Name: 막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 배우세요 막 단백질의 저해상도 구조를 SANS와 중수소 표지를 이용해 분석하는 방법을. 세제 간섭을 최소화하고 단백질 크기, 형태, 올리고머 상태를 정밀하게 결정할 수 있습니다.

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사무실의 생물학과 환경 연구 구조 분자 생물학 (CSMB) 및 바이오 ORNL의 센터에서 연구를 지원-과학적인 사용자 시설 부문, 기본적인 에너지 과학의 사무실, 미국에서 지 원하는 시설을 사용 하 여 SAN 에너지. 리버 먼 연구소에서 막 단백질에 구조 작업 NIH (DK091357, GM095638)에 의해 지원 되었습니다 및 NSF (0845445).

Volker 미 도시, 사이 Venkatesh Pingali, 케빈 L.와 이즈, 그리고 라이언 C. 올리버 저자는 중성자 과학 사용자 프로그램 및 바이오를 지원 하기 위해 미국 DOE와 UT Battelle 통해 계약-오크 리 지 국립 연구소이 문서에서 사용 되는 악기 산 세.
이 원고 공동 UT-Battelle, LLC는에 의해 계약 드-AC05-00OR22725와 미국 부의 에너지 (DOE)를 저술 했다. 미국 정부를 유지 하 고 게시자, 게시를 위해 문서를 수락 하 여 인정 미국 정부 게시 또는 게시 된 형태의이 원고를 복제 하거나 허용 비배타적, 유료-, 취소할 수, 전세계 라이센스 유지 이렇게 미국 정부 목적을 위해 다른 사람. 미상 미상 공용 액세스 계획에 따라 연방 후원된 연구의 이러한 결과에 대 한 공개 액세스를 제공 합니다. 82

구조 생물학 연구 솔루션 분산 솔루션에서 생체에서 생화학 및 구조 정보 (예: 전체 크기 및 모양)를 같은 보완 구조 기술을 활용 합니다. SAN은 낮은 해상도 막 단백질의 구조, 현대 구조 생물학 및 생화학의 핵심 초점을 결정 하기 위한 특히 매력적인 기술입니다. SAN의 순화 된 단백질 결정학 실험 (1 mg/샘플)의 비교를 요구 한다. 고 순도 deuterated 세제 관련 막 단백질 연구의 최근 확장 상업적인 가용성은 액세스할 수 있습니다이 수소/중수소 막 단백질-세제 단지의 실험 SAN에 대 한 콘텐츠를 조작 하는 수단 직접 기록 단백질 신호를 허용 합니다. 성공 하면 ab initio 모델 분자 봉투는 단지 몇 시간 동안 수집 된 데이터에서 계산할 수 있습니다. 따라서, 막 단백질 생화학, biophysicists, 및 구조상 생물학 쉽게 활용할 수 탐 낼된 초기 3D 모델의 솔루션에서 막 단백질, 파트너 또는 기질, 그리고 얻은 모델 바인딩 복잡 한 구조를 얻기 위해 SAN SAN에 의해 회절 데이터...

