Name: 3 차원 (3D)-배열 하는 높은 처리량 Zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: 학습하세요 3D 프린팅 템플릿을 활용한 제브라피시 배아 고처리량 배열 방법을. 이 기술은 96웰 플레이트 준비 시간을 단축하여 신경과학 및 발달생물학 연구의 효율성을 크게 향상시킵니다.

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이 작품은 "1000plan" 프로그램, Tongji 대학, 그리고 NSFC 부여 # 21607115에서 시작 자금 및 21777116 (린)에 의해 지원 되었다.

1. 디자인 및 템플릿 개 Zebrafish 태아의 제조
<ol><li>
8에서 12, 96-잘 레이아웃을 표준 96 잘 접시를 맞는 arraying 서식 파일을 디자인 합니다. 크기는 위 태아 함정 챔버에 대 한 그림 1A 에 나열 된 사용 (보조 파일 참조).
	<ol>
<li>함정에 대 한 잘 그림 1B 및 1 D 에 표시 된 크기를 사용 합니다.</li>
		<li>그림 1C 의 크기를 사용 하 여 바닥 진공 챔버에 대 한.</li>
		<li>그림 1B 에서 치수를 사용 하 여에 어에 대 한 / 콘센트.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(0.1 m m 정밀도)로 3D 프린터를 사용 하 여 인쇄 서식 파일; 인쇄에 사용할 권장된 수 지에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 참고: 0.1 m m 정밀 3D 프린터 arraying 서식 파일의 제작에 대 한 권장 ( 재료의 표참조). 서식 파일의 표면에 대 한 제안 된 색상은 어두운 회색 또는 검은색.</li>
</ol>2. Zebrafish 태아 산란
<ol><li>두 켤레 상자 1 일 산란 전에 짝짓기 당 남성과 여성의 물고기를 놓습니다. 별도 남성 그리고 투명 한 플라스틱 분배기에 의해 여성.</li>
	<li>벗을 디바이 더 아침에 남성과 여성의 생선을 혼합.</li>
	<li>남성과 여성의 물고기를 제거 하 고 zebrafish 태아 파인 메쉬 스 트레이너를 사용 하 여 수집 합니다. 세척 배아를 250 mL 계란 물 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>접시 (직경 90 mm) Holtfreter의 솔루션에 수집 된 배아를 전송 ( 재료의 표참조) 죽음과 unfertilized 배아는 stereomicroscope를 사용 하 여 제거.</li>
	<li>28.5 ° C 인큐베이터에 배아를 놓습니다. 게시물 수정 (hpf)에서 4 h, 배아 관찰 하 고 모든 죽은 건강에 해로운 배아를 제거. 배아는 다음 단계에 대 한 준비가 지금입니다.</li>
</ol>3입니다. 개 서식 파일의 준비
<ol><li>템플릿 2-3 시간 500 mL 이온을 제거 된 물으로 세척 하 고 5 분 동안 건조 오븐 (45 ℃)에 넣어.</li>
	<li>테이프 씰링 필름 (그림 21 단계)의 조각으로 하단 챔버.</li>
	<li>서식 파일의 아래쪽에 공기 출구를 통해 진공 펌프를 연결 합니다. 참고: 권장된 최대 진공 진공 펌프에 대 한 0.1 Mpa 이다. 사용 하는 진공의 강도 알고 있어야 합니다. 부정적인 압력 너무 강한 경우에, 압력을 낮은 씰링 필름에 있는 십자가 모양의 구멍을 잘라.</li>
</ol>4. 96 잘 접시에 Zebrafish 태아 개
<ol><li>그림 2, 2 단계에서에서와 같이 약 150 배아는 서식 파일에 장소 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>3.3 단계에서 씰링 필름에 의해 봉인 챔버에 부정적인 압력 생성 하 공기 출구에 진공 펌프를 연결 합니다.</li>
	<li>각 잘 한 배아 속은 (그림 2, 3 단계) 때까지 가로 전체 템플릿 흔들. 참고: 경우에 Holtfreter의 솔루션은 배아 각 우물에 갇혀 있다 전에 마르면, 함정 챔버에 추가 Holtfreter의 솔루션을 추가 하 고이 단계를 반복.</li>
	<li>여분의 Holtfreter 솔루션 및 웰 스 (그림 2, 4 단계)에 침투 하지 배아 폐기.</li>
	<li>해제을 진공 펌프를 분리 합니다.</li>
	<li>(그림 2, 5 단계) 서식 파일에 대 한 표준 96 잘 접시를 거꾸로 배치 하 고 (그림 2, 6 단계) 동시에 회전.</li>
	<li>서식 파일의 아래쪽을 누르거나 공기 연결 콘센트 압축된 가스 뿌리에 96 잘 접시 (그림 2, 6 단계)에 서식 파일에서 모든 갇힌된 배아를 전송 할 수 있는.</li>
	<li>4.1 4.8 추가 멀티 잘 접시 준비 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>씰링 필름을 제거 하 고 차후 사용을 위해 500 mL 이온된 물으로 아래로 위에서 3 번 템플릿 세척. 참고: 서식 파일 청소 같은 에탄올, 어떤 유기 용 매를 사용 하지 마십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Leslie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+could+help+to+personalize+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments.</a> Science. 357 (6353), 745-745 (2017).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Transformation%2C+Speciation%2C+and+Hazard+Potential+of+Copper+Particles+in+a+Model+Septic+Tank+System+Using+Zebrafish+to+Monitor+the+Effluent%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent.</a> ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspect+ratio+plays+a+role+in+the+hazard+potential+of+ceo2+nanoparticles+in+mouse+lung+and+zebrafish+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract.</a> ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+in+zebrafish+speeds+up+hazard+ranking+of+transition+metal+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles.</a> ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).</li>
<li>Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+Scanning+Transmission+electron+microscopy+%28nanotomy%29+of+healthy+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Phenotype+Recognition+for+Zebrafish+Embryo+Based+In+vivo+High+Throughput+Toxicity+Screening+of+Engineered+Nano-Materials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Tu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Categorization+and+Scoring+of+Solid%2C+Part-Solid+and+Non-Solid+Pulmonary+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22in+CT+Images+with+Convolutional+Neural+Network.+Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules.</a> in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).</li>
<li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement%3A+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li>
<li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li>
</ol>

