한 최적의 pH. 바인딩 에이전트 EDTA 및 EGTA 오염 이온을 킬레이트를 격리 미디어에 추가 되 고 그들은 킬레이트 무료 마그네슘과 칼슘, 각각. 그것은 EDTA의 포함14안 미토 콘 드리 아 막 손상으로 이어질 수 있습니다, 따라서 농도 조치로 1 mM로 제한 됩니다 논의 되었습니다. 우리 하지 자당 농도 기온 변화도의 마지막 정화 단계에서 5 mM EDTA를 사용 하 여 때 어떤 차이 관찰 했습니다.
설명 하는 프로토콜은 여기는 mitoribosome의 정화에 대 한 HEK293S 파생 된 인간 세포를 사용 합니다. 준비의 품질 원자 해상도 화학적 및 구조적 조사를 얻은 샘플 수 있습니다. 한 인간 mitoribosomal 번역 단지, 품질 관리 어셈블리 및 mitoribosomal 소 단위 중간체 메서드를 적용할 수 있습니다. 또한, 암 세포는 OXPHOS 용량 및 인접 한 실질 조직21에 비해 상승 된 미토 콘 드리 아 단백질 번역 증폭가지고, 이후 mitoribosomes 암22설립된 약 대상입니다. 따라서, mitoribosomes의 특정 정화에 대 한 억제제의 존재에이 프로토콜을 사용 하 여 의료 응용 프로그램을 해야 합니다. 또한, mitoribosomal 돌연변이 미토 콘 드리 아 질병 유전23에 연결 되었습니다. 이 돌연변이 구조에 직접적인 영향 때문에, 여기에 제시 된 접근 그들의 구조적 특성에 대 한 유용할 것 이다. 프로토콜을 실험적으로 확장 하 고 다양 한 인간의 미토 콘 드리 아에서 번역의 근본적인 이해와 의료 중요성을 태 클 하는 과학적 질문에 적용 될 수 있습니다.