막 단백질은 모든 유전자1 의 약된 30%에 의해 인코딩되고 현대의 약 약물에 대 한 대상의 강한 대다수를 나타냅니다. 2 이 단백질의 중요 한 세포 기능,3 하지만 그들의 풍요로 움과 중요성에도 불구 하 고 다양 한 수행-총 구조 연구 Collaboratory 구조 생물 정보학 (RCSB) 단백질에의 약 1%만 대표 데이터 은행입니다. 4 그들의 부분적으로 소수 성 특성으로 인해 막-바인딩 단백질의 구조 결정이 되었습니다 매우 도전. 5 , 6 , 7
많은 생물 기술, 측정을 위한 솔루션에 단 분산 입자를 요구 네이티브 막에서 막 단백질을 분리 하 고 기본 세포 막의 수용 성 모방에이 단백질 안정화 되었습니다 연구의 활성 영역에서 최근 수 십년입니다. 8 , 9 , 10 이러한 조사 이끌어 많은 소설 amphiphilic 어셈블리의 개발을 solubilize 막 단백질, nanodiscs,,1112,13 bicelles,14,15 등 및 amphipols. 16 , 그러나 17 , 세제 micelles 사용 하 여 주어진된 단백질의 가용성 요구 사항 만족을 위한 가장 일반적이 고 간단한 방법 중 하나 남아 있습니다. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 불행 하 게도, 아니 단일 세제 또는 세제의 마법의 혼합 현재 존재 만족 모든 막 단백질; 따라서, 이러한 조건 각 단백질의 고유한 요구 사항에 대 한 경험적으로 상영 될 해야 합니다. 26 , 27
세제는 솔루션 그들의 임계 micelle 농도 이상에서 micelles 이라는 형태로 집계 구조 자기 조립. Micelles (일반적으로 20-200에서 배열 하는) 많은 세제 단위체 micelle 코어 수성 용 매에 직면 micelle 쉘 계층에 배열 하는 친수성 머리 그룹을 형성 하는 소수 성의 알 킬 체인으로 구성 됩니다. 세제 및 micelle 형성의 동작 고전적인 찰스 Tanford의 소수 성 효과,28 및 크기에 의해 설명 하고있다 고 막 단백질 연구에 일반적으로 사용 되 세제에서 micelles의 모양 작은 각 뿌리기를 사용 하 여 특징. 29 , 30 세제 조직 막 단백질에 대 한 공부도 했다 고 깔끔한 세제 유사한 배열에서 단백질을 둘러싼 세제 분자와 단백질 세제 단지 (Pdc)의 형성 예상 micelles입니다. 31
하나 추가 세제를 사용 하 여 장점은 다른 세제를 통합 하 여 결과 micelle 속성을 조작할 수 있습니다. 많은 세제 전시 이상적인 혼합 하 고 혼합된 micelles의 선택 속성 구성 요소와 혼합의 비율에서 예측도 있습니다. 그러나 22 , 세제의 존재 수 여전히 도전을 제시 생물 characterizations 위한 전체 신호에 기여 함으로써. 예를 들어, x 선 및 산란 기법, PDC에 세제에서 신호 단백질에서 실제적으로 구별할 수 아니다. 32 단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)와 조사 일반적으로 의존 갇혀 (냉동된) 입자; 단백질의 구조 정보는 여전히 특정 세제 또는 배경에 추가 세제의 높은 농도 의해 왜곡 됩니다. 33 (세제 포함) 전체 PDC 구조 해석으로 대체 방법 특정된 막 단백질 주위 세제를 재구성 하기 위해 노력 하는 계산 방법을 통해 되었습니다. 34
중성자 산란의 경우는 micelle에서 세제의 코어-쉘 배열 관찰된 산란에 기여 하는 폼 팩터를 생성 합니다. 다행히, 그들은 그물 관찰된 산란에 기여 하지 않는 그런 솔루션 구성 요소를 변경할 수 있습니다. 이 "일치 대조" 프로세스 산란 길이 조밀도 (버퍼) 배경의 일치를 달성 하기 위해 수소 중수소를 대체 하 여 이루어집니다. (사용 가능한 deuterated 대응)와 세제의 현명한 선택과 혼합의 그들의 비율을 고려 되어야 한다. 세제 micelles에 대 한 이러한 대체 deuterated 알 킬 체인 (d-h-꼬리 대신 꼬리) 하지만 같은 머리 그룹으로는 세제를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 세제는 잘 혼합, 이후35 그들의 집계 해야한다 가중치 두더지 분수 산란 길이 조밀도 두 가지 구성 요소 (h-꼬리와 d-꼬리)의 평균. 이 평균 대비 머리 그룹의 일치 때 유니폼 집계 구조 관찰된 산란에 모든 기여를 제거 하려면 완전히 일치할 수 있습니다.
선물이 여기 세제 micelles의 중성자 대비 화학적으로 동일한 세제 분자 중수소 라고 표시 된 알 킬 체인을 통합 하 여 조작 하는 프로토콜. 19 , 36 , 37 이 micelle 코어와 쉘, 중성자 산란의 고유 능력은 일치 하는 완전 한 동시 대비 수 있습니다. 35 , 38 이 상당히 세련 된 세부 수준 대비 일치 사용할 수 있습니다 그렇지 않으면 unfeasible 막 단백질 구조 연구. 또한,이 일치 하는 대비 접근 세제, 폴리머 교환 반응39 와 기름-물 dispersants,40 , bicelles,41 등 다른 solubilizing 에이전트 등 관련 된 다른 시스템을 확장할 수 있습니다. nanodiscs,42 또는 블록 공중 합체. 43 A 유사한 접근이이 원고, 하지만 알 킬 체인 또는 머리 그룹에 부분 중수소 대체와 단일 세제 종 채용 개요 최근에 출판 되었다. 37 이 수소와 중수소는 세제를 통해 임의의 분포를 개선 하기 위해 예상 될 수 있다 하는 동안 여기, 접근에 비해 대체 하 고 2 단계에 대 한 세제에 사용할 수 있는 위치 제한 수 합성 세제는 고려에 대 한 포즈 추가 과제를 필요합니다.
1 단계와 2 단계 아래 자주 상세한 프로토콜의 중복 때문에 초기 실험 계획 품질 제안서를 제출 할 수 있어야 합니다. 그러나 제안 제출으로 간주 하는, 중성자 실험 임박이 프로세스를 시작 해야 하는 것을 강조 하기 위해 첫 단계로 여기. 그것은 또한 제안에 의해 증명 한다, 필수 단계 중성자 연구에 대 한 필요성을 지 원하는 샘플의 생 화 학적 및 물리적 특성 (를 포함 하 여 순도 안정성)을가지고 하는 것입니다 주목 해야한다. 작은 각 중성자 산란 (SANS)에 대 한 일반적인 논의이 문서의 범위를 벗어납니다. 간단한 지만 철저 한 소개 Kaufmann,44 및 포괄적인 교과서에 초점 맞춘된 생물 작은 각도 솔루션 비 산 재료의 특성은 최근 게시 되었습니다 참조 작업에 제공 됩니다. 45 추가 권장된 독서 토론 섹션에서 제공 됩니다. 작은 각도 산란 산란 과정을 설명 하는 중앙 수량으로 소위 산란 벡터 Q를 사용 합니다. 이 문서 Q 널리 수용 되는 정의 사용 하 여 4π 죄악 (θ) = λ θ가 들어오고 흩어져 빔과 λ 사이의 절반 각도 옹스트롬의 중성자 방사선의 파장 /. 다른 정의 존재 사용 다른 기호 등의 ' 산란 벡터, 그리고 요인 2 π 또는 나노미터 Angstrom 대신를 사용 하 여 다 수 있습니다 ( 그림 10의 내용 참조).