저자는 설명된 3D 인쇄 서식 파일에 대 한 특허를 가득 있다.

3D 인쇄 템플릿 개 zebrafish 태아의 성공적인 구현에 대 한 세심 한 관심을 필요로 하는이 프로토콜에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다.
Arraying 서식 파일의 디자인에서 가장 중요 한 요소는 함정을 잘 이다. 확실 하 게 하는 단 하나의 배아 각 우물에 갇혀, 하나 지름과 함정 우물의 깊이 통해 구멍의 지름에 세심 한 관심을 기울여야 한다. 권장된 직경 내에서 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 1.5 ~ 2 배입니다. 잘 함정의 깊이 이어야 한다 내 2 시간 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 같은 우물에서 배아의 스태킹 피하기 위해. 통해 구멍의 지름을 이어야 한다 약 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 절반을 배아는 구멍을 통해 부정적인 압력에 의해 압력을 받고 피하기 위해. 디자인의 복잡성 때문에 3D 인쇄 기술은 arraying 서식 파일의 제작에 대 한는 것이 좋습니다.
<p...

인기 모델 생물으로 zebrafish 의학 및 독극물1,2,,34의 분야에서 널리 사용 됩니다. 생체 외에서 플랫폼에 비해, zebrafish 제공 훨씬 더 큰 생물 복잡 하나 또는 2 개의 세포 유형 제공 하지 못했습니다. 모델, zebrafish의 큰 통치, 빠르고 동시 배아 개발 및 높은 기관 전체 유기 체 외 반투명 대규모 독성 또는 약/화합물5를 심사에 사용 될이 모델 독특한 이점을 주었다. 매주 성인 zebrafish의 한 쌍에 의해 생성 하는 배아의 수백 다른 모든 동물 모델을 능가 하 고 높은 처리량 검열을 위해 적당 한 만든.
제 브라를 사용 하 여 일반적인 심사 절차 많은 성인 zebrafish 산란, 태아 선택, 그리고 그들이 물 침수를 통해 노출 대상이 되 적당 한 용기에 배아를 개 같은 수동 작업이 포함 됩니다. 태아의 개발은 모니터링 및 사망률, hatchability 등 비정상적인 관찰 끝점 자주 수동으로 평가 화학 물질의 독성 또는의 효과의 표시의 예비 식별으로 사용 약 또는 화합물입니다. 속도 심사 절차를, 자동화 된 이미징 및 컴퓨터 기반 이미지 분석 등 접근은 이전 탐험 되었습니다 있다. 예를 들어 현미경 이미징 기능 높은 콘텐츠로 384 분의 96 잘 접시6에서 다양 한 발달 단계에서 자동화 된 밝은 필드 또는 형광 이미징 zebrafish 태아에 수행 적응 되었습니다. 현미경과 함께 미세 장치는 뇌 뉴런7의 이미징에 대 한 현재 조작을 통해 zebrafish 애벌레를 사용 되었다. 이러한 접근 수 크게 전통적인 수동 작업에 비해 이미지 취득의 효율성을 향상 시킵니다. 또한, 생성 되는 이미지의 큰 숫자, 이미지 분석 도구 또한 개발 되었습니다 속도 데이터 처리를 같이 리 외 와 화 외. 8 , 9.
이미징 및 이미지 분석의 처리량 수준을 증가, 심사에 대 한 속도 제한 단계 96-또는 384-잘 접시에 배열 하는 일반적으로 의미 노출 zebrafish 태아를 준비 하는 과정은 취소 되었습니다. 이 병목 단계를 해결 하기 위해 비전 가이드 로봇 Mandrell 외. 에 의해 개발 되었다 10 와 미국 수동 처리 하지만 악기를 대체 하는 이전11 꽤 되었고 이러한 기술을 구현 하는 깊은 학습 곡선입니다. 따라서, 사용 하기 쉬운 접근 된다 더 zebrafish 심사 처리량 수준을 개선 하는 하나의 중요 한 요소 이며이 작품의 주요 목적은 제공 하기.
이 작품에서는, 우리는 설계 및 3D 인쇄 하 여 서식 파일을 배열 하는 배아를 조작. 이러한 arraying 서식 파일 표준 96 잘 접시와 맞는 우물으로 zebrafish 태아를 모 함 하도록 설계 되었습니다. 배아를 선택 하 고 개별 음 하나 하나에 그들을 배열, 대신 하나를 수행할 수 배아 함정 및 배열 모든 96 배아 multiwall 격판덮개로 한 번에. 이 서식 파일 및 다음 프로토콜을 사용 하 여, 하나 크게 어느 것이 기간 부스트 심사 용량 적어도 열 배, 수동 조작에 비해 multiwall 접시에 배아를 배열의 효율성을 증가할 수 있었다. 프로토콜 아래에 설명 된 템플릿, zebrafish 산란, 배아 수집, 배열 및 배열에 대 한 전반적인 디자인을 포함 한다. 