Name: 타악기 황 호르몬 분 비의 평가 대 한 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링을 자주 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 학습하세요 쥐 꼬리 끝 채혈법을 통해 자유로운 상태에서 황체형성호르몬(LH) 맥동 분비를 측정하는 신경내분비학 연구 방법을. 스트레스를 최소화하여 정확한 호르몬 변화를 분석할 수 있습니다.

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저자는 박사 제니퍼 양 및 알렉산더 (사샤) 카우 프만이 기술 뿐만 아니라 수많은 도움과 중요 한 토론 기술 지원에 대 한 감사합니다. 혈 청 호르몬 분석 실험 양 그 외 여러분, 복제 Ligand 분석 결과 및 분석 코어, 유 니스 케네디 슈 라이버 NICHD/NIH (NCTRI) 부여 P50-HD28934에 의해 지원 연구에 대 한 버지니아의 대학 센터에서 2017 수행 했다.
연구 지원의 소스: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM T32 NICHD 007203에 의해 지원 되었다.

여기 설명 하는 방법을 국립 연구소의 건강 동물 관리 및 사용 지침 계약 이며 기관 동물 관리 및 사용, 샌디에고가 주 대학에 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 처리에 순응
<ol><li>처리 절차<ol>
<li>캐비닛에 biosafety 마우스 케이지를 놓습니다. 감 금 소 그리고 biosafety 내각 내에서 적당 한 표면 (예: 깨끗 한 케이지 뚜껑)에 장소에서 첫 번째 마우스를 제거 합니다.</li>
		<li>부드럽게 잡고 한 손으로의 손가락 집게와 꼬리의 기지에 의해 작업 화면에서 마우스를 제 지 하십시오. 그런 다음 단단히 집게와 다른 손의 엄지는 꼬리의 끝에 기지에서 꼬리의 복 부 표면 뇌졸중. 6 배를 쓰 다듬어이 반복 (즉, 1 세트) 그것의 감 금 소에는 마우스를 반환.</li>
		<li>6 분 기다릴 고 1.1.2 단계를 반복 합니다. 참고: 총에서 단계 1.1.2 반복 됩니다 4 번 마우스 (즉 4 세트 6 선), 당을 각 마우스 처리의 매일에 24 꼬리 치기의 총을 받게 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>매일 처리의 주파수<ol>
<li>5 계획 된 혈액 컬렉션 하루 전에 2 주까지, 단계 1.1, 5 일 / 주 (마우스 토요일 또는 일요일 순응의 마지막 2 주까지 처리 되지 않습니다)에 설명 된 대로 마우스를 처리 합니다.</li>
		<li>샘플링 기간 동안 실험 치료 (예: scruffing 또는 복 주입) 추가 처리 하지 포함 됩니다, 각 처리 세션 동안이 처리 활동에 쥐를 익히다. 참고: 주입 절차에 순응에 대 한 가짜 주사를 수행 하는 무딘된 바늘을 사용 합니다.</li>
		<li>계획 된 혈액 컬렉션 하루 전에 2 주 동안 주 당 7 일 1.1에 설명 된 대로 마우스를 처리 합니다.</li>
		<li>적어도 2 주 전에 계획 된 혈액 컬렉션, 샘플링 하는 동안 쥐에 혼란을 최소화 하기 위해 쌍에서 쥐 집.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 혈액 컬렉션 튜브의 준비