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra MWCO 50KDa 농축기&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC905096</td><td>실험기구</td></tr><tr><td>구연산 암모늄 이염기</td><td>성 Fisher Scientific</td><td>A663</td><td>중간 성분</td></tr><tr><td>황산 암모늄</td><td>EMD Millipore</td><td>2150</td><td>중간 성분</td></tr><tr><td>Bioflo 310 생물 반응기 시스템</td><td>Eppendorf</td><td>M1287-2110</td><td>장비</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Acros</td><td>423525000</td><td>중간 성분</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02025</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>EMD Millipore</td><td>3130</td><td>항생제</td></tr><tr><td>코발트 (II) 염화</td>물 <td>Acros</td><td>AC21413-0050</td><td>중간 구성</td></tr><tr><td>요소 구리 (II) 황산</td>염 <td>Acros</td><td>AC19771-1000&nbsp;</td><td>중간 구성 요소</td></tr><tr><td>중수소산화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>756822</td><td>중간 성분</td></tr><tr><td>드라이라이트 가스 청정기</td><td>WA Hammond Drierite Co., Ltd.</td><td>27068</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 디소듐, 이수화물</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td>중간 구성 요소</td></tr><tr><td>Emulsiflex-C3</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td>장비</td></tr> <tr><td>및 Auml; kta 퓨리파이어 UPC100</td><td>GE 헬스케어&nbsp;</td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>중간 구성</td></tr><tr><td>요소 HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17116701</tr><tr><td>이미다졸</td><td>VWR</td><td>97064-622</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Teknova</td><td>I3325</td><td></td></tr><tr><td>염화철(III) 육수화물</td><td>MP 생화학 ICN19404590</td><td></td><td>중간 성분</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>중간 성분</td></tr><tr><td>망간(II) 황산염 일수화물</td><td>Acros</td><td>AC20590-5000</td><td>중간 구성 요소</td></tr><tr><td>MaxQ 6000 인큐베이팅/냉장 쉐이커</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7&nbsp;</td><td>설비</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-d25-&beta;-D-maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310T</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 monobasic</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td>중간 구성 요소</td></tr><tr><td>RC 6 Plus Centrifuge</td><td>Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td>장비</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 프로테아제 억제제 칵테일 정제, EDTA 무료</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7907</td><td>중간 구성 요소</td></tr><tr><td>0.2&micro의 멸균 25mm 주사기 필터; m PES 멤브레인</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>labware</td></tr><tr><td>0.2&micro가 있는 멸균 일회용 병 상단 필터; m PES 멤브레인</td><td>Thermo Scientific</td><td>596-4520&nbsp;</td><td>실험기구</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE 헬스케어&nbsp;</td><td></td><td></td>17517501</tr><tr><td>Superose-12 10/300 GL 컬럼&nbsp;</td><td>GE 헬스케어&nbsp;</td><td></td><td></td>17517301</tr><tr><td>Ultrospec 10 세포 밀도</td>계 <td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>80211630</td><td>장비</td></tr><tr><td>황산 아연 수화물</td><td>Acros</td><td>AC38980-2500&nbsp;</td><td>중간 구성 요소</td></tr></tbody></table>

