Name: 초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 배우세요 구슬 없는 광학 핀셋으로 Drosophila 배아의 세포 역학을 실시간 측정하는 방법을. 광시트 현미경과 결합하여 최소 침습으로 조직 경도와 장력을 정량 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 FRM Equipe 그랜트 FRM DEQ20130326509, 직원 회 드 라 검색 ANR 블랑 그랜트, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (P.-플로리다)에 의해 지원 되었다. 우리는 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-10-INBS-04-01, «미래에 대 한 투자»)에서 지 원하는 프랑스 BioImaging 인프라를 인정 합니다. 우리 기술 지원에 대 한 PICSL-FBI 인프라에서 브라이스 Detailleur와 클로드 모레티 감사합니다.

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<li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512(2012).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

광학 족집게는 비-침략 적 방식으로 직접 개발 배아 상피에에서 절대 기계 측정을 수행 하실 수 있습니다. 그런 의미에서 그것은 침략 적 되 고 상대 측정, 주사를 요구 하는 자기 세력을 제공 또는 강한 가정에 의존 하는 유추를 강제로 제공 하 고 또한 상대 레이저 절제 등 다른 방법을 통해 장점을 제공합니다 측량입니다.
프로토콜은 몇 가지 중요 한 단계를 포함합니다. 첫째,로 렌즈는 색수차 및 레이저 트랩 되겠습니다 "하류" 개체 표시 될 수 있습니다, 그것은 IR 레이저 영상 평면에 구슬 트랩을 확인 하는 것이 중요 하 고 결국 그것은 (단계 2.18)에 대 한 올바른. 둘째, 방법은 셀 연락처의 위치 측정에 사용합니다. 그것은 이렇게 높은 대비 형광 마커를 사용 하 여 중요 한입니다.
대물 렌즈와 레이저 빔 품질은 효과적인 트래핑 중요 합니다. 대물 렌즈의 수 가늠 구멍 1.0을 초과 한다. 트래핑 효과적인 인 경우 레이저 빔...