미토 콘 드리 아 단백질 합성 과정 13 필수 mt-mRNAs 호흡 사슬의 촉매 코어를 전문된 막 연결 된 mitoribosome에 의해 번역을 기반으로 합니다. 변경 된 미토 콘 드리 아 유전자와 단백질 co-translationally 막으로 삽입을 위한 필요는 실질적으로 미토 콘 드리 아 리보솜1의 건축을 형성 했습니다. 최근 고해상도 구조 포유류 mitoribosome의 세균 대응2,3기 막히게 다른 전반적인 모습을 보였다. 특히, 적어도 36 특정 미토 콘 드리 아 단백질 추가 됩니다, ~ 1 MDa 여분의 분자 질량, mt rRNA 두 가지에 의해 감소 하 고 갈라 지는 것이 매우 기여. 구조상 재배열 일반적으로 보편적으로 되도록 보존4허용 이전 했다 거의 모든 중요 한 함수형 기능을 변경 합니다.
새로운 주 요소 mitoribosomal subunits의 각 하나에 의해 획득, 예를 들어 작은 소 단위는 '머리' 지역에는 본질적인 GTPase 단백질 mS29를 통합 했다. 다른 번역 시스템에서 발견 되지 않은 GTPase 활동 그리고 구조는 GTPase 소 단위 어셈블리2에 역할을 할 수도 있습니다을 나타냅니다. 중앙 융기의 핵심을 형성 5S rRNA는 모든 알려진된 ribosomal 큰 소 단위의 획기적인 것으로 포유류 mitoribosome에서 누락 이며 채택 했다 mt tRNA 발 필수 빌딩 블록으로 대신2. 금지와 동료 것으로 나타났다 돼지 mitoribosome mt-tRNA-페 발5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk, 및 동료 이러한 데이터에 철저히 구명 하 고는 손상 된 mt tRNA 발 안정성을 가진 환자에서 mitoribosomes 수용할 수 있는 원리에서 mt-tRNA-페6,7발견. 이러한 특정 요소와 어떤 경로 트랜스는 mitoribosomes 통합 하는 이유-이 독특한 어셈블리 남아 알 수 없는 요소는 필요.
전반적으로, 인간 mitoribosome, 새로운 단백질 구성 요소 및 구조 요소로 mt-tRNA의 독특한 협회의 높은 복합성으로-아직-알 수 없는 미토 콘 드리 아 전용 트랜스-요인의 개입을 의미. 그러나,이 시스템의 특징의 대부분은 전통적으로8조사 곤란 했던, 미토 콘 드리 아에 고유한 때문에 작은 분자 및 품질 관리 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 전자 cryo-현미경 (cryo-EM)20고해상도 단일 입자 분석 개발 기회 지금 발생 종합적으로 기본 어셈블리, 행동 및 품질 관리는 인간의 분자 메커니즘 연구 mitoribosome입니다. 중간 인간 mitoribosome 어셈블리의 첫 번째 구조의 우리의 보고서 인식을 인간의 mitoribosome를 형성 하는 방법을 시각화 하 고 그 곳을 알아내는-그들은 새로운 trans-의 식별에 표시를 제공 합니다. 임시 어셈블리9요인.
이 초기 노력을 확장 하려면 자세히 인간 mitoribosome 정화에 대 한 빠른 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 첫 번째 부분에서 현 탁 액 셀에서 높은 순수 그대로 미토 콘 드리 아의 대규모 격리를 설명 합니다. 이 절차 9 h를 요구 하 고 쉽게 수정 고 다른 세포 유형 및 비늘에 적응. 이 프로토콜에서 중요 한 단계는 셀 깨를 질소 현상의 사용 이다. 프로토콜의 두 번째 부분 정화 mitoribosomes 개발 되었다. 이 절차 7 h 필요 하 고 충분 한 양의 생화학 및 구조 연구에 대 한 mitoribosomes 생성 합니다. 사용 하 여 순수한 미토 콘 드리 아의 시작 물자 높은-품질 최종 준비를 제공 하 고 다른 미토 콘 드 리아 고분자에 추정 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s DMEM(Modified Eagle Medium) 고포도당, GLUTAMAX 보충제, 피루브산</td><td>Thermo Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin 선택 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25001</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Freestyle 293 Expression medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>12338026</td><td></td></tr><tr><td>T175 조직 배양 플라스크(벤트 캡 포함</td>) <td>Sarstedt</td><td>83.3912.002</td><td></td></tr><tr><td>통기 캡이 있는 셰이커 플라스크</td><td>Thermo Scientific</td><td>4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800</td><td></td></tr><tr><td>250ml 원뿔형 병 튜브, 멸균</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Eve 자동 세포 카운터</td><td>NanoEnTek</td><td>E1000</td><td></td></tr><tr><td>질소 캐비테이션 셀 파쇄 용기</td><td>Parr Instruments</td><td>4635, 4639</td><td>안전 용량 : 각각 40ml, 600ml</td></tr><tr><td>Dnase (RNA 없음)</td> <td>HT 생명 공학</td><td>N401a</td><td></td></tr><tr><td>테플론 / 유리 dounce 균질화</td><td>Cambridge Glassblowing 미</td><td></td><td></td></tr><tr><td>토콘드리아 그라디언트 용 SW40 튜브</td> 요청에 따라 설계 <td>제한된 크기 Beckman</td><td>344060</td><td>폴리 프로필렌, 얇은 벽</td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.2 쿠션용 튜브</td><td>Beckman</td><td>343778</td><td>폴리카보네이트, 두꺼운 벽</td></tr><tr><td>Gradient용 TLS-55 튜브</td><td>Beckman</td><td>347356</td><td>Ultra-clear</td></tr><tr><td>Gradient Station IP</td><td>BioComp</td><td>153-002</td><td></td></tr></tbody></table>

