Name: Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 배우세요 WI-38 인간 섬유아세포에서 H-Ras 유도 노화 시 반응성 산소 종과 분비형 노화 관련 표현형을 정량 측정하는 방법을. DCF-DA 염색과 유세포 분석, 실시간 PCR 및 ELISA를 활용하여 IL-6과 IL-8 수준을 분석합니다.

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이 작품 (김 영 연)를 국가 연구 한국 재단 (2015R1D1A1A01060839)에서 교부 금에 의해 그리고 (MSIT) 한국 정부에 의해 자금 한국 국가 연구 재단 (NRF) 교부 금에 의해 지원 되었다 (번호 2016R1A2B2008887 호 2016R1A5A2007009) (Jeanho 윤)에.

1. 노 쇠를 Oncogene 유도 유도
<ol><li>
준비는 H-RasV12 레트로 바이러스
	<ol>
<li>실 온에서 0.001% 폴 리-L-리 신/인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 분의 2 개 mL를 추가 하 여 100 mm 문화 접시 코트.</li>
		<li>진공에 연결 하는 유리 피 펫을 사용 하 여 폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 문화 접시를 세척.</li>
		<li>접시 3 x 106 ecotropic BOSC 23 포장 코팅 문화 접시와 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린/스, 전지와 CO2 조직 문화에서 37 ° C에서 문화 1 d 인큐베이터입니다.</li>
		<li>다음 날, transfect retroviral 포장 DNA (pGAG/폴의 2 µ g과 pVSVG의 0.25 µ g) 함께 pBabe 순수 하지 않아-H-RasV12 DNA의 2 µ g transfection 시 약을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 h에 대 한.</li>
		<li>Transfection 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 8 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>48 h 후 바이러스 성 입자를 포함 하는 미디어를 수집 하 고 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 어떤 세포질 파편을 제거 합니다.</li>
		<li>0.45 μ m 주사기 필터와 h 조-Ras 바이러스 포함 된 미디어를 필터링 합니다. 참고: 어떤 및 효율적인 바이러스 감염에 대 한 바이러스 supernatants의 해빙 하지 마십시오. 최고의 효율을 얻기 위해 바이러스 감염으로 같은 날에 수확 했다를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
H-RasV12 레트로 바이러스의 감염 WI-38 정상적인 인간의 fibroblasts
	<ol>
<li>10 %FBS 1% 페니실린/스 1 d H RasV12 레트로 바이러스를 수확 하기 전에 포함 된 DMEM 5 x 104 WI-38 셀 60 m m 문화 접시에 접시와 37 ° c.에 1 일에 대 한 문화</li>
		<li>다음 날 성장 매체를 제거 하 고 H-RasV12 레트로 바이러스 미디어의 1 mL을 추가. Polybrene 재고 솔루션 (증류수에 8 mg/mL)의 2 µ L을 포함 하는 성장 매체의 추가 1 mL를 추가 합니다. 습도 37 ℃, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에에서 1 일에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		<li>H RasV12 레트로 바이러스 혼합 후 24 h를 제거 하 고 씻어 셀 2 x 1 x PBS. 성장 매체를 추가 하 고 습도 37 ℃, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에에서 2 일 동안 puromycin의 2 µ g/mL로 세포를 치료.</li>
		<li>Puromycin 선택의 2 d, 후 성장 매체를 제거 하 고 씻어 셀 2 x 1 x PBS. 성장 매체를 추가 하 고 셀 습도 37 ℃, 5% CO2 배양 기 전 까지는 지정 된 시간 ( 그림 1A 는 회로도 참조)에 문화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 모니터링 노화 관련 된 β-galactosidase 통해 노화 얼룩
<ol><li>
다음 재고 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) 디 메 틸 formamide (DMF)에서 20 mg/mL를 준비 합니다. -20 ° c.에 솔루션 저장</li>
		<li>(126 m m) 나2HPO4.7H2O 3.377 g을 용 해 하 여 연산/나트륨 인산 염 버퍼를 준비와 연산 (36.8 m m) 100 mL의 증류수의 0.708 g. 필요한 경우 6.0, pH를 조정 합니다.</li>
		<li>0.5 M 칼륨 ferrocyanide 준비. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장</li>
