Name: Une mesure Quantitative des espèces réactives de l’oxygène et phénotype sécrétoire associée à la sénescence dans des fibroblastes humains normaux pendant la sénescence induite par l’oncogène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Découvrez comment mesurer quantitativement les espèces réactives de l'oxygène et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence dans des fibroblastes humains WI-38. Ces protocoles utilisent la cytométrie en flux et l'ELISA pour analyser IL-6 et IL-8.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de la recherche National de Corée (2015R1D1A1A01060839) (à Young Yeon Kim) et par une subvention de la Fondation de recherche National de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée (MSIT) (no 2016R1A2B2008887, no 2016R1A5A2007009) (à Jeanho Yun).

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li>
<li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li>
<li>Collado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+biology%3A+senescence+in+premalignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour biology: senescence in premalignant tumours.</a> Nature. 436 (7051), 642(2005).</li>
<li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+senescence+secretome+under+control%3A+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li>
<li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li>
<li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+proteins+induce+senescence+by+altering+the+intracellular+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype%3A+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
<li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons des méthodes de surveillance des niveaux intracellulaires de ROS au cours de la sénescence induite par H-Ras dans les fibroblastes humains normaux WI-38. Intracellulaire ROS dans les cellules vivantes peut être mesurée quantitativement à l’aide du réactif perméable à la cellule DCF-DA et cytométrie en flux. Après absorption cellulaire, DCF-DA est désacétylée par les estérases intracellulaires et, par la suite, oxydé par ROS pour former très fluorescent 2', 7'-dichlorofluorescéine (DCF). Fluorescence ...

Plus de 50 ans, Hayflick et Moorhead a révélé que les cellules normales entrent dans l’arrestation de croissance irréversible sur l’épuisement de leur potentiel prolifératif après un certain nombre de divisions cellulaires1. Ce phénomène est maintenant connu comme la sénescence réplicative et croit fortement en corrélation avec le vieillissement organismique2. Bien que l’érosion progressive des télomères est considéré comme une cause majeure de la sénescence réplicative, divers stress cellulaires, tels que des dommages ADN, l’activation oncogène et le stress oxydatif, ont été signalés à induire un autre type de sénescence cellulaire appelé « sénescence prématurée » ou « sénescence induite par le stress ». Fait intéressant, la sénescence prématurée joue un rôle de tumeur comprimant puissant lors de l’activation d’oncogènes tels que H-Ras et BRAF. Des études de modèles murins et tissus humains ont donné des preuves solides que les biomarqueurs de la sénescence cellulaire ont été principalement présents dans les lésions précancéreuses où oncogène Ras et BRAF sont activées mais ont diminué dans les cancers malins qui élaborés à partir ces lésions3,4,5. Au-delà de son rôle dans le vieillissement et la suppression tumorale, sénescence cellulaire a été démontrée dans des études antérieures à jouer un rôle dans divers processus physiologiques, notamment la cicatrisation des plaies, la réparation des tissus, surveillance immunitaire et développement embryonnaire6.
Bien que l’arrêt de la croissance a été particulièrement étudié comme une caractéristique de la sénescence cellulaire7, un nombre significatif de preuves suggère que les espèces réactives intracellulaire de l’oxygène (ROS) contribuent également à la sénescence cellulaire8. L’élévation des niveaux ROS au cours de différents types de sénescence cellulaire, y compris la sénescence réplicative et la sénescence induite par l’oncogène (OIS), a été rapportée à l’origine des décennies il y a9,10. Plus directement, au traitement exogène avec une dose sublétale de H2O2 induit la sénescence11,12. L’inhibition des enzymes ROS-nettoyage, comme la SOD1, provoque également la sénescence prématurée13. En revanche, faible oxygène ambiant et augmentant retard antiradicalaire ROS le début de la sénescence10,14,15. Sans aucun doute, ces résultats indiquent que les ROS sont des médiateurs importants ou des déterminants de l’induction de la sénescence cellulaire. Cependant, comment ROS contribuent à l’induction de la sénescence cellulaire et comment ROS taux sont élevés au cours de la sénescence cellulaire doivent être enquête.
Études récentes ont révélé que les cellules sénescentes ont puissant paracrine activités sur les voisins des cellules et des tissus à travers une SASP16,17. Dans les tissus âgés, cellules sénescentes promouvoir des dysfonctionnements liés à l’âge des tissus via plusieurs sentiers à travers de la SASP en plus un appauvrissement de la couche de cellules prolifératives autonome. Divers facteurs pro-inflammatoires, telles que l’IL-6, IL-8, TGFβ et métalloprotéinases matricielles (MMP), sécrétée par les cellules sénescentes, causer des dysfonctions liées à l’âge des tissus par le biais de l’altération de l’homéostasie tissulaire, destruction de l’architecture tissulaire, sénescence des cellules voisines et inflammation stérile18,19. Cependant, SASP peut avoir des effets bénéfiques selon le contexte biologique. En outre, la nature hétérogénétique de SASP dépend du type de cellules sénescentes et le stade de cellules, mettant l’accent sur la nécessité de plus amples recherches19.
Nous décrivons ici les techniques axée sur la cytométrie en flux rapides et sensibles pour évaluer les niveaux intracellulaires de ROS au cours de l’OIS. En outre, les méthodes pour l’analyse des facteurs SASP utilisation quantitative PCR en temps réel (qPCR) et ELISA sont introduites.