hek 세포에서 mitoribosome의 신속한 격리

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

인간의 미토 콘 드리 아 리보솜 (mitoribosomes)는 미토 콘 드리 아 게놈에 의해 산화 인 산화 복합물의 13 필수 단백질 구성 요소를 변환 하는 전용된 세트를 소유한 다. 모든 단백질 합성 인간 mitoribosomes에 의해 완전 한 막 단백질 이기 때문에, 인간 mitoribosomes 번역 중 미토 콘 드리 아 내 막에 닿는. Cytosolic 리보솜에 비해는 mitoribosome 55S, 절반 rRNA 콘텐츠, 아니 5S rRNA 및 36 추가 단백질의 침전 계수가 있다. 따라서, 더 높은 단백질 대 RNA 비율이 비정형 구조 확인 인간의 mitoribosome 그것의 cytosolic 대응에서 실질적으로 별개.
생활에 mitoribosome의 중앙 중요성에도 불구 하 고 아무 프로토콜 인간 세포에서 그대로 복잡 한 정화를 사용할 수 없었습니다. 전통적으로, mitoribosomes 킬로그램을 요구 하는 미토 콘 드리 아-풍부한 동물의 조직에서 고립 되었다 시작 물자의. 우리는 나누어 HEK293 파생 된 인간 세포 영양이 풍부한 식 중간에 성장에서 미토 콘 드리 아 활성 미토 콘 드 리아 번역 했 고, 따라서, 재료의 구조 및 생 화 확 적인 연구의 적당 한 원천이 될 수 있는 권유 mitoribosome입니다. 그것의 구조를 조사, 우리는 HEK 세포에서 그대로 mitoribosomes의 대규모 정화에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 여기, 우리는 빠른 노동 집약 하 고 보다 효율적인 방법 대안을 전통적인 기계적 전단 기반 세포 세포의 용 해에 대 한 더 적은 질소 현상 방법 소개. 이 그대로 인간 mitoribosome 및 그것의 어셈블리 중간체의 구성을 드러내는 높은 해상도 구조 결정에 대 한 허용 하는 mitoribosome의 준비에서 결과. 여기, 우리가이 작품에 따라 제시 된 최적화 된 고만 ~ 1010 필요로 더 많은 비용 효율적인 방법을 HEK 세포 배양. 인간 mitoribosomal 번역 단지, 돌연변이, 품질 관리 어셈블리 및 mitoribosomal 소 단위 중간체를 정화 하는 메서드를 사용할 수 있습니다. 정화 확장할 수 있습니다 선형 10 배로 필요, 그리고 또한 다른 종류의 세포에 적용 하는 경우.