		<li>0.5 M 칼륨 ferricyanide 준비. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장 참고: 노화 관련 된 β-galactosidase (SA β-gal) 얼룩 솔루션의 pH는 정확한 결과 위해 중요 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5mm 칼륨 ferrocyanide, 5 mM 칼륨 ferricyanide, 20% (v/v) 연산/나트륨 인산 염 버퍼, 그리고 1 mg/mL의 X 재고 솔루션을 diluting 하 여 신선한 SA β-gal 얼룩 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>문화 미디어를 제거 하 고 세척 셀 1 x 1 x PBS. 실 온에서 5 분 동안 3% 포름알데히드와 셀을 수정 합니다. 참고: 셀 하지는 레트로 바이러스와 함께 감염 되는 부정적인 컨트롤으로 사용 한다. 감염된 제어 셀 proliferating 그들의 상태를 유지 하기 위해 passaged를 계속 해야 합니다.</li>
	<li>셀에서 고정 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS로 그들을 씻어. 추가 갓 1 x SA β-gal 얼룩 솔루션 (1.5 mL 60mm 문화 접시에서)을 준비 합니다. 건조를 방지 하 고 37 ° c.에 24 h에 대 한 그것을 품 어 파라핀 영화와 함께 요리를 봉인 또는, 습도 챔버에 함께 요리를 품 어. 참고: 통 솔루션 3% 포름알데히드를 포함 해야 합니다 수 삭제의 유해 폐기물로. CO2 없이 인큐베이터는 인큐베이션 기간 동안 pH 변화를 방지 하는 것 이다.</li>
	<li>다음 날;에 현미경으로 세포의 착 색 상태를 확인 SA β-gal-긍정적인 세포 perinuclear 지역에 파란색 표시 됩니다. 참고: proliferating 제어 셀 SA β-gal-긍정적인 세포의 낮은 주파수 표시. 경우는 얼룩 빛, 계속 약간 더 긴 기간 동안 보육 (대표 예 그림 1B 를 참조).</li>
	<li>CCD 카메라는 10 배 또는 큰 렌즈를 사용 하 여 SA β-gal 얼룩 이미지를 취득 합니다. 충분 한 수 착 색 비율을 계산 하는 이미지의 캡처 (> 200 셀).</li>
	<li>셀의 총 수를 기준으로 SA β-gal-긍정적인 세포 수를 측정 하 여 SA β-gal 얼룩진 셀의 비율을 계산 합니다. 참고: SA β-gal 얼룩 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 기반 복제 실험 (그림 1 C)의 결과에. 적절 한 셀 밀도 SA β-gal 얼룩 실험을 위해 중요 하다. 높은 confluency 노화 관련 형태에 변화를 방해 하 고 유도 제어 셀에 긍정 신호 수 있습니다.</li>
</ol>3. 측정 h 조-Ras-유도 노화 중 반응성 산소 종 유도
<ol><li>플레이트 2 x 105 WI-38 세포 60 m m 문화에 요리 하 고 1 단계에서 설명한 대로 h 조-Ras-유도 노화를 자극. 참고:이 프로토콜은 다른 유형의 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다.</li>
	<li>표시 된 시간 시점 (2, 4, 또는 6 일), 성장 매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS와 셀. 0.05 %trypsin / EDTA 용액 1 mL와 함께 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체의 1 mL을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 셀 수를 결정 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브로 1 x 105 셀을 전송 하 고 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>신선한 2', 7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-다) 얼룩 미디어 문화 매체 (DCF 다의 작업 농도 50 µ M)의 10 mL를 10mm DCF 다 50 µ L을 추가 하 여 준비 합니다. 참고: DCF 다 빛에 민감한입니다. 빛의 노출은 피해 야 한다. 얼룩 시간과 DCF 다의 농도 세포 유형에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에서 성장 매체를 신중 하 게 제거 하 고 갓된 DCF 다 얼룩 매체의 1 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 부정적인 얼룩 제어로 얼룩진 비 샘플을 포함 합니다. 참고: DCF 다 하지 물 확산 셀 부정적인 제어로 준비 한다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 하 고 그들을 씻어 1 x 1 x PBS의 2 mL. 1 x PBS의 1 mL로 세포를 resuspend 하 고 적절 한 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 튜브 샘플을 전송.</li>
	<li>