<ol><li>유리병에 磁 LH 분석 결과 버퍼 준비: 0.2% 소 혈 청 알 부 민 및 0.05 %PBS [0.2 g KCl, NaCl, 8 g 1.44 g Na2HPO4 (무수), 0.24 g KH2포4, 1 L, pH 7.4, 필터 및 고압 초순] 트윈-20 4 ° c.에 저장 1 참고: 볼륨 磁 LH 분석 결과 버퍼의 준비를 계산할 수 있다 기반으로 샘플 및 샘플 (2.2 & 토론) 아래 표시 된 대로 당 볼륨의 수에</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브 (0.6 mL microcentrifuge 튜브)를 준비 합니다. 튜브와 aliquot 분석 결과 버퍼 (버퍼 튜브; 당 57 µ L 참고,이 볼륨 혈액 수집의 볼륨 또는 원하는 버퍼에 혈액의 비율에 따라 다를 수 있습니다). 관 수 샘플링 앞서 일 준비, 4 ° c.에 저장</li>
</ol>3. 혈액 컬렉션
<ol><li>혈액 수집 자료의 준비입니다.<ol>
<li>사용을 위한 biosafety 내각을 준비 하 고 후드에 또는 근처 장바구니에 다음과 같은 자료를 준비: 10 µ L 플라스틱 (3 µ L 또는 원하는 혈액 컬렉션 볼륨 설정), 피 펫 팁, 사용된 피 펫 팁, 타이머, 동물 숫자와 샘플 번호 (인쇄물에 대 한 쓰레기통 샘플링 또는 동물 문제에 관한 메모)에 대 한 얼음 양동이 혈액 컬렉션 튜브가 위, 그리고 작은 거 즈 (2 "x 2"). 참고:는 "계산" 실험실 타이머에 기능은 유용 그것은 쥐를 방해할 수 있는 청취 가능한 경보 없기 때문에</li>
		<li>영구 마커를 사용 하 여 샘플링 하는 동안 올바른 마우스의 급속 한 식별을 지원 하기 위해 각 마우스 (기지) 근처의 꼬리를 표시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>꼬리와 사전 혈액 컬렉션 준비의 클리핑.<ol>
<li>혈액 컬렉션의 시작 하기 전에 45 분 그것의 감 금에서 최초의 마우스를 제거 하 고 캐비닛는 biosafety 내 (깨끗 한 케이지 뚜껑 잘 작동) 적당 한 표면에 놓습니다.</li>
		<li>날카로운, 살 균가 위를 사용 하 여 제거 무 균 준비 다음 마우스 꼬리의 끝의 1-2 m m (즉, 잡 목으로 알코올과 betadine). 참고:이 부드러운 구속 또는 isoflurane 마 취에서 깨어 동물에서 수행할 수 있습니다.  또한, 진통 현지 IACUC의 권고에 따라 제공할 수 있습니다.</li>
		<li>위에서 설명한 대로 신중 하 게 마우스의 꼬리를 치기 (1.1.2; 1-2 스트로크는 일반적으로 충분 한) 꼬리 끝에 혈액 형태의 물방울까지.</li>
		<li>깨끗 한 팁으로는 피 펫을 사용 하 여 꼬리 끝에서 3 µ L의 혈액을 수집 하 여 피 피 펫 팁 삭제.</li>
		<li>반환 하기 전에 마우스의 케이지를 혈 중지 되었습니다 확인 하십시오. 필요한 경우, 멸 균 거 즈와 부드러운 압력을 적용.</li>
		<li>모든 마우스 3.2.5 3.2.1-단계를 반복 합니다. 이후 혈액 샘플은 단단히 마우스의 꼬리는 꼬리의 끝에 혈액 형태의 물방울까지 쓰 다듬어 하 여 수집할 수 있습니다. 참고: 회사 선 후 혈액 작은 물방울을 형성 하지 않는 경우 비상 식 염 수에 젖은 거 즈 패드와 함께 발 수 있습니다. 병 더 높습니다 양식 덜 자주 샘플링 하는 동안 (즉, > 15 분 간격). 정 맥에서 혈전은 들어가면 샘플링 계속할 수 있습니다.</li>
		<li>이 사전 혈액 컬렉션 준비 기간 동안 약 45 분 마다 6 분 위에서 설명한 대로 각 마우스에서 3 µ L의 혈액을 수집 계속. 혈액과 피 펫 팁을 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈액 샘플링<ol>