<table><tbody><tr><td><RÉACTIFS>FORTS</></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp ;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>polybrène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>puromycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&nbsp ;</td></tr><tr><td>formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta ; D-galactopyranoside (X-gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>ferrocyanure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>ferricyanure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>trypsine-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp ;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Transcriptase inverse</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Vert PCR master 2x mix</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Amorce aléatoire</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée ultra-pure</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Essai ELISA IL-6 humain</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>Essai ELISA IL-8 humain</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu ; Filtre à seringue m</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&nbsp ;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop spectrophotomètre</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>Système de PCR en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Lecteur</td><td>Molecular Devices</td> Lecteur <td></td>de <td>microplaques EMax</td></tr></tbody></table>

une mesure quantitative des espèces réactives de l’oxygène et phénotype sécrétoire associée à la sénescence dans des fibroblastes humains normaux pendant la sénescence induite par l’oncogène

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Sénescence cellulaire a été considérée comme un état d’arrêt de la croissance irréversible après épuisement des capacité proliférative ou l’exposition à divers stress. Des études récentes ont élargi le rôle de la sénescence cellulaire à divers processus physiologiques, y compris le développement, la cicatrisation des plaies, surveillance du système immunitaire et dysfonction liée à l’âge des tissus. Bien que l’arrêt du cycle cellulaire est une caractéristique essentielle de la sénescence cellulaire, la production d’une augmentation intracellulaire réactives de l’oxygène (DRO) a aussi démontrée à jouer un rôle important dans l’induction de la sénescence cellulaire. En outre, des études récentes ont révélé que les cellules sénescentes ont activités paracrine puissants voisins des cellules et des tissus par un phénotype sécrétoire associée à la sénescence (SASP). La forte augmentation de l’intérêt au sujet des stratégies thérapeutiques contre la sénescence cellulaire met l’accent sur la nécessité d’une compréhension fine des mécanismes de la sénescence, y compris les ROS intracellulaire et la SASP. Nous décrivons ici les protocoles pour évaluer quantitativement les niveaux intracellulaires de ROS au cours de la sénescence cellulaire induite par H-Ras à l’aide de colorant fluorescent ROS-sensible et cytométrie en flux. En outre, nous introduisons des techniques sensibles pour l’analyse de l’induction de l’expression de l’ARNm et la sécrétion des facteurs de la SASP. Ces protocoles peuvent être appliqués aux divers modèles de sénescence cellulaire.