2 ', 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-다) 형광 신호 교류 cytometer 갖춘 적절 한 레이저 소스를 사용 하 여 측정 합니다. 블루 레이저 샘플을 자극 (488 nm) 530 ± 30 nm 검출기 (FITC) 로그 눈금을 사용 하 여 내보낸된 형광을 검출 하 고.
	<ol>
<li>먼저 비 스테인드 부정적인 제어 셀을 분석 합니다. 측면 살포 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FSC)의 점 플롯에서 제어 도구를 사용 하 여 라이브 셀을 선택 하 고 죽은 세포 및 세포 잔해 제거. 참고: 셀 크기 변경 해야 신중 하 게 모니터링 FSC 대 SSC의 도트 음모에. 노화 세포의 크기가 크게 증가 하는 경우에, FSC 대 SSC의 도트 음모에서 게이팅 후 DCF 다 강도 같은 크기의 세포 인구에 비교 한다.</li>
		<li>DCF 다 표시 하는 단일 매개 변수 히스토그램에서 (488 nm) x의 로그 눈금에 형광-축과 y의 선형 눈금에 이벤트 (휴대폰 번호) 수-축에서 피크를 488 nm 레이저의 전압 조정 왼쪽 가장자리-스테인드 셀.</li>
		<li>DCF 다 스테인드 샘플 및 각 샘플에 대 한 기록 이상 10000 이벤트를 분석 합니다. 특정 흐름 cytometer 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플의 평균 형광 값을 취득 합니다. 참고: 선생님 측정 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균 값이 결과에서 계산 해야 합니다. 대표 h 조-Ras-유도 노화 결과 그림 2에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantifying 일리노이-6와 노화 관련 분 비 표현 형 분석을 사용 하 여 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 대 한 IL-8 mRNA 식
<ol><li>
총 RNA 준비
	<ol>
<li>100 m m 문화에 접시 3 x 105 부-38 세포 10 %FBS 1% 페니실린/스, 포함 된 DMEM에 요리 하 고 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화를 1 일. 각 시간 지점에 대 한 중복 문화를 준비 합니다.</li>
		<li>H-RasV12 레트로 바이러스 1 단계에서 설명한 대로 셀을 감염에 의해 노화를 유도.</li>
		<li>수확 하기 전에 1 일에서 씻어 셀 2 x 1 x PBS, FBS 없이 DMEM의 3 mL를 추가. 참고:이 단계는 ELISA 단계 5에서에서 설명한 대로 사용 조건된 매체를 생산 하기 위해 실시 됩니다. 혈 청 기아 수 있습니다 일부 민감한 세포에 일리노이-6와 IL-8 mRNAs의 식을 유도 하 고 있다. 따라서, 일리노이-6와 IL-8 mRNA 식 세포와 혈 청 기아 없이 경작 한다 비교 처음. 경우 혈 청 기아 6 IL 또는 IL-8 mRNA의 표현에 상당한 변화를 유도, 정량에 대 한 총 RNA와 ELISA에 대 한 바른된 매체 대비해 야 별도로.</li>
		<li>나중 각 샘플 24 h 조건된 매체를 수집 하 고 ELISA-80 ° C에서 매체 저장.</li>
		<li>0.05 %trypsin / EDTA 용액 1 mL와 함께 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체의 1 mL을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 단계 5에서에서 설명한 대로 ELISA 결과의 정규화에 대 한 셀 수를 결정 합니다. 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리에 의해 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 수확.</li>
		<li>부드러운 흡입에 의해 매체를 제거 하 고 RNA 추출 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 다음, 소용돌이 15 microcentrifuge 튜브를 적극적으로 s. 그 후, 클로 프롬 및 적극적으로 소용돌이 다시 추가 15에 대 한 혼합물의 200 µ L을 추가 s.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 17000 x g 에서 샘플 튜브를 원심 그럼, 신중 하 게 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 상단 단계 전송. 참고:은 interphase 및 낮은 유기 단계 한다 교란 되지 새 튜브를 상위 단계의 전송 중.</li>
		<li>소 프로 파 놀 RNA 침전 하 여 부드러운 반전에 의해 잘 그들을 혼합의 400 µ L를 추가 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 실내 온도에 튜브를 품 어.</li>