<li>위에서 설명한 대로 꼬리 끝에서 3 µ L의 혈액을 수집 합니다. 전체 3 µ L 샘플 (거품 또는 침구 오염) 없이 피 펫 팁에 고려 되도록 주의. 레이블이 지정 된 튜브에 분석 결과 버퍼에 혈액 샘플을 꺼냅니다. 반전 하 여 혼합 하 고 얼음 튜브를 반환.</li>
		<li>반환 하기 전에 마우스의 케이지를 혈액 흐름 중지 되었습니다 확인 하십시오. 필요한 경우, 멸 균 거 즈와 부드러운 압력을 적용.</li>
		<li>미리 정해진된 샘플링 기간 단계 3.3.1-3.3.2 각 마우스, 모든 6 분에 대 한 반복 합니다. 각 동물 조 난 (예: 부분적으로 닫힌된 눈 꺼 풀, 돌출된 위치 [다른 치료에 의해 발생 하지] 또는 처리 응답의 부족)의 표시를 모니터링 하 고 필요한 경우 샘플링, 종료. 참고: 행동 고민 또는 다른 합병증 샘플링의 종료를 필요로 하는 우리의 실험실에서 매우 드물게 발생 합니다.</li>
		<li>동물 혈액 샘플링을 따르는 안락사 하지는, 꼬리 끝에서 혈액의 흐름이 완전히 중지 되었습니다 확인 합니다. 각 동물의 케이지 (또는 변화 감 금 소)의 내부에서 유출된 된 혈액을 닦 고 주택 랙 동물 감 금 소를 반환.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 샘플 처리 및 분석
<ol><li>분석까지-20 ° C에서 혈액 샘플을 저장 합니다. 참고: LH는 전체 혈액 샘플 분석 결과 버퍼;에 희석에 분석 세라 나 플라즈마의 분리는 저장 하거나 분석 하기 전에 필요 합니다.</li>
	<li>분석 결과 혈액 샘플으로 磁 ELISA에 의해 이전1 및 보고서 값 ng/mL 전 혈 보정 분석 결과 버퍼에 샘플 볼륨의 희석에 대 한 다음의 설명.</li>
	<li>데이터 집합에서 LH 펄스를 식별 합니다. 계산 하 고 평균 펄스 진폭 및 펄스 주파수 (또는 간 펄스 간격) 데이터 집합에 대 한 적절 한 비교. 참고: 게시 된 기준13,14 및 프로그램,15,16 LH 펄스를 감지 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li>
<li>McArdle, C. A., Roberson, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcArdle%2C+CA+%22Knobil+and+Neill%27s+Physiology+of+Reproduction%22">Knobil and Neill's Physiology of Reproduction</a>. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기는 쥐에 있는 타악기 LH 분 비의 평가 대 한 전체 혈액 꼬리 팁 샘플의 빈번한 혈액 컬렉션에 대 한 프로토콜에 설명합니다. 이 프로토콜의 사회 심리적인 스트레스에 노출 다음 타악기 LH 분 비의 급성 변화 탐지에 대 한 샘플의 수집을 가능 하 게 하 고 다른 급성 또는 만성 조작에서 LH 펄스의 평가 적합.
LH 펄스의 안정적이 고 강력한 프로필을 달성 하기 위한이 프로토콜의 중요 한 구성 요소에서 처리 하는 순응 기간. 호르몬 분 비 저하 시킬 수 있습니다 스트레스를 처리 하는 생각은 문학,17 에 따라 추측 되었지만 명시적으로 테스트입니다. 그러나, 최근 간행물에 묘사 된 대표적인 LH 펄스 패턴의 분석 처리를 철저 하 게 순응 하는 이점을 명확 하 게 보여 줍니다. 10 일 처리를 이용 하 여 초기 연구에서 LH 펄스는 아무 lh에서 펄스 발견 된 장기간으로 불규칙 한 간격으로 발생 했습니다. <sup class="xref"...