배아 개발 기간 동안 세포와 조직 미래 동물 모양 변형 매우 재현 과정 이다. 같은 개 악 셀 수준1,2에서 세력의 적극적인 세대를 요구 하도록 표시 되었습니다. 세포와 조직 그들의 모양을 변경 하는 전체적 프로세스 이해, 그것은 따라서 키 참여, 세포의 기계적 특성을 평가 하 고 과정3,4 동안 조직 내의 힘을 측정 하 . 특히 초파리, 상피 레이어 인해 그들의 유사 2D 형상 및 그들의 쉬운 조작에 널리 공부 되었습니다.
다양 한 기술 따라서 우리가 다른 사람에 의해 개발 중 상피 역학에 vivo에서 평가 하기 위해 개발 되었습니다. 우리는 상피 조직에서 사용 하는 세 가지 주요 기술에 대 한 빠른 개요를 줄 것 이다. 레이저 제거, 널리 사용 되는 방법은 로컬 기계적 스트레스 세포 접속점5,6,,78 또는 더 큰 규모9,10,11 허용 로컬 인하 대상의 기계적 무결성 중단을 수행 하 여. 오프닝 컷 다음의 역학 관계와 조직12,13의 유동성 스트레스 이전 절제에 정보를 제공 합니다. 레이저 절제의 단점은 그것이 침략, 셀 피 로컬 중단을 필요로입니다. 하나 조직의 무결성을 유지 하 고 싶은 경우에 따라서, 하나만 제한 된 수의 제거를 수행할 수 있습니다. 또 다른 단점은 오프닝 속도 점성 마찰, 일반적으로 알려져 있지에 따라 달라 집니다 이후 제거 셀 연락처에서 긴장의 상대 견적 제공. 마그네틱 조작 개발 고 초파리, ferrofluids14 의 사용 또는 ultramagnetic 리15포함 사용 또한 있다. 그들은 절대 측정16,17을 제공할 수 있습니다 하지만 그들은 원하는 위치에 프로브의 주입 필요로 하는 의미에서 침략 적 있습니다. 이것은 항상 정확한 주사 의무가 시스템에 따라 매우 어려울 수 있습니다. 세 번째 기술은, 완전히 비-침략 적, 힘 유추18,,1920이다. 힘 유추 트리플 포인트 (tricellular 접합, 또는 정점)에서 기계적 평형의 가정에 그리고 셀 연락처 (그리고, 모든 셀에 압력)에 의해 역 문제 해결 전혀 긴장을 유추할 수 있습니다. 긴장, 각 꼭지점 두 식을 (X 및 Y)를 제공합니다. 이 셀의 모든 접촉에서 긴장을 평가 하기 위해 몇 가지 조건 하에서 반전 될 수 있는 선형 방정식의 큰 시스템을 생성 합니다. 세그먼트 이미지를 아무런 추가 실험 또는 설치만 요구 하는 때이 방법은 매우 매력적인, 동안 그것의 정확도 아직 결정, 그리고 다시만 제공 상대 값, 절대 교정 측정 수행 하지 않는 한.
이러한 한계 들을 극복 하기 위해 우리 소개이 문서에서는 광학 족집게의 설치 제어 세력 초파리 melanogaster의 배아 상피에 셀 규모에 적용할 빛 시트 현미경에 결합. 광학 핀셋 단일 단백질 및 세포와 세포21의 조작에 측정을 포함 하 여 수많은 생물 학적 응용에 대 한 사용 되었습니다. 여기, 우리가 작은 몇 다스 pN의 범위에서 적용 된 힘을 보고 아직 셀 연락처의 로컬 변형 유발 하 고 vivo에서기계 측정을 수행 하기에 충분. 일반적으로, 셀 연락처, kymographs의 분석을 통해 모니터링의 수직 편향 사용 하 여 변형 힘 관계. 중요 한 것은, 우리의 설치 광학 핀셋 직접 셀 연락처에 힘을 발휘할 수 있는 조직에서 원하는 위치에 구슬의 주입을 요구 하지 않는다. 빛 시트 현미경 광학 족집게의 결합 수의 조명부터 매우 감소 된 phototoxicity와 짧은 시간 스케일에서 기계적인 분석에 대 한 감지할 수 있는 빠른 영상 (초당 몇 프레임)을 수행 하는 샘플 영상22의 비행기로 제한 됩니다.
전반적으로, 광학 족집게는 셀 연락처 초파리 태아에서 vivo에서에서 제어 힘을 적용 하 고 경직과 긴장 셀 연락처23, 유 변 학적 특성 기계 정보를 추출 하는 비-침략 적 방법 24, 그리고 그라데이션 또는 긴장23의 이방성.

<table><tbody><tr><td>이테르븀 파이버 레이저 LP, 10 W, CW</td><td>IPG 레이저</td><td>YLM-10-LP-SC</td><td>콜리메이터 LP 포함: 빔 D = 1.6 mm 및 레드 가이드 레이저</td></tr><tr><td>&오슬래시; 1/2" 광학 빔 셔터</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td></td></tr><tr><td>소형 빔 직경 검류계 시스템</td><td>Thorlabs</td><td>GVS001</td><td>X 변위의 경우 1, Y 변위의 경우</td></tr><tr><td>1D 또는 2D 갈보 시스템 선형 전원 공급 장치</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td>검류계 전원 공급 장치</td></tr><tr><td>2 렌즈 f = 30mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1757-B</td><td>릴레이 망원경 2 갈바</td></tr><tr><td>렌즈 f = 200mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1945-B</td><td>2.5X 망원경</td></tr><tr><td>렌즈 f = 500 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1869-B</td><td>2.5X 망원경</td></tr><tr><td>오른쪽 각도 키네매틱 타원형 거울 마운트 탭 케이지 로드 홀</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1E</td><td>잠망경</td></tr><tr><td>레이저 안전 안경, 연두색 렌즈, 59% 가시광선 투과율, 유니버설 스타일</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>45&deg; AOI, 50.0 mm 직경, 핫 미러</td><td>Edmund Optics</td><td>#64-470</td><td></td></tr><tr><td>다광자 이미터 HC 750/S</td><td>AHF</td><td>HC 750/SP</td><td></td></tr><tr><td>CompactDAQ 섀시</td><td>내쇼날인스트루먼트</td><td>cDAQ-9178</td><td></td></tr><tr><td>C 시리즈 전압 출력 모듈</td><td>내쇼날인스트루먼트</td><td>NI-9263</td><td>아날로그 출력 모듈</td></tr><tr><td>C 시리즈 전압 입력 모듈</td><td>내쇼날인스트루먼트</td><td>NI-9215</td><td>아날로그 입력 모듈</td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &micro; m, 적색 형광등(580/605), 2% 고체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F8812</td><td>캘리브레이션 비드</td></tr><tr><td>C++(Qt) 집에서 만든 광학 핀셋 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>Olivier Blanc과 Claire Chard가 개발했습니다. 대체 솔루션: labview</td></tr></tbody></table>