		<li>17000 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 관을 원심 그런 다음 RNA 펠 릿을 유지 하도록 상쾌한을 삭제 합니다. 75% 에탄올의 1 mL을 추가 하 여 RNA를 세척 하 고 반전 튜브 2-3 배. 17000 x g 4 ° C에서 5 분에 대 한 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>실 온에서 RNA 펠 릿 건조 하 고 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 50 µ L에서 RNA를 분해-증류수를 취급. RNA의 1 µ L를 사용 하는 분 광 광도 계와 총 RNA 농도 계량. 참고: RNA;의 용 해도 감소 시킬 것 이다 Overdrying 따라서, RNA를 overdrying 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
cDNA 준비
	<ol>
<li>얇은-벽으로 PCR 튜브에 다음을 추가 하 여 각 샘플에 대 한 반전 녹음 방송 반응 혼합물 준비: 총 RNA의 2 µ g (RNase 무료 물으로 10 µ L 볼륨 조정), RT 버퍼, 무작위 뇌관 (50 pmol), 25 x dNTP 믹스 (100의 0.8 µ L의 1 µ L x 10의 2 µ L mM), MMLV 역전사 (50 U / µ L)의 1 µ L와 5.2 µ L의 RNase 무료 물.</li>
		<li>다음 조건 열 cycler에 반전 녹음 방송 반응 프로그램 설정: 42 ° C 60 분 동안 95 ° C 5 분 장소는 PCR에 대 한 열 cycler에 시작 프로그램 관.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실시간 중 합 효소 연쇄 반응
	<ol>
<li>모든 반응에 대 한 실시간 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. 각 샘플에 대 한 반응 혼합물은 다음과 같습니다: 실시간 PCR 주인 혼합, 1 µ L 각 6 IL 또는 IL-8에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 및 매우 순수한 증류수 (DNase 및 RNase 프리)의 21 µ L x 2의 25 µ L. 표 1을 참조 하십시오. 참고: 내부 통제로 걸 RNA 뇌관을 포함 하는 각 샘플에 대 한 실시간 PCR 반응 혼합물을 준비 합니다. GAPDH는 정규화에 대 한 내부 컨트롤로 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>96-잘 광 정량 접시에 각 잘을 48 µ L 마스터 믹스와 2 µ L의 물으로 3 희석된 cDNA 제품을 추가 합니다. 3 중 각 반응을 수행 합니다. PCR 컨트롤로 cDNA 서식 파일을 포함 하지 않는 컨트롤 잘 준비 합니다.</li>
		<li>다음 조건 열 cycler에 실시간 PCR 반응 프로그램 설정: 95 ° C, 40 사이클 of15 s 95 ° c (변성), 그리고 (어 닐 링 및 확장) 60 ° C에서 1 분에서 10 분.</li>
		<li>실시간 PCR을 수행 하 고 PCR 주기 완료 후 임계값 주기 (CT) 값을 기록 합니다. 일리노이-6 또는 IL-8 2-ΔΔCΤ 메서드가20을 사용 하 여 mRNA 레벨을 계산 합니다. 참고 다음 수식을 사용 하 여 말라 수준의 정규화 후 식에 상대 배 변화 결정 됩니다.: 접어 변화 2-Δ (ΔCT)를 = 여기, ΔCT = CT, 일리노이-6 또는 IL-8-CT, 말라; 그리고 Δ (ΔCT) =T, 자극ΔC-ΔCT, 제어.
</li>
		<li>각 중복 된 샘플에 대 한 평균 값을 계산 합니다. 참고: 정량 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 기반으로 이러한 결과에. 대표 h 조-Ras-유도 노화 결과 그림 3에 나와 있습니다. 혈 청 기아 수 있습니다 일부 민감한 세포에 일리노이-6와 IL-8 mRNAs의 식을 유도 하 고 있다. 따라서, 일리노이-6와 IL-8 mRNA 식 세포와 혈 청 기아 없이 경작 한다 비교 처음. 경우 혈 청 기아 6 IL 또는 IL-8 mRNA의 표현에 상당한 변화를 유도, 정량에 대 한 총 RNA와 ELISA에 대 한 바른된 매체 대비해 야 별도로.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 분 비 형 노화 관련 분석 ELISA를 사용 하 여 분 비 하는 일리노이-6와 IL-8 단백질의 레벨 측정
<ol><li>4 단계에서 설명한 대로 재개 조건된 매체의 3 mL 노화 WI-38 셀에서 수확. 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거 합니다.</li>
	<li>10 배 조절된 매체를 집중 원심 필터 단위를 사용 하 여 20 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여. 참고: 조절된 매체의 농도 샘플 형식에 반드시 의존 하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>
조건 화 된 매체의 집중된 각 샘플의 50 µ L를 사용 하 여 적절 한 일리노이-6와 IL-8 ELISA 키트와 ELISA를 수행 합니다. 참고: 두 개의 ELISA 우물에 각 샘플을 테스트 합니다. 각 시간 지점 복제 되므로 4 단계에서이 분석 ELISA 분석 결과 샘플 준비 기술 모니터링을 우리가 있습니다.<ol>