그림 1 에서는 arraying 서식 파일의 전반적인 디자인. 그림 2 는 부품 3 및 4에 설명 된 서식 파일을 사용 하 여 단계별 프로토콜에 대 한 개요를 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>얼룩말 시설</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td>Z-A-S5</td><td></td></tr><tr><td>짝지어주는 상자</td><td>상해 Haisheng Biotech Co., 주식 회사.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세척 병, 500 ml</td><td>Sangon Biotech</td><td>F505001-0001</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Vetec</td><td>V900058-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화 칼륨</td><td>시약 Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td>칼슘 Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 나트륨&nbsp;</td><td>Vetec</td><td>v900182-500G</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루 수화물</td><td>TCI</td><td>M0501</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10011008</td><td></td></tr><tr><td>바다 소금</td><td>인스턴트 오션</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675M</td><td></td></tr><tr><td>제어 드롭 파스퇴르 Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>생화학 인큐베이터</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>LRH-250</td><td></td></tr><tr><td>3D 프린터</td><td>UnionTech</td><td>Lite600</td><td></td></tr><tr><td>감광성 수지</td><td>UnionTech</td><td>UTR9000</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>SHB-IIIA</td><td></td></tr><tr><td>접착제 PCR 플레이트 씰</td><td>Solarbio</td><td>YA0245</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>멀티 8 채널 피펫 30-300 &mu; l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>압축 가스 살포기</td><td>Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.</td><td>ST1005</td><td></td></tr><tr><td>DI 물</td><td>Thermo</td><td>GenPure Pro UV/UF</td><td></td></tr><tr><td>건조 오븐</td><td>상하이 Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>BPG-9106A</td><td></td></tr><tr><td>시설 내 물 시스템 물</td><td></td><td></td><td> s 워터 시스템</td></tr><tr><td>계란 물</td><td></td><td></td><td>희석 60mg " 인스턴트 오션" 바다 소금 및 0.25 mg/L 메틸렌 블루 1 L DI 물</td></tr><tr><td>Holtfreter' s 용액</td><td></td><td></td><td>7.0g 염화나트륨 (NaCl), 0.4g 중탄산 나트륨 (NaHCO3), 0.1g 염화칼륨 (KCl), 0.235g 염화칼슘 (CaCl2.2H2O)를 1.9L DI 물에 용해시킵니다. HCl을 사용하여 pH를 7로 조정하고 Di water를 사용하여 부피를 2L로 조정합니다</td></tr></tbody></table>.