막 단백질 구조 분석 및 ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

높은 유출 동위 원소 반응 기의 오크 리 지 국립 연구소에서 생물 학적 작은 각 중성자 뿌리기 악기는 생물 자료, 처리, 바이오 연료 및 바이오 영감 자료 취재를 나노미터의 수사에 전념 마이크로미터 길이 가늠 자. 막 단백질의 물리적 특성 (즉, 크기와 모양) 조사에 대 한 여기에 제시 된 방법 (여기, MmIAP, Methanoculleus marisnigri에서 intramembrane aspartyl 프로 테아 제) 솔루션 micelle을 형성의 세제는 다른 사람의 사이에서이 작은 각 중성자 뿌리기 악기에 대 한 잘 적합 한 다른 생물 특성화 기법 단백질 세제의 복잡 한 구조에 세제 기여를 해결 하기 위해 그들의 무 능력에 의해 방해 된다. 또한, 바이오 Deuteration 실험실에 대 한 액세스는 대규모 경작을 준비 하 고 표현 하는 중수소 표시 된 단백질 단백질에서 향상 된 산란 신호에 대 한 독특한 기능을 제공 합니다. 이 기술은 고해상도에서 구조 세부 정보를 제공 하지 않습니다, 막 단백질에 대 한 구조적 지식 격차 근처 원자 해상도 필요 없이 연구의 많은 주소 지정 가능 영역을 포함. 예를 들어이 지역 섭 동, 그리고 접는 펼쳐진 이벤트 동안 oligomeric 상태, 복잡 한 구조적 변경의 결정을 포함합니다. 이러한 조사는이 방법의 응용 프로그램을 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.

빔 시간과 악기 제안 명확 하 게 제안 된 실험의 유효한 평가 될 수 있도록 검토 위원회에 필요한 모든 정보를 전달 한다. NSS와 통신 매우 경험이 사용자에 대 한 제안 했다. 초기 타당성 및 가이드 제안 제출 타당성, 안전 및 높은-영향 과학에 대 한 잠재력을 강조 하는 NSS 평가할 수 있습니다. 제안에서 제공 하는 정보는 배경 정보 및 연구;의 중요성에 대 한 컨텍스트 포함 되어야 합니다. 주어질 것으로 예상 되는 지식 및 과학;의 관련된 분야에서 현재 이해에 미치는이 설명 작업, 샘플, 방법, 및 절차를 사용할 것입니다; 그리고, 해당 되는 경우 관련 간행물 및 결과 포함 하 여 시설에서 팀의 이전 생산성. 제안 템플릿 및 제안, 준비 사항 등 유용한 자원, 중성자 과학 사용자 포털 (neutrons.ornl.gov/users)를 통해 사용자에 게 사용할 수 있습니다.
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이 프로토콜에는 저해상도 ab initio 모델 및 대비 세제의 일치와 작은 각 중성자 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 세제 solubilized 막 단백질의 구조 정보를 가져오는 방법을 보여 줍니다.