Un exemple de la sénescence induite par H-Ras est illustré à la Figure 1. Une infection de fibroblastes humains normaux de WI-38 avec le rétrovirus H-RasV12 provoqué des changements morphologiques dramatiques (Figure 1 b). En outre, comme le montre la Figure 1, activité coloration SA β-gal a augmenté remarquablement une expression H-RasV12. Plus de 70 % des cellules ont montré SA β-gal coloration act...

ROS intracellulaire a été démontré à jouer un rôle important dans l’induction de la sénescence cellulaire. Nous décrivons ici une analyse sensible pour quantifier les niveaux ROS au cours de la sénescence cellulaire. Nous fournissons également des protocoles d’évaluation le phénotype sécrétoire associée à la sénescence, qui aurait été contribue à diverses dysfonctions liées à l’âge.

Une mesure Quantitative des espèces réactives de l’oxygène et phénotype sécrétoire associée à la sénescence dans des fibroblastes humains normaux pendant la sénescence induite par l’oncogène

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

L’objectif global de cette procédure est de fournir des techniques sensibles pour surveiller les niveaux de ROS intracellulaires et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence, ou SASP, pendant la sénescence cellulaire. Ici, nous démontrons que ces méthodes révèlent avec succès l’augmentation des niveaux de ROS intracellulaires et des facteurs SASP IL-6 et IL-8 pendant la sénescence induite par H-Ras dans les fibroblastes humains normaux WI-38. Ces techniques permettent de suivre les changements dans les niveaux de ROS intracellulaires au cours de la sénescence cellulaire et d’analyser l’expression des facteurs SASP.Le principal avantage de cette méthode est qu’elle peut être appliquée à de nombreux modèles de sénescence cellulaire différents. Par conséquent, cette méthode peut finalement nous aider à comprendre le rôle des ROS et des SASP dans la sénescence cellulaire et à étudier les mécanismes de régulation sous-jacents. La démonstration de la procédure sera assurée par Young Yeon Kim et Jee-Hyun Um de mon laboratoire.Commencez cette procédure en préparant le rétrovirus H-Ras. Tout d’abord, ensemencez des cellules BOSC écotropes dans une boîte de culture enrobée de poly-L-ly

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Biologie du développement

Cette vidéo illustre un test basé sur la cytométrie en flux pour quantifier les cellules cancéreuses sénescentes induites par le traitement avec des marqueurs de sénescence doubles. La détection et la quantification des cellules sénescentes impliquent l’utilisation d’un substrat de β-galactosidase. Le substrat est clivé par la β-galactosidase lysosomale active à l’intérieur des cellules sénescentes, produisant un produit fluorescent qui, en conjonction avec des granules de lipofuscine...

Quantification par cytométrie en flux de cellules cancéreuses sénescentes induites par la thérapie

Que la sénescence empêche ou favorise la tumorigenèse reste controversée. Comme les médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire des cellules cancéreuses à vieillir, est essentiel à étudier la sénescence de proposer de nouvelles thérapies. Cependant, le test β-galactosidase standard et largement utilisé présente des inconvénients majeurs. Nous vous proposons ici un test basé sur la cytométrie flux rapide et sensible pour quantifier la sénescence.

Une méthode sensible pour quantifier les cellules sénescentes du cancer

Cellulaire sénescence, l'état irréversible de l'arrêt du cycle cellulaire, peut être induite par diverses contraintes cellulaires. Ici, nous décrivons les protocoles pour induire la sénescence cellulaire et des méthodes pour évaluer les marqueurs de sénescence.

Techniques pour induire et Quantifier cellulaire sénescence

Ici, nous discutons une série de protocoles pour l’induction et la validation de la sénescence cellulaire dans les cellules cultivées. Nous nous concentrons sur différents stimulus induisant la sénescence et décrire la quantification de marqueurs communs liés à la sénescence. Nous fournissons des détails techniques à l’aide de fibroblastes comme modèle, mais les protocoles peuvent être adaptés aux différents modèles cellulaires.