<li>ELISA 플레이트 코팅에 대 한 희석 IL 6 또는 1 x PBS 0.5 µ g/mL의 농도를 가진 항 체 IL-8 일리노이-6 또는 0.125 µ g/mL에 대 한 IL-8. ELISA 격판덮개의 각 음에 희석된 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 필름을 밀봉 하는 ELISA 플레이트와 플레이트를 봉인 하 고 실 온에서 하룻밤 동요 없이 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x (0.05 %PBS 트윈-20). 각 잘을 블로킹 버퍼 (PBS에 1 %BSA)의 300 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 차단 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 표준 곡선을 생성 하기 위해 순차적으로 희석된 ELISA 희석 버퍼 (0.05% 트윈-20 및 0.1 %BSA PBS)에서 표준을 준비 합니다. 참고: 일리노이-6에 대 한 직렬 희석은 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 및 2000 pg/mL. IL-8에 대 한 직렬 희석 2.34, 4.69, 9.38, 18.75, 37.5, 75, 및 150 pg/mL 이다.</li>
		<li>각 잘을 100 µ L의 표준 솔루션 또는 샘플 솔루션 (µ 집중된 매체 50 L 희석 버퍼의 50 µ L) 100 µ L를 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 웰 스를 품 어.</li>
		<li>열망 하 여 표준 또는 샘플 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. IL-8에 대 한 IL 6 또는 0.25 µ g/ml 0.1 µ g/mL의 농도를 희석 버퍼와 탐지 항 체 희석. 잘 당 희석된 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 웰 스를 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 0.05 µ g/mL의 농도를 희석 버퍼 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 희석. 잘 당 streptavidin HRP 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실내 온도에 우물을 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 3, 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) 기판 솔루션을 각 영역 100 µ L를 추가 합니다. 색상 개발에 대 한 수 있도록 20 분 동안 실내 온도에 우물을 품 어. 1 M HCl 정지 솔루션의 100 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
		<li>450에서 ELISA 리더와 각의 흡 광도 읽고 nm.</li>
		<li>생성 된 표준에 대 한 표준 곡선을 플롯. 표준 곡선에 따라 조건된 중간에 IL 6와 IL-8의 농도 계산 합니다. 세포 수를 정규화 한 후 결과 플롯 합니다. 중복 된 샘플에 대 한 평균 값을 계산 합니다. 참고: ELISAs 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 따라 이러한 결과 (그림 4)에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
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<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
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<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
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<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 h 조-Ras-유도 노화 동안 세포내 선생님 레벨을 모니터링 하기 위한 방법을 제시. 라이브 세포에서 세포내 선생님 수준 양적 세포 투과 시 DCF 다를 사용 하 여 측정 될 수 있다과 cytometry 합니다. 세포질 통풍 관에 DCF 다 세포내 esterases에 의해 deacetylated 이며, 형성 높은 형광 2', dichlorofluorescein (DCF)-7' 선생님에 의해 연속적으로, 산화. DCF 형광 cytometry FL1 검출기 (그린 형광)를 사용 하 여 검색할 수 있습니다. DCF 다 얼룩 방법을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 증가 선생님 수준에서 동안 검색 WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 h 조-Ras-유도 세포 노화. 이 메서드는 선생님 수준에서 변경 사항을 모니터링 하 세포 노화의 다양 한 모델에 사용할 수 있습니다. DCF-다 함께 선생님 유도 측정 하는 데 사용 된 얼룩, 추가 방법 산화 단백질<sup class="xr...