막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

이 방법은 올리고머 상태, 크기, 전반적인 모양 및 용액의 낮은 해상도 구조와 같은 일체형 막 단백질에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 막 단백질의 솔루션 연구는 세제와 같은 분자를 안정화해야 합니다. 이 기술은 세제를 보이지 않게 하고 막 단백질의 신호를 강조한다는 장점이 있습니다.단백질의 1/3 이상이 많은 중요한 세포 기능을 능력을 발휘하는 막에 있기 때문에 이 기술의 의미는 많은 생물학 및 의학 연구 질문으로 확장됩니다. 이 방법의 시각적 데모는 중음부 라벨링 및 중성자 산란 단계가 이러한 기술에 대한 교육을 제공하는 기관이 거의 없기 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 먼저, 콘트라스트 변형 데이터 분석을 위한 모듈인 웹 애플리케이션 MULCh를 사용하여 중성자 산란 길이 밀도 또는 SD를 결정한다.왼쪽 탐색 창에 있는 콘트라스트를 클릭하여 콘트라스트 모듈을 엽니다. 프로젝트 제목에 대한 텍스트를 제공하고 두 구성 요소에 대한 세부 정보를 하위 단위 1 및 하위 단위 2로 입력합니다. 수식 텍스트 상자의 각 구성 요소에 대한 분자 수식을 입력합니다.그런 다음 볼륨 아래 상자에 있는 각 구성 요소에 대한 입방 협전으로 볼륨을 입력합니다. 마지막으로 버퍼 구성 요소에 대한 세부 정보를 입력합니다. 중성자 대비 계산을 수행하려면 제출을 클릭합니다.분기 길이 밀도 및 콘트라스트 일치 점의 테이블을 제공하고 버퍼에서 지정된 D2O 백분율로 이러한 매개 변수를 결정하는 공식을 제공하는 결과 페이지가 생성됩니다. 부품 대비 일치 점에 특히 주의를 기울여 산란 매개 변수를 검토합니다. LB 배지에서 표적 단백질 서열에 대한 유도식 벡터를 수용하는 E.coli 세포를 약 1의 600 나노미터 또는 OD 600에서 광학 밀도로 키워보도록 한다.최소 배지의 3밀리리터에서 LB 배양1~20을 희석시킴으로써 중음 단백질의 과잉 발현을 위해 확장하기 전에 E.coli 세포를 중수소에 부착된 배지에 적응한다. 약 1의 OD 600으로 성장한 후, 50, 75 및 100%D2O를 포함하는 최소 배지를 사용하여 1~20개의 희석을 반복한다. 일단 적응되면, 유두된 세포 질량의 수율을 높이기 위하여 생물 반응기에서 문화를 계속 성장합니다.D2O 함량이 증가함에 따라 성장률이 감소할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 수확, lyse 및 정화합니다. 다음으로 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 최종 교환 버퍼의 두 개 이상의 컬럼 볼륨으로 크기 배제 컬럼을 평형화합니다.시료를 주입한 후, 관심 있는 단백질에 해당하는 분획을 격리하여 컬럼을 실행한다. 작은 각도 중성자 산란 또는 SANS 배경 뺄셈에 대한 일치하는 버퍼의 알리쿼트를 예약합니다. SANS 데이터를 수집하려면 먼저 샘플과 버퍼를 쿼츠 셀에 로드합니다.빔 셔터가 닫히도록 한 후 샘플 환경 영역에 접근하여 석영 셀을 샘플 체인저에 배치합니다. 각 샘플 셀에 대한 샘플 체인저 위치를 기록합니다. 시료 환경 영역을 떠나기 전에 영역을 확인하고 빔 경로가 방해가 없는지 확인합니다.그런 다음 빔 셔터를 엽니다. 자동화된 데이터 수집을 위한 테이블 스캔을 실행합니다. 중성자 산란 과학자가 제공하는 계측기 작동 지침을 따르십시오.2D 이미지에서 1D 플롯으로 SANS 데이터를 줄이기 위해 Mantid 플롯 소프트웨어 및 파이썬 스크립트를 사용합니다. 이렇게 하려면 원격 분석 클러스터에 로그인하고 명령줄에서 맨티드 플롯을 실행합니다. 그런 다음 제공된 사용자 감소 스크립트를 열고 해당 목록에서 버퍼 쌍으로 샘플에 대한 해당 검사 번호 또는 식별을 배치합니다.스크립트를 실행하여 지정된 위치에 있는 4개의 열 텍스트 파일로 축소된 데이터를 생성합니다. 적절한 작업 공간과 맨티드 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 분산 프로파일을 초기 검사할 경우 오류가 있는 플롯을 선택합니다. ATSAS 소프트웨어 제품군을 다운로드하고 데이터 플로팅, 버퍼 크기 조정 및 뺄셈 및 Guinier 분석을 위해 PRIMUS를 사용합니다.ATSAS, SAS 데이터 분석 응용 프로그램을 실행하고 샘플 및 버퍼 쌍에 해당하는 감소된 데이터 파일을 로드합니다. 