포유류의 생식 기능 생식 샘 자극 호르몬 분 비, 황 호르몬 (LH)과 여 포 자극 호르몬, 뇌 하 수 체에서 따라 달라 집니다. gonadotropins는 생식 샘 자극 호르몬-방출 호르몬 (GnRH)의 hypothalamic 분 비에 대 한 응답에서 중 타악기 또는 서 지 방지기 패턴에서 은닉 된다. LH와 FSH의 분 비와 합성 hypothalamic GnRH, gonadal 스테로이드 호르몬 그리고 activin-inhibin-follistatin 시스템으로의 무수 한을 포함 하는 분자의 다양 일 분 비, paracrine 및 autocrine 액션을 통해 통제 된다 스트레스와 에너지 균형을 포함 하 여 생리 적 조건입니다. 2
혈액에서 LH의 타악기 패턴 지 수 제거 약 뒤 말 초 혈액으로 LH의 오히려 갑작스러운 방전에서 발생 합니다. 중요 한 패턴의 기능으로는 각 LH 방전의 주파수 및 LH 응답의 진폭, 둘 다, 부분적으로에 의해 규정 됩니다 hypothalamic-뇌 하 수 체의 측정에 대 한 포털 혈액 수집에 어려움에 GnRH 인해 출시 타악기 GnRH, LH의 측정 및 샘플링 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 GnRH 규제에 대 한 프록시로 사용 됩니다. 따라서, 중요 한 정보는 단일 샘플에서 확인할 수 없는 LH 펄스의 진폭 및 주파수에 인코딩됩니다.
타악기 LH 분 비의 분석 역사적으로 큰 포유 동물 (인간, 영장류, 그리고 양) 그들의 큰 혈액 볼륨 및 빈번한 혈액 샘플 컬렉션에 대 한 내성 때문에 제한 되었습니다. 설치류에 빈번한 혈액 샘플링 쥐에 국한 되었고 내재 심 방 카 테 터를 통해 달성. 3 , 4 상대적으로 저렴 한 비용 및 유전자의 (예: cre-lox, CRISPR) 하 고 복잡 한 신경 회로 (예: optogenetics, chemogenetics) 조작 쥐 매력적인 모델 유기 체; 그러나, 빈번한 혈액 샘플의 달성 및 LH 농도의 후속 분석까지 최근 입증 하기 어려운. 이 기념비적인 작업 해당 및 동료에 의해 개척 되었다. 1 이후 다음, 여러 실험실 자주 혈액 샘플링 및 실험 패러다임의 다양 한 타악기 LH 분 비 평가에 매우 민감한 LH 분석 활용 하기 시작 했다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 그것은 지적 되어야 쥐에서 여러 개의 혈액 샘플을 수집 하는 실용적인 방법 추구 적어도 40의 년10 여러 수정 만든 길을 따라 진행에서 되었습니다. 11 , 12
LH 펄스 패턴 (즉, 주파수와 진폭)의 평가 주요 상세를 모니터링이 유전자 온순한 동물 모델에서 기저 생식 샘 자극 호르몬 분 비를 나타냅니다. 전통적으로, 마우스에 LH 농도 단일 혈액 샘플에서 결정 했다. LH 농도 자연스럽 게 각 펄스 동안 변동 하기 때문에 단일-지점 샘플의 1 개의 약점 높은 변수 데이터 집합입니다. 또 다른 약점은 절연된 측정 본질적으로 LH 분 비는 펄스의 패턴에 의해 전달 하는 중요 한 정보를 보고 싶어요. 따라서, 자유롭게 행동에서 빈번한 혈액 샘플을 수집 하는 방법, 억제 마우스 (샘플링 하는 동안 부드러운 처리) 제외 됩니다 향상 된 정보를 제공을 타악기 호르몬 규칙을 조사 하는 많은 실험실에 유용 합니다.
여기, 우리는 자주의 컬렉션에 대 한 프로토콜을 설명 (매 6 분) 혈액 샘플 깨어, 억제 쥐에서. 우리는 처리를 포함 하는 중요 한 것은, 사전 및 사후 평가 심각한 도전 하는 시간의 길이 확인할 수 있습니다, 동안 전체 혈액 샘플에서 타악기 LH 분 비의 강력 하 고 지속적인 탐지 수집을 허용 하는 순응 프로토콜 같은 동원 정지 및 억제의 사회 심리적인 스트레스에 대응. 전체 혈액 샘플에서 LH 농도 대 한 효과적인 분석 결과 이전; 설명 하고있다 1 이 프로토콜 LH 펄스 측정을 위한 혈액 샘플을 수집 하는 방법에 초점을 맞추고.