3 차원 (3d)-배열 하는 높은 처리량 zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

제 브라는 세계적으로 인정된 민물 유기 체 자주 사용 개발 생물학, 환경 독성, 그리고 인간의 질병에 관련된 연구 분야 이다. 큰 통치, 배아 반투명, 빠르고 동시 개발, 등, 등의 독특한 기능 zebrafish 태아는 종종 대규모 화학 물질의 독성 평가 및 사용 약물/화합물 심사. 일반적인 심사 절차 포함 성인 zebrafish 산란, 배아 선택, 다 잘 판에 배아를 개. 거기에서 태아 노출 및 화학 물질, 독성을 복종 된다 또는 마약/화합물의 효과 phenotypic 관측에 따라 상대적으로 신속 하 게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로세스 중 개 배아 처리량 수준을 제한 하는 가장 시간이 많이 걸리는 하 고 노동 집약적인 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜에서 선물이 3D 인쇄 arraying 서식 파일의 사용과 결합 하 게 진공 속도이 힘 드는 단계를 조작 하는 혁신적인 접근 방식. 본 프로토콜 arraying 템플릿, 상세한 실험 설정 및 대표 결과 다음 단계별 절차의 전반적인 디자인을 설명 합니다. 구현 될 때,이 방법은 테스트 과목으로 zebrafish 태아를 사용 하 여 연구 응용 프로그램의 다양 한에서 도움이 증명 해야 합니다.

그림 3 은 전형적인 3D 인쇄 arraying 템플릿을 보여준다. 이 감광 성 수 지 원료로 사용 하 여 템플릿과 3D 프린터;에 의해 만들어진 블랙 페인트의 레이어 배아의 색상에 더 나은 대조를 제공 하기 위해 적용 되었습니다. 96 웰 스 (8으로 12)의 위치는 표준 96 잘 접시와 맞게 설계 되었다. 마찬가지로, 384 (16 24) 잘 서식 파일 또한 디자인 될 수 하 고 동일한 방법을 사용 하 여 조작 합니다. 거꾸로 챔버는 더 나은 적합을 제공 하기 위해 표준 96 잘 접시 보다 약간 더 큰. 홈 또한 배열 하는 동안 여분의 배아를 개최 하도록 설계 되었습니다.
겸손 한 속도로 20 접시만 2 ~ 3 접시 수동으로 준비 될 수 있는 하는 동안 30 분 이내 3D 인쇄 arraying 서식 파일을 ...

여기, 우리 디자인 하 고 서식 파일, 높은 처리량 zebrafish 태아 96 잘 접시에 배열에 대 한 같은 서식 파일의 사용에 자세한 절차 뒤 개 zebrafish 태아 조작 프로토콜을 제시.