버퍼를 제대로 확장하려면 두 프로파일이 평평한 수준에서 유사한 높은 Q에서 데이터 범위를 선택하고 작업 탭 아래에 있는 배율 단추를 클릭합니다. 모든 점을 보려면 데이터 범위를 늘리고 빼기를 클릭하여 이 작업을 수행합니다.SAS 데이터 분석 응용 프로그램의 분석 탭을 사용하여 버퍼 빼기 샘플 데이터의 Guinier 분석을 수행합니다. 목록에서 적절한 파일이 선택되어 있는지 확인하고 gyration 의 반지름을 클릭합니다. 자동 RG 버튼을 클릭하여 Guinier 맞춤을 수행하려는 자동 시도가 제공됩니다.Q 최대 시간 RG 제한이 1.3 미만일 때까지 높은 Q 포인트를 빼앗아 데이터 범위를 좁히기 시작하는 데 사용되는 데이터 범위를 확장합니다. 잔류 플롯을 사용하여 데이터가 맞춤 범위에서 선형인지 확인합니다. 적합 영역을 조정하고 적합성에 사용되는 데이터 범위에 대한 이러한 값의 민감도를 모니터링합니다.노메에서 R의 확률 분포 함수 P를 가져옵니다. 이제 분석 탭 내에서 거리 분포 마법사를 시작합니다. 데이터에 잘 맞는 것을 얻는 것은 품질 모델을 얻는 데 필수적입니다.분자 내의 최대 중원자 거리인 Dmax를 결정합니다. Rmax를 강제로 강제로 상자를 선택 해제하고 Dmax에 대한 큰 값을 입력하여 Dmax값을 추정합니다. R의 P 플롯에서 첫 번째 X 가로채기는 이 추정치를 산출합니다.이 Dmax 값과 데이터 및 결과 P의 P 곡선에 대한 노임 맞춤을 최적화하는 데 사용되는 포인트 수에 사용되는 데이터 범위를 점진적으로 변경합니다. SAS 데이터 분석의 분석 탭의 dammif 단추에서 PRIMUS 셰이프 마법사를 시작하고 매개 변수의 수동 선택을 사용합니다. Guinier 범위를 적합에서 정의하고 탐색 단추를 사용하여 다음 단계로 진행합니다.P의 R 플롯에서 맞춤 값을 정의하고 다음 단계로 진행합니다. ab initio 모델링 프로세스에 대한 매개 변수를 제공합니다. 그런 다음 커밋 단추를 사용하여 프로세스를 시작합니다.ATSAS 내에서 초콤을 사용하여 관련 고해상도 모델로 최종 산 봉투를 오버레이하고 겹쳐 놓습니다. 작업 디렉터리에서 SANS 봉투에 맞게 고해상도 PDB 모델의 복사본을 배치합니다. 그런 다음 먼저 나열된 템플릿 구조가 있는 두 개의 인수로 PDB 파일 이름을 사용하여 명령줄에서 supcomb을 실행합니다.마지막으로 3D 분자 그래픽 보기 프로그램인 PyMOL을 사용하여 ab initio 모델 결과를 시각화합니다. SANS 봉투와 고해상도 구조가 겹쳐지면 이러한 모델은 분자 그래픽 보기 프로그램을 사용하여 시각화할 수 있습니다. PyMOL 시각화 프로세스에 대한 개요가 표시됩니다.PyMOL에서 PDB 구조 파일이 열리면 PyMOL 뷰어 창에 모델을 표시해야 합니다. 각 모델의 표현은 각 파일 이름 옆에 있는 S 버튼을 사용하여 변경할 수 있습니다. 여기서 표면 표현은 SANS 봉투에 사용되며 만화 표현은 고해상도 모델의 단백질 중추에 사용됩니다.C 버튼 아래에서 사용할 수 있는 옵션에서 적합한 색상 구성표를 선택할 수 있습니다. 단백질 체인의 경우 체인보우 착색은 해석을 돕기 위해 N에서 C 종착색으로 색상 그라데이션을 제공합니다. 투명도는 봉투 내의 단백질 구조를 더 잘 시각화할 수 있도록 표면 표현에 적용됩니다.게시 이미지의 경우 흰색 배경을 권장합니다. 이러한 시각화 큐가 적용되면 구조를 클릭하고 드래그하여 3D 구조를 검사할 수 있습니다. 원근과 분자 회전 및 번역의 조작을 수행 할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 정확하게 D2O H2O 용매와 세제 헤드와 꼬리 그룹의 중성자 대비를 일치하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후,이 기술은 인트라멤브레인 아스파토 프로테아제의 구조를 탐구하기위한 길을 열었습니다. 이 단백질은 면역 반응, C형 간염 및 알츠하이머 병에 관여합니다.생화학 실험실과 중성자 빔 시설에서 일하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비 착용 및 모든 시설 안전 규칙 및 방사선 게시에 따르는 것과 같은 예방 조치는 필수입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