<table><tbody><tr><td>Biosaftey 캐비닛</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (무수)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>Millipore</td><td></td><td>정제 및 여과수</td></tr><tr><td>Broome 설치류 구속 장치</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-0460</td><td>혈액 수집에는 필요하지 않지만 대표 데이터 수집에 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>해당 사항</td><td>없음</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

타악기 황 호르몬 분 비의 평가 대 한 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링을 자주

Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

많은 내 분 비 시스템, 순환 요인 또는 호르몬, 해제 되지 않은 하지만 개별 펄스 방출 요인에 대 한 응답에서으로 분 비 됩니다. 싱글 포인트 샘플링 조치 정상적인 생리 적인 조건 하에서 또는 dysregulation의 조건 중 타악기 호르몬의 분 비 패턴의 생물학적 의미를 완전히 이해 하기에 적당 하지 않습니다. 황 호르몬 (LH)는 앞쪽 뇌 gonadotrope 세포에 의해 합성 하 고 펄스 평가 대 한 빈번한 컬렉션의 혈액 샘플을 필요로 하는 타악기 패턴에서 분 비. 이것은 높은 감도 LH 분석 결과의 발전으로 인해 최근까지 쥐에 가능한 되지 하 고 발전 하는 기술에 자주 낮은 볼륨 샘플 컬렉션, 처음 해당와 동료에 의해 설명. 1 여기 우리 LH의 분 비는 타악기를 검출 하기 위하여 충분 한 처리 순응와 쥐에서 자주 주변 혈액 샘플 컬렉션에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 현재 프로토콜 여러 시간 동안 LH의 강력 하 고 지속적인 펄스의 평가 허용 하는 확장 된 순응 기간을 자세히 설명 합니다. 이 프로토콜에는 꼬리의 끝은 잘리고 휴대용 피 펫을 사용 하 여 꼬리에서 혈액 수집. Gonadectomized 마우스에 타악기 LH의 평가 대 한 직렬 샘플은 중요 한 것은, 90-180 분에 대 한 5-6 분 마다 수집 된 혈액의 수집과 측정 LH의 강력한 펄스의 적절 한 처리를 주어진 깨어, 자유롭게 동작 마우스에서 달성 될 수 있다 순응 그리고 환경 스트레스를 최소화 하기 위해 노력입니다. 충분 한 순응 혈 전에 4-5 주 내에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 마우스, 신경 내 분 비 연구에 대 한 강력한 동물 모델에서에서 여러 시간 동안 타악기 LH 분 비 패턴의 평가 대 한 전체 혈액 샘플의 수집을 위해 방법론에 발전을 강조 한다.