나누어 하 고 높은 가능한 세포 활성 mitoribosomes의 정화에 대 한 필수적인 출발점입니다. 이 프로토콜은 모든 HEK293 현 탁 액 셀에 적용 됩니다. 우리는 사내 셀 라인 T501, 항생물질을 유도할 수 있는 통제 전송 표현 안정적으로 사용 하는. 부모 셀 라인은 HEK293S-GnTI- 셀 (자료 테이블)10. 세포 성장 및 1.5 x 10에는 최소한의 밀도 유지 한다 자유형 293 식 매체에 확장 하는 동안6 셀/mL, 최대한 셀 밀도 반면 매 2 일의 2 배 속도 보장 하기 위해 5 ~ 106 셀 배 초과 하지 않아야 합니다 / mL. 3 x 106 셀/mL 이상 세포 밀도 도달 시 셀은 수송과 고 1.5 x 106 셀/mL의 최소 셀 밀도 달성 하기 위해 확장 된 볼륨에 신선 하 고 따뜻한 미디어에 resuspended. 이 분할은 수행 반복 절차에 대 한 원하는 셀 질량 달성 될 때까지 2-3 일 마다. 마지막 셀 밀도 3-4.5 mL/106 셀, x의 범위에서 다를 수 있습니다 및 적어도 2 L 미토 콘 드리 아의 격리에 대 한 시작 지점으로 필요 합니다. 세포 생존 능력을 일반적으로 유지 한다 &gt; 90%, 그리고 수확 하는 최종 문화 &gt; 95%. 항생제로 대규모 세포 배양의 치료를 권장 하지 않습니다.
차동 centrifugations의 시리즈, 후 단계 2.2.20 후 미토 콘 드리 아 서 스 펜 션의 볼륨은 일반적으로 3-5 mL의 범위에서. Mitochondria 다음 다른 세포에서 자당 기온 변화도 (그림 1)에 구분 됩니다. Stepwise 자당 그라디언트는 그라디언트 볼륨과 함께 미토 콘 드리 아 현 탁 액의 볼륨 최대한 볼륨을 원심 분리 관을 채울 준비가 되어 있습니다. 60%에 갈색 밴드를 수집 특별 한 케어가 필요 하다는 여기 / 32% 주변 버퍼에서 최소한의 오염으로 인터페이스. 가용 화 미토 콘 드리 아의 다음 단계에서 지속적인 단백질: 세제 비율을 유지 하기 위해 중요 하다. 이 단계에서 미토 콘 드리 아 단백질 농도 평가 하는 것이 좋습니다 그리고 15-20 mg 총 미토 콘 드리 아 단백질의 전형적인 수확량 10 ~10 교양 HEK 세포에서 예정 이다.
성공적인 미토 콘 드리 아 격리, 그들은 폴 리 에틸렌 글리콜 octylphenyl 에테르의 추가 의해 lysed는 고 mitoribosomes 자당 쿠션 (그림 2)를 통해 구분 됩니다. 소수 성 액체로 물질에서 mitoribosomes를 분리, 펠 릿, 세제를 포함 하지 않는 버퍼에 resuspended는 그리고 원심 분리에 의해 소수 단지는 일지도. 이 절차를 반복 하 고 mitoribosomes의 정화 정도 A260여 계량 /A280 비율, 1.3 ~ 될 것으로 예상 된다. 전형적인 수확량은 2 L 문화 시작에서 7 A260 . 이 mitoribosomal 분수 추가 큰 성 미토 콘 드리 아 단지를, pyruvate 효소 등 조미료 효소에도 포함 되어 있습니다. 수용 성 미토 콘 드리 아 단지에서 mitoribosomes를 분리 하는 상쾌한 자당 밀도 그라데이션에 적용 됩니다. 분수는 mitoribosome를 포함 하는 일반적으로 아래쪽에 위치한 튜브의 세 번째. 자당 기온 변화도의 분류는 자동된 피스톤과 또는 수동으로 50 µ L 분수는 피 펫으로 신중 하 게 복용 하거나 21 G 바늘 튜브 하단을 펀칭 하 고 방울을 수집 하 여 수행할 수 있습니다.