Induction et la Validation de la sénescence cellulaire dans les cellules humaines primaires

La sénescence cellulaire est le facteur clé dans le développement de pathologies chroniques liées à l'âge. L'identification des thérapies qui ciblent les cellules sénescentes s'avère prometteuse pour prolonger le vieillissement sain. Ici, nous présentons un essai nouveau pour l'identification des sénotherapeutics basés sur la mesure de l'activité associée de sénescence de 'Galactosidase dans les cellules simples.

Essai de dépistage basé sur sA-MD-Galactosidase pour l'identification des médicaments sérothérapeutiques

Ce protocole décrit le flux de travail pour le marquage métabolique des cellules sénescentes et non divisées avec SILAC pulsé, l’analyse par spectrométrie de masse non ciblée et un calcul rationalisé des demi-vies des protéines.

Mesure des taux de renouvellement des protéines dans les cellules cultivées sénescentes et non divisées avec marquage métabolique et spectrométrie de masse

Nous présentons ici une méthode basée sur la cytométrie en flux pour la visualisation et la quantification de plusieurs marqueurs associés à la sénescence dans des cellules individuelles.

Imagerie simultanée et détection par cytométrie en flux de plusieurs marqueurs de sénescence fluorescents dans les cellules cancéreuses sénescentes induites par le traitement

Un protocole de quantification fluorescente par cytométrie en flux des cellules cancéreuses sénescentes induites par des médicaments de chimiothérapie en culture cellulaire ou dans des modèles tumoraux murins est présenté. Les procédures facultatives comprennent le co-immunomarquage, la fixation d’échantillons pour faciliter l’analyse de grands lots ou de points temporels, et l’enrichissement de cellules sénescentes viables par tri cytométrique en flux.

Sonde β-galactosidase associée à la sénescence fluorescente rouge lointain pour l’identification et l’enrichissement de cellules tumorales sénescentes par cytométrie en flux

Ce protocole présente une microscopie confocale à lumière réfléchie pour la détection objective et unicellulaire de l’activité bêta-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal) dans la fraction vasculaire stromale isolée du tissu adipeux humain. La méthode est compatible avec l’immunocytochimie, intègre des contrôles du pH pour l’évaluation quantitative, et offre en outre une alternative plus sensible et moins subjective à la coloration conventionnelle SA-β-gal.

Détection de la sénescence à l’aide de la lumière réfléchie dans la fraction vasculaire stromale adipeuse

Cet article présente un protocole LysoTracker pour cellules vivantes afin de mesurer le remodelage lysosomal pendant la sénescence chez les fibroblastes humains IMR-90.

Profilage lysosomal avec LysoTracker pour une évaluation quantitative de la sénescence cellulaire chez les fibroblastes humains

Cette méthode étudie comment les fibroblastes cutanés sénescents affectent les fibroblastes sains. La sénescence est induite par exposition aux UVB, et le milieu conditionné est appliqué sur des fibroblastes normaux. Elle aide à évaluer les composés bioactifs ciblant la communication cellulaire modifiée dans le vieillissement cutané.

Nouvelle combinaison d’antioxydants pour restaurer une communication intercellulaire saine dans un modèle in vitro utilisant un milieu conditionné à partir de cellules sénescentes

Découvrez comment mesurer quantitativement les espèces réactives de l'oxygène et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence dans des fibroblastes humains WI-38. Ces protocoles utilisent la cytométrie en flux et l'ELISA pour analyser IL-6 et IL-8.

Une mesure Quantitative des espèces réactives de l’oxygène et phénotype sécrétoire associée à la sénescence dans des fibroblastes humains normaux pendant la sénescence induite par l’oncogène (Vidéo) | JoVE Journal

Une mesure Quantitative des espèces réactives de l’oxygène et phénotype sécrétoire associée à la sénescence dans des fibroblastes humains normaux pendant la sénescence induite par l’oncogène

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