초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis 유전 패턴화와 견고 하 게 모양 세포와 조직에 기계적인 힘 사이 협력을 요구 한다. 따라서, 전체적 프로세스를 이해 하는 도전 직접 embryogenesis 동안 세포 세력과 vivo에서 기계적 성질을 측정 하는. 여기, 우리 초기 초파리 배아의 세포-세포 연락처에 군대를 직접 적용할 수 있는 가벼운 시트 현미경을 결합 하는 광학 족집게의 설정을 현재 초당 몇 프레임의 속도로 이미징 동안. 이 기술은 광학 힘 발휘는 중간 조사로 일반적으로 사용 되는 배아에 구슬의 주입을 요구 하지 않는 이점이 있다. 우리는 단계적으로 설치, 구현에 자세히 설명 하 고 실험에서 기계적인 정보를 추출 하는 도구를 제안. 실시간으로 셀 연락처의 변위를 모니터링 함으로써 한 긴장 측정을 수행 하 고 셀 연락처 유동성 조사 수 있습니다.

그림 5 함정을 정현파 움직임을 부과 하 여 얻어진 실험 데이터를 보여 줍니다. 함정 3 연속 인터페이스 위치 (그림 5A)23보여주는 3 스냅샷에 의해 exemplified 인터페이스의 편향도 생성 합니다. 기록된 영화 kymograph (그림 5B)를 생성 하는 데 사용 됩니다. 그리고 각 프레임에 대 한 x 방향을 따라 맞는 픽셀 해상도 가우스를 사용 하 여 인터페이스의 위치 결정을 더욱더 분석. 작은 개 정권에서 트랩 및 인터페이스 위치는 비례 (그림 5C). 트랩 (그림 5D)의 상대적인 인터페이스 편향의 진폭 인터페이스 긴장이 나 경직에 액세스할 (단계 ...

선물이 빛 시트 현미경을 초파리 태아에 구슬 없이 셀 역학을 구현 결합 광학 족집게의 설치.

