Name: 생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 배우세요 항균 펩타이드의 세균막 투과 및 국소화 메커니즘을 E. coli spheroplast와 B. megaterium protoplast를 이용하여 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 단일 세포 수준에서 펩타이드 상호작용을 정량 분석할 수 있게 합니다.

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연구는 국립 연구소의 알레르기와 감염 증 (NIAID NIH) 수상 R15AI079685에 의해 지원 되었다.

1. 솔루션 준비
참고: 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts를 각각 일으키기 위하여 1.1-1.9, 1.8-1.11 단계에 설명 된 솔루션을 준비 합니다.
<ol><li>1 준비 M Tris-Cl, pH 7.8 10.34 g Tris HCl와 dH2O 125 mL 플라스 크에 50 mL에 트리 스 오의 4.17 g을 용 해 하 여. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) 및 25 mL dH2O 125 mL 플라스 크에 11.98 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 (20 m m MgCl2, 0.7 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>0.05 g MgCl2 (95.2 g/mol) 및 25 mL dH2125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 B (10 m m MgCl2, 0.8 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>50 mL dH2125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 0.8 M 자당을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>5 mg/mL deoxyribonuclease 준비 나 (DNase 나) 0.015 g DNase를 용 해 하 여 dH2O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 나. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게</li>
	<li>0.125 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 준비, EDTA disodium 0.698 g을 용 해 하 여 pH 8.0으로 15 mL dH2O 125 mL 플라스 크에 (372.2 g/mol)를 탈수. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>세 팔 렉 신 하이드 레이트 (365.404 g/mol) dH2O 125 mL 플라스 크에 50 ml에서의 0.03 g을 용 해 하 여 600 µ g/mL 세 팔 렉 신을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 및 4 ° c.에 원뿔 튜브에 저장</li>
	<li>5 mg/mL lysozyme 0.015 g lysozyme dH2O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 용 해 하 여 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게</li>
	<li>DH2O 2 L 플라스 크에 1 리터에 TSB의 30 g을 용 해 하 여 3 %w / v Trypticase 간장 국물 (TSB)를 준비 합니다. 약 수 25 mL 100 mL TSB 각각 대장균 spheroplasts 또는 B. megaterium protoplasts, 의 준비에 사용할 수를 포함 하는 플라스 크에 솔루션. 오토 클레이 브 소독 액체 매체를 플라스 크입니다. 살 균 TSB 실내 온도 또는 4 ° C에서 저장 될 수 있다</li>
	<li>34.23 g 자당 (342.3 g/mol), 0.46 g maleic 산 (116.07 g/mol), 그리고 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O 250 mL 플라스 크에 100 mL에 용 해 하 여 솔루션 C (1 M 자당, 0.04 M maleate, 0.04 M MgCl2, pH 6.5)를 준비 합니다. PH 6.5 조정 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>100 mL 3 %w / v TSB와 100 mL 해결책 C 1 리터 유리병에 혼합 하 여 200 mL 원생 동물 매체를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독 솔루션을 상 온에서 저장.</li>
</ol>2입니다. 준비의 숙박 문화
참고: 섹션 2-4 적절 한 무 균 기술을 사용 하 여 수행 합니다. 원하는 경우, 세균성 긴장을 잠재적인 오염 줄이기 위해 항생제 내성에 대 한 플라스 미드를 포함할 수 있습니다. 항생제 저항 긴장을 사용 하 여, 단계 2.1, 3.1-3.2, 그리고 4.1-4.4에에서 필요한 항생제를 추가 합니다.
<ol><li>살 균 피 펫 팁을 사용 하 고 3 %w / v TSB의 2-3 mL를 포함 하는 14 mL 문화 관으로 배치 박테리아에의 한 식민지를 선택 하 여 숙박 문화를 준비 합니다. 16-21 h를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>3. 그람 음성의 대장균 Spheroplasts의 준비
<ol><li>250 mL 플라스 크에 25 mL 볼륨 3 %w / v TSB의 숙박 문화 1: 100 희석 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 600 0.5-0.8의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 2.5 h를 흔들어 동안 품 어 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 희석이 문화 1:10 3 %w / v TSB의 30 ml에서 및 2.5 h 60 µ g/mL 세 팔 렉 신 (347.4 g/mol) 단일 셀 필 라 멘 트의 약 생산의 존재를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어 50-150 µ m 길이에서 는 가벼운 현미경 (그림 1B)를 사용 하 여 1000 X 배율에서 관찰.</li>
	<li>1500 x g, 4 분 Decant 4 ° C에서 세균성 솔루션 centrifuging 여는 필 라 멘 트를 수확 하 고 상쾌한, 펠 릿 예약 취소.</li>
	<li>부드럽게 되는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하는 0.8 M 자당의 1 mL을 추가 하 여는 필 라 멘 트를 씻어. 1 분 동안 incubate 고은 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>150 µ L 1의 추가 M Tris-Cl (pH 7.8), lysozyme 5 mg/mL의 120 µ L, 5 mg/mL DNase의 30 µ L, 그리고 펠 릿을 주문 하 고 10 분 동안 실내 온도에 솔루션을 품 어는 그들의 각각에서 0.125 M EDTA의 120 µ L.</li>