4 쥐에서 대표적인 LH 펄스 패턴은 그림 1 (2017 양 외.에서 증 쇄 하는 데이터)에 표시 됩니다. LH는 급성 정신 스트레스도 전에 응답을 결정 하기 위해 자주 혈액 샘플에서 측정 했다. 성인 여성 C57/Bl6 마우스 ovariectomized 하 고 빈번한 혈액 컬렉션에 대해이 프로토콜에 설명으로 처리 했다. 혈액 샘플은 LH 타악기 분 비의 사전 처리 기준을 설정 하는 모든 동물에 첫 90 분 동안 수집 되었습니다. 샘플링의 두 번째 90 분 동안 제어 (비 압박) 동물 그들의 감 금 소에 남아 있고 구속 스트레스 동물 설치류 보호 장치에 배치 되었고 새로운 새 장에 격리. 제어 동물 전체 샘플링 기간에 걸쳐 명확 하 고 모호 하지 않은 LH 펄스를 보여주었다. 반면, 사회 심리적인 스트레스의 신속 하 고 명확 하 게 타악기 LH 분 비 억제.
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여기 억제 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링 프로토콜 자주 샘플 컬렉션에 대 한 선물이. 이 메서드는 타악기 황 호르몬 분 비의 사정 패턴에 대 한 유용 하 고 다른 순환 요인의 분석에 대 한 적응 될 수 있습니다.