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

이 방법은 세포 세포 접촉의 속성이 조직 형태 발생 도중 공간과 시간에 있는 어떻게 변경되는지와 같은 조직 역학에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약하게 침습적이며 광시트 현미경 검사법과 같은 라이브 이미징과 호환된다는 것입니다. 이 기술은 조직에 구슬의 주입을 필요로하지 않습니다.일반적으로 혜성을 얻을 수있는 데미에르 프로브로 사용, 나는 흥분. 이 과정을 시연하는 것은 제 지형 수준에서 연구 과학자인 샤르드(Chardes)와 라파엘 클레멘트(Raphael Clement)가 될 것입니다. 시작하려면, 수평 평야에서 광 시트 현미경 검사대에 대한 직립 현미경을 설정한 다음 광학 핀셋역할을 레이저와 광학을 준비합니다.다음으로 500나노미터형형구슬 1개를 유리 큐벳에 넣고 증류수 10밀리리터를 넣습니다. 큐벳 홀더를 목표 아래에 배치하고 목표가 수면에 닿을 수 있도록 목표의 초점을 조정합니다. 이제 인수 소프트웨어를 제어하는 데 사용되는 통합 개발 환경 QT 크리에이터를 엽니다.마이크로Rheo를 열어 획득 소프트웨어를 엽니다. 라이브를 선택하여 라이브 획득 모드를 켭니다. 레이저를 전환하기 전에 안전 고글을 착용한 다음 레이저 전력을 1와트로 조정하고 레이저를 켭니다.라이브 피드는 이제 레이저의 초점에 갇혀 구슬을 표시해야합니다. 필요한 경우 두 번째 망원경 렌즈의 위치를 조정하여 비드를 집중시다. 또한 이미지의 비드를 중심으로 잠망경 기동의 각도를 조정해야 할 수도 있습니다.첨부된 텍스트 프로토콜 의 그림 3에 설명된 대로 데이터 수집 보드 및 연석 연결을 준비합니다. 광학 셔터 인터페이스에서 시간 개방 초 매개변수를 000.000으로 조정하고, 시간 폐쇄 된 sec 매개 변수를 000.000으로, 모드 매개 변수를 단일으로 조정하고, 트리거 매개 변수를 EXT로 조정합니다. 설정이 완료되면 사용 설정 단추를 선택합니다.QT 크리에이터에서 ot를 엽니다. 프로젝트를 엽니다. aogenerator의 입력 및 출력 이름을 변경합니다.설정에 사용된 MI 카드와 일치하는 cpp 파일입니다. 마지막으로 광학 핀셋 소프트웨어를 컴파일하고 실행합니다. 획득 소프트웨어에서 원하는 노출 시간, 게임, 두 이미지 사이의 시간, 획득할 이미지 수 및 레이저의 전원을 선택합니다.그런 다음 광학 핀셋 소프트웨어에서 여기에 표시된 광학 핀셋 매개 변수를 설정하여 원을 추적합니다. 그런 다음 A

probing-cell-mechanics-with-bead-free-optical-tweezers-drosophila

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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의 유사 분열 유학을위한 Microinjection 기법 Drosophila melanogaster Syncytial 엠브료

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물성 및 비보에 긴장 매개 변수 측정 도구의 부족 방지 개발 하는 동안 그들의 역할을 확인 합니다. 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 나노-추적 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀에 기계적 기능 척도를 고용. 이 메서드는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 관입 개입을 피하.

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

이 프로토콜의 목표는 Drosophila 애벌레에서 기계적 고치에 대한 향상된 분석법을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 우리는 기계적 과민성 (알로디니아 및 과민증)이 Drosophila 애벌레에 존재한다는 것을 보여주기 위하여 여기에서 분석기를 이용합니다.

드로소필라 애벌레의 기계적 고치절 측정을 위한 향상된 분석 및 도구

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

액토미오신 수축성은 세포 및 조직 형태 형성에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 생체 내에서 악토미오신 수축성을 급격히 조작하는 것은 어렵다. 이 프로토콜은 초파리 배아에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성을 빠르게 억제하는 광유전학적 시스템을 설명하여 생체 내에서 악토미오신이 비활성화된 후 상피 긴장의 즉각적인 손실을 나타냅니다.

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

이 프로토콜들은 대조군과 돌연변이 초파리 배아 상피에서 주름 격격 접합부의 조직 및 폐쇄 기능을 어떻게 특성화할 수 있는지 개괄합니다.

초파리 배아 상피에서 코어 주름 부분 격지 접합 단백질을 규명하기 위한 면역염색 및 염료 침투 실험

배우세요 구슬 없는 광학 핀셋으로 Drosophila 배아의 세포 역학을 실시간 측정하는 방법을. 광시트 현미경과 결합하여 최소 침습으로 조직 경도와 장력을 정량 분석할 수 있습니다.

초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

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