구 균 에서 탄수화물 기질 의무적인 단백질의 광범위 한 생 화 학적 및 구조 특성화를 수행 하기 위한 효율적인된 프로토콜 제공 됩니다.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

이 방법은 엑스레이 결정학 및 소 각 x 선 산란 (SAXS), 복제, 표현, 및 구조 결심을 위한 재조합 Nsa1의 정화를 설명 하 고 다른 단백질의 하이브리드 구조 분석에 대 한 적용 둘 다를 포함 하는 주문 하 고 도메인을 난잡.

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

우리는 세제에 민감한 예를 들어 정렬 수용 체, sortilin, GLUT4, 포도 당 운송업 자 단백질의 첫 번째 luminal 루프의 바인딩을 사용 하는 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

여기, 우리는 어떻게 작은 각 엑스레이 뿌리기 (SAXS) 고분자 구조를 나타내는 저해상도 봉투에 대 한 정보를 활용할 수 있습니다 제시. 고해상도 구조 기술 엑스레이 결정학, 핵 자기 공명 등와 함께에서 사용 될 때 SAXS 다중 도메인 단백질 및 고분자 복합물 솔루션에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

본 프로토콜은 인간 건강에 중요한 역할을 하는 두 모델 단백질의 구조 및 역학을 조사하는 방법을 기술한다. 이 기술은 벤치 탑 생물 물리학 적 특성화와 중성자 스핀 에코 분광법을 결합하여 단백질 간 운동과 관련된 시간 및 길이 스케일의 역학에 액세스합니다.

중성자 스핀 에코 분광법을 통한 단백질 역학 연구

이 논문은 지질 막의 중성자 스핀 에코 (NSE) 연구에서 샘플 준비, 데이터 감소 및 데이터 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 지질의 현명한 중테리움 라벨링은 중요한 생물학적 과정이 발생하는 중전 길이와 시간 척도에 대한 다양한 막 역학에 접근할 수 있게 합니다.

지질 막 역학 및 막 단백질 상호 작용을 위한 독특한 프로브로 중성자 스핀 에코 분광법

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

본 연구는 TWIK 관련 산에 민감한 K+ 채널 2(Task2)를 나노디스크로 재구성하는 절차를 설명합니다. 이 성공적인 조립은 단일 입자 크라이오전자 현미경으로 확인되었으며, 명확한 2차원 클래스 평균을 얻었다.

나노디스크 내 막 단백질 안정화 기법

배우세요 막 단백질의 저해상도 구조를 SANS와 중수소 표지를 이용해 분석하는 방법을. 세제 간섭을 최소화하고 단백질 크기, 형태, 올리고머 상태를 정밀하게 결정할 수 있습니다.

막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

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