50 년 이상 전, Hayflick와 무어 헤드 정상 세포 세포 분열1의 특정 번호 후 그들의 증식 잠재력의 고갈에 돌이킬 수 없는 성장 검거 입력 밝혔다. 이 현상은 이제 일차 노화 라고 고 organismal 노화2와 강하게 상관 하기 위하여 믿어진다. Telomeres의 점진적 침식 일차 노화의 주요 원인으로 간주 됩니다, 하지만 DNA 손상, 종양 활성화 및 산화 스트레스 등 다양 한 세포 스트레스 보고 되었습니다 다른 유형의 세포 노화를 유도 "조기 노화" 또는 "-스트레스로 노화" 라고합니다. 흥미롭게도, 조기 노화는 h 조-Ras와 BRAF oncogenes의 활성화에 따라 강력한 종양 진압 역할을 한다. 조직과 인간의 마우스 모델의 연구 생산 biomarkers 세포 노화의 종양 Ras와 BRAF 활성화 하지만에서 개발한 악성 암에 점감 되었다 premalignant 병 변에서 주로 존재 했다 강력한 증거 이러한 병 변3,,45. 노화 및 종양 억제의 역할을 넘어 세포 노화 상처 치유, 조직 복구, 면역 감시, 그리고 배아 개발6을 포함 하 여 다양 한 생리 적 과정에 역할을 이전 연구에 표시 되었습니다.
성장 검거 세포 노화7의 특징으로 광범위 하 게 공부 하고있다, 비록 증거의 중요 한 신체는 세포 반응성 산소 종 (선생님)도 세포 노화8에 기여 나왔다. 세포 노화, 일차 노화 및 노화 (OIS), oncogene 유도 포함 하 여 다양 한 유형의 동안 선생님 수준 상승 수십 년 전 원래 알려졌다9,10. 더 직접, H2O2 의 sublethal 복용량 exogenous 치료 노화11,12유도합니다. SOD1, 같은 선생님 청소 효소의 금지는 또한 조기 노화13발생합니다. 반면, 주변 산소 조건 낮은 선생님 청소 지연 노화10,,1415의 발병을 증가 하 고. 이러한 결과 의심할 여 지 없이 선생님은 중요 한 중재자 또는 세포 노화 유도의 결정 요인 다는 것을 나타냅니다. 그러나, 선생님 세포 노화와 세포 노화 중 선생님 레벨은 상승 하는 어떻게의 유도에 기여 하는 방법 조사 더 필요 합니다.
최근 연구는 노화 세포는 인접 세포와 SASP16,17를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 계시 했다. 세 조직에 노화 세포를 증식 세포의 자치 고갈 뿐만 아니라 SASP 통해 많은 경로 연령 관련 조직 장애를 통해 홍보. 다양 한 proinflammatory 요인, 일리노이-6와 같은 일리노이-8, TGFβ, 그리고 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 노화 세포에 의해 분 비 원인이 조직의 항상성, 조직 구조의 파괴의 장애를 통해 나이 관련 조직 장애 인접 셀과 살 균 염증18,19의 노화. 그러나, SASPs는 생물학 컨텍스트에 따라 유익한 효과 가질 수 있습니다. 또한, SASPs의 heterogenetic 자연 노화 세포 유형과 더 연구19에 대 한 필요성을 강조 셀 단계에 따라 달라 집니다.
여기, OIS 동안 세포내 ROS 수준을 평가 하기 위한, 빠르고 민감한 cytometry 기반 기술을 설명 합니다. 또한, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)와 ELISA를 사용 하 여 SASP 요인의 분석에 대 한 방법은 소개 했다.