3 차원 (3D)-배열 하는 높은 처리량 Zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

이 방법은 제브라피시 배아 배열 절차의 속도를 크게 높이고 제브라피시를 고처리량 스크리닝에 진정으로 적합하게 만들 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3D 프린팅 템플릿을 사용하여 제브라피시 배아를 96 또는 384웰 매트릭스에 사전 배열하여 매우 효율적인 플레이트 준비 프로세스를 용이하게 한다는 것입니다. 우리는 모듈식 플레이트의 각 웰에 개별 배아를 수동으로 선택하고 선택하여 나노 입자를 스크리닝하는 동안 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었고 효율성을 높이고자 했습니다.Tianyu 외에도 동료 대학원생인 Yue Jiang이 절차를 시연할 예정입니다. 표준 96웰 플레이트에 맞는 12 x 8 96웰 레이아웃으로 배열 템플릿을 설계하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.0.1mm 정밀도의 3D 프린터를 사용하여 템플릿을 인쇄합니다. 템플릿의 일부 주요 구성 요소는 entrapment chamber, entrapment well, vacuum chamber 및 air-in outlet입니다. 제브라피시 배아 산란을 수행하려면 먼저 투명한 플라스틱 칸막이로 수컷과 암컷을 분리합니다.그런 다음 산란 하루 전에 짝짓기 상자 당 두 쌍의 수컷과 암컷 물고기를 놓습니다. 산란 당일에는 아침에 칸막이를 벗고 수컷과 암컷 물고기를 섞습니다. 수컷과 암컷 물고기를 제거하고 미세한 그물망 여과기를 사용하여 제브라피시 배아를 수집합니다.달걀수 250ml로 배아를 씻습니다. 수집된 배아를 Holtfreter's Solution을 사용하여 Petri 접시로 옮깁니다. 실체 현미경을 사용하여 죽은 배아와 수정되지 않은 배아를 제거합니다.배아를 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 넣습니다. 수정 후 4시간이 지나면 배아를 관찰하고 죽거나 건강하지 않은 배아를 제거합니다. 이제 배아는 다음 단계를 밟을 준비가 되었습니다.500ml의 탈이온수로 템플릿을 2-3회 세척한 후 건조 오븐에 5분 동안 넣습니다. 그런 다음 바닥 챔버를 밀봉 필름으로 테이프로 붙입니다. 템플릿 하단의 공기 배출구를 통해 진공 펌프를 연결하여 밀봉 필름으로 밀봉된 챔버에서 음압을 생성합니다.플라스틱 이송 피펫을 사용하여 약 150개의 배아를 템플릿에 넣습니다. 각 웰에 하나의 배아가 갇힐 때까지 전체 템플릿을 수평으로 흔듭니다. 이 단계에서는 사용 가능한 모든 제브라피시 배아를 확인하고 확인하는 것이 중요합니다.Holtfreter 버퍼가 매우 낮으면 템플릿을 흔들어 버퍼를 추가할 수 있습니다. 여분의 Holtfreter's Solution과 우물에 갇히지 않은 배아를 폐기하십시오. 진공 펌프를 끄고 분리하십시오.표준 96웰 플레이트를 템플릿에 거꾸로 놓고 동시에 회전합니다. 템플릿의 바닥을 두드리거나 공기 배출구를 압축 가스 분진 캔에 연결하여 템플릿에서 갇힌 모든 배아를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 마지막으로 밀봉 필름을 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 500ml의 탈이온수로 템플릿을 위에서 아래로 세 번 세척합니다.여기에 표시된 것은 템플릿에 의해 배열된 96웰 플레이트의 부분 이미지입니다. 반대로, 이 이미지는 수동으로 배열된 96웰 플레이트의 부분 이미지를 보여줍니다. Manual and Arraying template method에 의해 도금된 후의 배아의 전반적인 건강 상태가 여기에 표시됩니다.배아의 부화율, 생존율 및 기형률에 기초하여, 두 경우 모두 배아의 전반적인 건강에 대한 유의미한 영향은 관찰되지 않았다. 이 기술을 완전히 익히면 제대로 수행되면 2-3분 안에 96 또는 384웰 플레이트 1개를 준비할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 이 모델 유기체의 새로운 기능을 최대한 활용하고 진정한 체외 고처리량 스크리닝을 달성할 수 있는 길을 열었습니다.

a-3-dimensional-3d-printed-template-for-high-throughput-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

제브라 피쉬는 척추 동물의 발생 과정과 모델 인간의 질병을 연구 할 수있는 좋은 실험 유기체이다. 여기, 우리가 함께 제브라 피쉬 배아에서 수동 높은 처리량 화학 화면을 수행하는 방법에 대한 프로토콜 설명 판독을 현장 하이브리드 (WISH)에서 전체를 장착.

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

여기서, 우리는 정상적인 발달 과정을 방해 하지 않고 제 브라 피시 배아의 크기를 감소 시키는 방법을 설명 한다. 이 기술을 사용 하면 크기 변경에 대 한 패턴 스케일링 및 개발 견고성을 연구할 수 있습니다.

배아 패턴 스케일링 연구를 위한 제 브라 피시 수술 크기 감소

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 적층을 사용하여 미세유체 장치를 제조하는 혁신적인 방법은 여러 개의 살아있는 제브라피시 배아를 포획하고 이미징하는 비용과 복잡성을 크게 줄여줍니다.

저비용 폴리에틸렌 테레프탈레이트 라미네이션 미세유체역학(Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics) 설계로 멀티플렉스 제브라피시 이미징

학습하세요 3D 프린팅 템플릿을 활용한 제브라피시 배아 고처리량 배열 방법을. 이 기술은 96웰 플레이트 준비 시간을 단축하여 신경과학 및 발달생물학 연구의 효율성을 크게 향상시킵니다.

3 차원 (3D)-배열 하는 높은 처리량 Zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄

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