두 개의 주요 mitoribosomal 인구에서에서 식별 됩니다: monosome 55S 및 큰 소 단위 39S, 그림된에서 그림 3 과 그림 4. 큰 소 단위 분수의 존재 셀 매우 활성 나누어 주11에서 수확은 나왔다. Monosome 및 큰 소 단위 봉우리 사이의 비율을 변경할 수 있습니다. 바닥에 가까이 위치 하는 추가 피크 세포질 리보솜 80 년대 오염으로 준비에 나타날 수 있습니다. 참고 작은 자당 기온 변화도 스윙을 사용 하 여 회전자 TLS 55 양동이 0.4-1의광학 조밀도에 mitoribosomes의 ~ 1 mL의 급속 한 정화에 대 한 허용 하시기 바랍니다260. Monosome 및 큰 소 단위 봉우리의 분리, 분류에 따라 약간 다를 수 있습니다 하지만 일반적으로 두 봉우리의 일부 중복. 따라서,를 수집, 어떤 분수 풀 수 고려 한다 monosome, 또는 또는 큰 소 단위, 샘플에서의 가장 높은 비율을 지키기 위하여 하 고. 고해상도 cryo-EM 연구, 대 한 두 개의 mitoribosomal 인구 구분 (추가 철에 작업) 때문에 절대적으로 필요 하지 않습니다. 그러나, 더 나은 분리 필요한 경우 그것은 큰 튜브 및 해당 실행 시간을 사용 하 고 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig1.jpg"> 그림 1 : 자당 기온 변화도에 미토 콘 드리 아의 정화. 2 L 문화 시작에서 subcellular 세포 했다 분류 한 차동 centrifugations의 시리즈를 통해 프로토콜에 설명 된 대로 그리고 미토 콘 드리 아 불연속 자당 기온 변화도에 분리 되었다. 순화 된 미토 콘 드리 아 32% / 60% 인터페이스에서 낮은 대역에서 찾을 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig2.jpg"> 그림 2 : 자당 쿠션에 mitoribosomes의 정화. 2 L 시작 문화에서 원유 mitoribosomes 1 M 자당 쿠션 통해 sedimented 있습니다. 펠 릿은 세제 무료 버퍼에 resuspended 그리고 mitoribosomes 명백 하 게 2 개의 centrifugations에 의해 프로토콜에 설명 된 대로. 흡수도 준비와 일반적인 A260의 품질을 평가 하기 위해기록/A280 비율 ~1.3 (오른쪽 패널)의 증명 mitoribosome 풍부한 분수. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig3.jpg"> 그림 3 : 자당 기온 변화도에 mitoribosomes의 정화를 잘. 2 L 문화 시작에서 흡 광도 추적입니다. 분수 위에서 그라데이션의 바닥에 번호가 지정 됩니다. 두 개의 주요 mitoribosomal 인구 식별 됩니다: 큰 소 단위 (1 피크와) monosome 55S (피크 2). 인구 사이의 비율을 변경할 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig4.jpg"> 그림 4 : 전자 현미경 사진, 2D 클래스 및 3D 재건. 왼쪽된 패널: 샘플에서 monosome 2 1.23 A의 보정 확대 현미경 사진 / 픽셀. 중간 패널: 대표적인 후 처리 데이터 (2D 클래스) 그대로 monosomes를 공개. 오른쪽 패널: 3 차원 재구성. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