<table><tbody><tr><td>시약-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>웰진</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레렌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>: 시그마 -알드리치</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌릴 &베타; D-갈락토피라노시드 (X-gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>페로시아나이드 칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>페리시아나이드 칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>웰진</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV 역전사효소</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR 마스터 2x 믹스</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 프라이머</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>초순수 증류수</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-6 ELISA 분석</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-8 ELISA 분석</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m 주사기 필터</td><td>사토리우스</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>니콘</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 분광 광도계</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>실시간 PCR 시스템</td><td>응용 Biosystems</td><td>ABI 프리즘 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 리더</td><td>Molecular Devices</td><td>EMax 마이크로플레이트 리더</td><td></td></tr></tbody></table>

oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

세포 노화 증식 능력 또는 다양 한 스트레스에 노출의 고갈에 따라 돌이킬 수 없는 성장 검거의 상태를 고려 하고있다. 최근 연구 개발, 상처 치유, 면역 감시 및 연령 관련 조직 장애를 포함 하 여 다양 한 생리 적 프로세스를 세포 노화의 역할을 확대 했습니다. 세포 주기 검거 세포 노화의 중요 한 특징은, 증가 된 세포내 반응 산소 종 (선생님) 생산 또한 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 또한, 최근 연구는 노화 세포 인접 세포와 노화 관련 분 비 형 (SASP)를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 전시 밝혔다. 세포 노화에 대 한 치료 전략에 대 한 관심이 급상승 노화 메커니즘, 세포내 선생님 등은 SASP의 정확한 이해를 위한 필요를 강조 한다. 여기, 우리는 양적 h 조-Ras-유도 세포 노화 선생님-민감한 형광 염료와 cytometry 사용 하 여 동안 세포내 선생님 레벨을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, mRNA 식의 유도 및 SASP 요인의 분 비의 분석을 위한 중요 한 기술을 소개합니다. 이러한 프로토콜은 다양 한 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다.

H 조-Ras-유도 노화의 예는 그림 1에 표시 됩니다. WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포와 H-RasV12 레트로 바이러스의 감염 유도 극적인 형태 변화 (그림 1B). 또한, 그림 1C에서 같이, SA β-gal 얼룩 활동 H RasV12 식에 따라 현저 하 게 증가 되었다. 셀의 70% 이상 보여준 SA β-gal 활동 6 d H RasV12 레트로 바이러스 감염 후 얼룩, 우리와 다른 그룹 보고 이전21 H-RasV12의 식을 성공적으로 WI-38 세포, 세포 노화 유도 나타내는 22.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포 노화 중에 세포 내 ROS 수준과 노화 관련 분비 표현형(SASP)을 모니터링하기 위한 민감한 기술을 제공하는 것입니다. 여기서, 우리는 이러한 방법이 WI-38 정상 인간 섬유아세포에서 H-Ras에 의한 노화 동안 세포 내 ROS와 SASP 인자 IL-6 및 IL-8의 수치 증가를 성공적으로 밝혔음을 입증합니다. 이러한 기술을 통해 세포 노화 중 세포 내 ROS 수준의 변화를 모니터링하고 SASP 인자의 발현을 분석할 수 있습니다.이 방법의 주요 장점은 다양한 세포 노화 모델에 적용할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법은 궁극적으로 세포 노화에서 ROS 및 SASP의 역할을 이해하고 기본 조절 메커니즘을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시연은 제 연구실의 김영연(Young Yeon Kim)과 엄지현(Jee-Hyun Um)이 시연할 예정입니다.H-Ras 레트로바이러스를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 먼저 폴리-L-라이신이 코팅된 배양 접시에 친환경성 BOSC 세포를 파종하고 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하루 동안 배양합니다. 다음 날, 제조업체의 지침에 따라 transfection 시약을 사용하여 H-Ras 레트로바이러스 DNA 및 패키징 DNA로 BOSC 세포를 transfection합니다.8시간 transfection 후 transfection 배지를 제거하고 8ml의 새 배지를 추가합니다. 48시간 후에 바이러스 입자가 포함된 배지를 수집하고 원심분리로 세포 파편을 제거합니다. 그런 다음 0.45마이크로미터 주사기 필터로 바이러스가 포함된 매체를 필터링합니다.H-Ras 레트로바이러스를 채취하기 하루 전에 60mm 배양 접시에 WI-38 세포를 플레이트화하고 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하루 동안 배양합니다. 다음 날, 성장 배지를 제거하고 1ml의 H-Ras 바이러스 배지를 추가합니다. 2마이크로리터의 폴리브레렌 원액이 포함된 1ml의 성장 배지를 추가로 추가하고 CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양합니다.감염 후 24시간이 지나면 바이러스 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 성장 배지를 추가합니다. 감염되지 않은 세포를 제거하려면 2일 동안 세포를 1밀리리터당 2마이크로그램의 퓨로마이신으로 처리하십시오. 원액을 희석하여 신선한 SA 베타갈 염색 용액을 준비합니다.배양 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 포름알데히드가

a-quantitative-measurement-reactive-oxygen-species-senescence

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 이중 노화 마커로 치료 유도 노화 암세포를 정량화하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 보여줍니다. 노화 세포의 검출 및 정량화에는 β-갈락토시다아제 기질을 사용하는 것이 포함됩니다. 기질은 노화 세포 내에서 활성 리소좀 β-갈락토시다아제에 의해 절단되어 자가형광 리포푸신 과립과 함께 노화 암세포를 표시하는 형광 생성물을 생성합니다.