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

잦은 꼬리 끝 혈액 샘플링의 전반적인 목표는 깨어 있고 마취되지 않은 정상적인 행동을 하는 마우스에서 LH라고 하는 박동성 황체 형성 호르몬 분비를 측정하기 위한 전혈 샘플을 얻는 것입니다. 이 방법은 생쥐의 황체 형성 호르몬 박동 분비를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공함으로써 재생 신경 내신학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 잦은 취급과 습관화로 급성 또는 만성 실험 치료 후 강력하고 신뢰할 수 있는 황체 형성 호르몬 펄스 측정을 보장할 수 있다는 것입니다.채혈 전 5주 동안 월요일부터 금요일까지 매일 쥐를 다루십시오. 마지막 2주 동안은 토요일과 일요일에도 생쥐를 처리하십시오. 생물 안전 캐비닛에서 마우스 취급 요법을 수행합니다.케이지에서 첫 번째 마우스를 꺼내 캐비닛 내의 적절한 표면에 놓습니다. 꼬리 밑부분을 잡고 이 표면에서 마우스를 부드럽게 제지합니다. 그런 다음 다른 손으로 꼬리의 복부 표면을 바닥에서 끝까지 단단히 쓰다듬습니다.이 작업을 총 6번 수행한 다음 마우스를 케이지로 되돌립니다. 이는 하나의 처리 세트를 구성합니다. 이제 6분 정도 기다렸다가 다른 처리 세트를 수행합니다.inter set 간격으로 이 패턴을 계속하면 처리 세션당 4개의 처리 세트를 수행합니다. 이것은 세션당 총 24개의 테일 스트로크를 제공합니다. 샘플링 기간 동안의 실험적 처리에 스크러핑 또는 복강내 주사와 같은 추가 처리 방법이 포함되는 경우, 핸들링 세션 동안 마우스가 이러한 핸들링 활동에 순응하도록 합니다.계획된 혈액 채취일 2주 전에 쥐를 짝을 지어 수용하여 채취 기간 동안 생쥐의 중단을 최소화합니다. 혈액 수집을 위해 혈액 저장을 위해 0.6ml 마이크로 원심 분리기 튜브를 준비하십시오. 튜브에 라벨을 붙이고 3마이크로리터 혈액 수집을 위해 각 튜브에 57마이크로리터의 ACES 완충액을 분취합니다.준비가 되면 튜브를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 생물 안전 캐비닛에는 피펫 팁, 쓰레기통, 타이머, 실험 일지, 채혈 튜브가 들어 있는 얼음 양동이, 날카롭고 멸균된 가위, 영구 마커 및 작은 거즈가 준비되어 있습니다. 채혈을 시작하기 45분 전에, 첫 번째 쥐를 우리에서 꺼내 적당한 표면에 놓는다.그런 다음 꼬리를 표시하여 케이지 파트너에서 이 마우스를 빠르게 식별합니다. 이제 가위를 사용하여 꼬리 끝의 1-2mm를 제거합니다. 꼬리를 자른 후 꼬리 끝에 핏방울이 형성될 때까지 꼬리를 조심스럽게 쓰다듬습니다.그런 다음 3마이크로리터의 혈액을 모아 혈액과 팁을 모두 쓰레기통에 버리십시오. 다음으로 혈류가 멈췄는지 확인합니다. 필요한 경우 멸균 거즈로 부드러운 압력을 가하십시오.그런 다음 6분 동안 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 이제 45분에 걸쳐 6분 간격으로 꼬리를 세게 쓰다듬어 쥐로부터 추가 혈액 샘플을 채취합니다. 핏방울이 형성되지 않으면 식염수를 적신 거즈 패드로 꼬리를 두드려 혈전을 제거하는 데 도움이 됩니다.사전 샘플링 기간 동안 모든 혈액 분취량을 폐기합니다. 45분 후에 샘플링 기간이 시작됩니다. 샘플을 채취할 때 3마이크로리터의 혈액을 채취 튜브에 옮기고 튜브를 반전으로 혼합한 다음 얼음에 다시 넣습니다.이제 필요한 만큼 샘플링을 진행합니다. 한 번은 쥐를 안락사시키거나 꼬리 혈류가 완전히 멈췄는지 확인한 다음 쥐에게 깨끗한 케이지를 제공하십시오. 그런 다음 혈액 샘플을 보관 상자로 옮기고 샘플을 분석할 수 있을 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.황체형성 호르몬(LH)을 급성 심리사회적 스트레스 챌린지에 대한 반응을 결정하기 위해 빈번한 혈액 샘플에서 측정했습니다. 성체 암컷 C57 블랙 6 마우스에서 난소 절제술을 실시하고 90분 동안 혈액 샘플을 채취하여 LH 박동 분비의 전처리 기준선을 확립했습니다. 90분 동안 스트레스 치료를 위해 표본 채취를 위해 실험 동물들은 설치류 억제 장치에 들어가 새로운 우리로 옮겨졌고, 대조군은 집에 있는 우리에 남아 구속되지 않았다.분석 결과, 대조군 동물은 전체 샘플링 기간 동안 명확하고 모호하지 않은 LH 펄스를 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 억제로 인한 심리사회적 스트레스는 실험군에서 박동성 LH 분비를 빠르고 명백하게 억제했습니다. 이 기술의 사용을 준비할 때 쥐에게 스트레스를 주고 박동성 LH 분비를 방해할 수 있는 소음이나 다른 연구자의 방해와 같은 환경 방해를 최소화하는 것이 중요합니다.첸 실험실의 Stein 박사와 다른 사람들이 개발한 이래로 이 기술은 신경 내분비학 분야의 연구자들이 복잡한 분자 및 유전 도구가 실용적이고 사용 가능한 종에서 LH 펄스 조절을 탐구할 수 있는 길을 닦기 시작했습니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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황체 형성 호르몬(LH) 박동은 생식 기능의 특징입니다. 우리는 연속적인 자동 혈액 수집과 관련된 특정 신경 세포 집단의 원격 활성화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 시간 제한 호르몬 조절, 다중화 및 의식이 있고 자유롭게 움직이며 방해받지 않는 동물의 LH 수준에 대한 조작 효과를 최소화할 수 있습니다.

생쥐의 순환 황체 형성 호르몬을 유도하고 측정하기 위한 자동 혈액 샘플링과 결합된 원격 신경 세포 활성화

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급성 림프구성 백혈병에 대한 유도 화학 요법에 대한 백혈병 재발의 쥐 모델

학습하세요 쥐 꼬리 끝 채혈법을 통해 자유로운 상태에서 황체형성호르몬(LH) 맥동 분비를 측정하는 신경내분비학 연구 방법을. 스트레스를 최소화하여 정확한 호르몬 변화를 분석할 수 있습니다.

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