미토 콘 드리 아 리보솜 그들의 세균 및 세포질에서 갈라 전문 있다. 여기 우리가 어떻게 mitoribosomes HEK 세포에서 그들의 기본 구획에서 얻어질 수 있다 보여줍니다. 방법은 정지 세포에서 미토 콘 드리 아의 절연 및 mitoribosomes의 결과 정화를 포함 한다.

HEK 세포에서 Mitoribosome의 신속한 격리

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

이 절차의 전반적인 목표는 구조 적인 연구를 위해 충분한 대규모로 인간 세포주의 미토콘드리아에서 리보솜을 정화하는 것입니다. 이 미토콘드리아 리보솜 정제 방법은 복합체, 돌연변이, 품질 관리 어셈블리 및 미토리보소말 서브유닛 중급체를 번역하는 특성화를 가능하게 한다. 이들은 미토콘드리아에 있는 단백질 종합에 관하여 중요한 질문에 대답하기 위하여 이용될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 질소 캐비테이션이 세포 용해에 사용되며 10 대 배양 세포만이 고해상도 구조 결정을 위해 미토리보좀을 준비하는 데 필요하다는 것입니다. 이 기술은 미토콘드리아 번역 기계의 새로운 성분의 발견귀착될 수 있고 암 처리를 위한 새로운 치료법의 발달을 위해 더 이용될 수 있다. 텍스트 프로토콜에 따라 HEK293S 세포를 배양한 후, 7분 동안 1, 000배, 섭씨 4도에서 원심분리로 2리터의 세포를 수확한다.신중하게 슈퍼 네티미터를 장식하고 신속하게 PBS의 100 밀리리터에서 각 펠릿을 다시 중단. 그런 다음, 세포를 풀과 원심 분리는 1, 200 배 g와 10 분 동안 섭씨 4도에서 서스펜션을 원심분리합니다. 다음으로, 신중하게 상체를 탈수 한 후, 펠릿의 무게.그런 다음 MIB 버퍼 120 밀리리터를 사용하여 다시 중단하고 다시 중단된 셀을 20분 동안 차가운 방에서 팽창시둡니다. 팽창된 세포를 얼음 위에 미리 냉각된 질소 캐비테이션 챔버로 옮기습니다. 그런 다음 셀에 45밀리리터의 SM4 버퍼를 추가합니다.질소 캐비테이션 챔버를 고정하고 압력이 500 PSI에 도달 할 때까지 질소로 채웁니다. 그런 다음 탭을 닫고 20 분 동안 얼음위에 보관하십시오. 질소 캐비테이션 세포 용해 방법은 세포에 대한 외부 물리적 스트레스를 방지하고, 세포에 대한 열 손상을 방지하며, 질소 가스가 산화로부터 세포를 보호합니다.또한, 그것은 매우 재현 가능한 방법입니다. 천천히 챔버에 압력을 해제하고 lysate을 수집합니다. 이어서, 세포 파편과 핵을 제거하기 위해, 10분 동안 800배 g및 섭씨 4도에서 리세드 물질을 원심분리한다.접힌 모슬린 천을 얼음 위에 보관한 비커에 부어 상체를 수집합니다. 펠릿을 버리지 마십시오. MiBSM 버퍼의 90 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.그런 다음, 테플론 유리를 사용하여 균질화제를 사용하여 샘플을 균질화하고 원심분리를 800배, 섭씨 4도에서 10분 동안 반복한다. 다시 한 번, 얼음 위에 보관된 비커에 접힌 모슬린 천 조각을 부어 상체를 수집합니다. 그런 다음이 상체와 첫 번째 상수와 결합합니다.15분 동안 1, 000배, 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음, 이전과 같이 상체를 수집합니다. 펠릿을 버린 후, 원심분리기는 10, 000배, 섭씨 4도에서 10, 000배, 섭씨 4도에 함유된 상피를 15분간 분리한다.단단한 부분을 방해하지 않고 느슨한 펠릿을 조심스럽게 씻어 내십시오. 그런 다음 MiBSM 버퍼 10 밀리리터를 사용하여 단단한 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 200단위의 RNase-Free DNase를 샘플에 추가하여 게놈 DNA를 제거하고 차가운 방에서 롤러에 튜브를 회전하여 샘플을 균등하게 소화합니다.원심 분리는 15 분 동안 10, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리하고 펠릿을 다시 중단하기 위해 SEM 버퍼의 2 밀리리터를 사용합니다. 자당 그라데이션 위에 전체 미토콘드리아 서스펜션을 적재합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 그라데이션을 회전한 후, 전송 파이펫을 사용하여 32%와 60%의 자당 인터페이스에서 마이그레이션되는 갈색 대역을 조심스럽게 수집합니다.