therapy-induced senescent cancer cells의 유세포 분석 기반 정량화

노화가 방지하거나 종양 논란이 계속 추진할지 여부를 지정합니다. chemotherapeutical 마약 senesce하는 암 세포를 유도 할 수 있기 때문에, 노화를 연구하는 새로운 치료법을 제안 필수적이다. 그러나, 표준 및 널리 사용되는 β-갈 락토시다 분석은 주요 단점을 제공합니다. 우리는 여기에서 노화를 정량화 할 수있는 신속하고 민감한 유동 세포 계측법 기반 분석을 제안한다.

노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법

세포 노화, 세포주기 정지의 비가역적인 상태는 다양한 세포 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 여기, 우리는 노화의 마커를 평가하기 위해 세포 노화 및 방법을 유도 프로토콜을 설명합니다.

기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기

여기, 우리 유도 대 한 프로토콜의 시리즈 및 경작된 한 세포에 세포 노화의 유효성 검사를 설명합니다. 우리는 다른 노화 유도 자극에 집중 하 고 일반적인 노화 관련 마커의 정량화를 설명. 우리 모델, 섬유 아 세포를 사용 하 여 기술 정보를 제공 하지만 프로토콜은 다양 한 휴대 전화 모델에 적용할 수 있습니다.

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

이 프로토콜은 펄스 SILAC를 사용한 노화 및 비분열 세포의 대사 표지, 비표적 질량 분석법 분석 및 단백질 반감기의 간소화된 계산을 위한 워크플로우를 설명합니다.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

여기서 우리는 단일 세포에서 다중 노화 관련 마커의 시각화 및 정량화를 위한 유세포 측정 기반 방법을 제시한다.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

세포 배양 또는 쥐 종양 모델에서 화학 요법 약물에 의해 유도 된 노화 암 세포의 형광, 유세포 측정 정량화를위한 프로토콜이 제시된다. 선택적 절차에는 공동 면역염색, 대규모 배치 또는 시점 분석을 용이하게 하기 위한 샘플 고정, 유세포 분석 분류에 의한 생존 가능한 노화 세포의 농축이 포함됩니다.

유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브

이 프로토콜은 인간 지방 조직에서 분리된 기질 혈관 분획에서 노화 관련 베타-갈락토시다제(SA-β-gal) 활성을 객관적이고 단일 세포로 검출하기 위한 반사광 공초점 현미경을 제시합니다. 이 방법은 면역세포화학과 호환되며, 정량 평가를 위한 pH 조절을 포함하고, 기존의 SA-β-갤 염색보다 더 민감하고 주관적인 대안을 제공합니다.

지방 기질 혈관 분율에서 반사광을 이용한 노화 검출

이 논문은 IMR-90 인간 섬유아세포에서 노화 과정에서 리소좀 재형성을 측정하기 위한 생세포 LysoTracker 프로토콜을 제시합니다.

인간 섬유아세포의 세포 노화 정량 평가를 위한 LysoTracker를 이용한 리소좀 프로파일링

이 방법은 노화된 피부 섬유아세포가 건강한 피부에 미치는 영향을 연구합니다. 노화는 UVB 노출로 유도되며, 조절된 배지를 정상적인 섬유아세포에 적용합니다. 피부 노화 과정에서 세포 간 소통 변화를 표적으로 하는 생리활성 화합물을 평가하는 데 도움을 줍니다.

노화 세포에서 조건화된 배지를 이용한 시험 관 내 모델 내 건강한 세포 간 소통 복원을 위한 항산화제의 새로운 조합

배우세요 WI-38 인간 섬유아세포에서 H-Ras 유도 노화 시 반응성 산소 종과 분비형 노화 관련 표현형을 정량 측정하는 방법을. DCF-DA 염색과 유세포 분석, 실시간 PCR 및 ELISA를 활용하여 IL-6과 IL-8 수준을 분석합니다.

Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정

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