이 프로토콜은 질소 캐비테이션을 사용하여 세포를 분해합니다. 일단 마스터되면, 고순수하고 손상되지 않은 미토콘드리아의 대규모 격리는 9 시간 이내에 수행 할 수 있으며 다른 세포 유형및 비늘에 쉽게 수정하고 적응 할 수 있습니다. 얼음에 냉동 미토콘드리아를 해동 한 후, 미토콘드리아의 세 밀리리터에 2 볼륨의 리시스 버퍼를 추가합니다.튜브를 여러 번 반전시켜 즉시 섞는다. 작은 테플론 유리를 사용하여 용해를 돕고 얼음에 동형어를 배양하여 5~10분 동안 반응완료하십시오. 용해물 30, 000배, 섭씨 4도에서 20분간 용해성 물질을 제거합니다.그런 다음, 신중하게 상체를 수집하고 펠릿을 폐기합니다. 상체의 명확성을 보장하기 위해 원심 분리를 반복합니다. 그런 다음, 신중하게 상체를 수집하고 펠릿을 폐기합니다.용액 재료의 모든 밀리리터에 대해, 튜브에 0.4 밀리리터의 자당 쿠션을 추가하여 TLA-120.2 초투명 튜브에 자당 쿠션을 준비하십시오. 용액미토콘드리아의 약 1밀리리터를 각 자당 쿠션에 겹쳐서 2.5 대 1의 용액 대 쿠션 비율을 생성합니다. 이어서, TLA-120.2 로터에서 샘플을 231, 550배, 섭씨 45분 동안 원심분리한다.상체를 버리고 재서스펜션 버퍼의 100 마이크로리터를 사용하여 튜브를 헹구고 잔류 자당을 제거하십시오. 펠릿을 다시 중단하고 총 100 마이크로리터의 재서스펜션 버퍼로 결합합니다. 쿠션 펠릿을 재차 스펜싱하는 동안, 시료의 가열을 피하고 미토콘드리아 리보좀의 구조적 무결성을 보장하기 위해 시료의 발포를 피하기 위해 얼음에서 수행하는 것이 필수적입니다.30초 동안 느린 속도로 샘플을 소용돌이쳐 남은 골재를 용해시키고 튜브를 17, 949배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 조심스럽게 수집하고 원심 분리를 반복합니다. A260에서 미토리보솜 흡수를 측정한 후 전체 샘플을 단일 선형 자당 그라데이션 튜브에 적재합니다.원심 분리는 TLS-55 로터에서 샘플을 213, 626 배 g 및 섭씨 4도에서 120 분 동안 분리합니다. 그라데이션을 분수하기 위해 튜브의 바닥을 뚫고 96웰 플레이트에서 시료 드롭 와이즈를 수집합니다. 미토리보솜 정제는 충분한 양의 미토리보좀을 위해 7시간 이상 걸리지 않아야 합니다.이 불연속 자당 그라데이션에서 입증된 바와 같이, 정제된 미토콘드리아는 32-60%의 인터페이스에서 갈색 하부 밴드로 이동한다. 자당 그라데이션에 수용성 미토콘드리아 복합체에서 미토리보좀을 분리한 후, 2개의 주요 미토리보소말 집단이 확인되고, 단조55S 및 대형 서브유닛 39S. 큰 서브유닛 분획의 존재는 세포가 적극적으로 분할된 상태에서 수확된다는 것을 시사한다.이 패널은 픽셀당 1.23 angstroms의 보정 배율에서 모노솜 피크 2의 샘플이 있는 현미경 그래프를 보여줍니다. 여기에 는 그대로 단조로운 것을 드러내는 초기 처리 후의 데이터가 표시됩니다. 마지막으로, 단조로운 3D 재구성이 패널에 설명되어 있습니다.이 비디오를 시청 한 후, 당신은 구조 및 생화학 연구에 대한 그대로 인간의 미토리보좀을 준비하는 방법에 대한 좋은 이해를해야합니다. 우리의 프로토콜은 다른 미토콘드리아 거대 분자에 추정 될 수있는 고품질최종 준비를 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

우리는 지금 여기 정기적으로 안정적으로 바운드 ribosome 초기 체인 단지 (RNCs)를 분리하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 이 기술은 17 아미노산 긴 SecM "체포 시퀀스는"prokaryotic에서 번역 신장을 중지할 수있는 발견의 활용...

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

배우세요 질소 캐비테이션을 이용한 HEK293S 세포에서 미토리보솜 대규모 정제 방법을. 이 기술은 고해상도 구조 연구와 미토콘드리아 단백질 합성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

HEK 세포에서 Mitoribosome의 신속한 격리

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