	<li>추가 솔루션의 1 mL 점차적으로 1 분 이상 3.5 동안 부드럽게 손으로 솔루션을 소용돌이 micropipette를 사용 하 여 준비 하는 솔루션을 합니다. 실 온에서 4 분에 대 한 솔루션을 품 어.</li>
	<li>두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 4 ° C 솔루션 B의 7 mL를 넣어. 이 두 튜브의 각 3.6에서 준비 하는 솔루션의 동일 금액을 추가 합니다. 1500 x g, 4 분 4 ° C에서 솔루션 원심</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 제거 1-의 2 개 mL 상쾌한 제외 하 고 모두는 펠 렛을 방해 하지 않고. 부드럽게 P1000 micropipette를 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 펠 릿을 resuspend. 시각적으로 확인 spheroplasts 형성 1000 X 확대 가벼운 현미경 (그림 1C)을 사용 하 여 샘플을 관찰 하 여.</li>
	<li>-20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 spheroplasts를 저장 합니다.</li>
</ol>4. 그람 양성 B. megaterium Protoplasts의 준비
<ol><li>250 mL 플라스 크에 희석 3 %w / v TSB의 100 mL에서 하룻밤 문화 1:1,000 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 0.9-의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 4.5 h 흔들어 동안 품 어 1.0 600 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.</li>
	<li>2 50 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기에 액체 문화를 부 어.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 두 원뿔 튜브에서 상쾌한을 삭제 합니다. 2.5 mL 원생 동물 매체에 각 펠 릿을 resuspend 하 고 resuspended 솔루션을 결합 하 여 단일 원뿔 관으로. 125 mL 플라스 크에 결합 된 resuspended 솔루션 플라스틱</li>
	<li>5 mg/mL lysozyme의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C에서 1 시간 흔들어 동안 품 어.</li>
	<li>1000 배 확대 가벼운 현미경, 부정, 분야 (그림 2) 대신 부 봉으로 표시 되는 박테리아와 같은 지적을 사용 하 여 아래 protoplasts의 증가 모니터링 합니다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 솔루션 15 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 전송.</li>
	<li>가만히 따르다는 상쾌한 고 다시 5 mL 원생 동물 미디어에 펠 릿을 중단. -20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 protoplasts를 저장 합니다.</li>
</ol>5. 펩타이드 솔루션 및 이미징 막 염료의 준비
<ol><li>
펩 티 드 솔루션
	<ol>
<li>알루미늄 호 일에 싸여 microfuge 관, FITC BF2 P11A 800 µ L dH2오 사용 펩 티 드 단백질 농도 측정을 수행 하려면 적어도 하나의 트립토판 잔류물을 포함 표시의 2 밀리 그램을 디졸브.</li>
		<li>280에서 펩 티 드 용액의 흡 광도 측정 하는 spectrophotometrically, 3 중에 nm. 트립토판 (5,700/Mcm)에 대 한 어 금 니 소멸 계수를 사용 하 여 펩 티 드 농도 계산 합니다.</li>
		<li>DH-20 ° C에서 microfuge 관에서 100-200 µ M. 저장소의 최종 농도에2O 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸여 있는 펩 티 드 농도 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
막 염료
	<ol>
<li>Microfuge 관에서 DMSO의 843.3 µ L에 디-8-ANEPPS의 5 mg를 용 해 하 여 디-8-ANEPPS (592.9 g/mol)의 10 m m 재고를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
		<li>Microfuge 관에서 10 m m 디-8-ANEPPS의 3 µ L 997 µ L DMSO를 추가 하 여 0.03 m m 디-8-ANEPPS의 1 mL를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 microfuge 관에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 대장균 Spheroplasts 및 B. megaterium Protoplasts를 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법의 시각화
<ol><li>Spheroplasts 또는 protoplasts 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드에 5 µ L 플라스틱 FITC 앰프 (100-200 µ M) 슬라이드에 표시 된의 2 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어.</li>
	<li>슬라이드에는 막 염료 디-8-ANEPPS (0.03 m m)의 1 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어. 유리 coverslip로 커버 하 고 매니큐어와 함께 인감.</li>
	<li>Confocal 현미경 및 아르곤 레이저를 켭니다. 20% 전원 출력을 20% 전송 아르곤 레이저를 조정 합니다.</li>
	<li>각각 499-532 nm와 FITC 표시 된 펩 티 드 방출 채널 및 디-8-ANEPPS-표시 막 염료 방출 채널, 670-745 nm의 방출 파장 범위를 설정 합니다.</li>
	<li>이미지 protoplasts 또는 spheroplasts (그림 1 및 그림 2) 63 X 목표. 8 비트를 이미징 소프트웨어를 사용 하 여, 512 x 512 복합 z-스택 이미지 구성 0.5 µ m 조각 spheroplast 또는 원생 동물의 전체. 참고: 이미징 spheroplasts 및 protoplasts 동안 피가 통해 방출 감소를 신중 하 게 고려 걸릴. 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
</ol>7입니다. 앰프 지역화의 특성
<ol><li>이미징 소프트웨어에 복합 z-스택 이미지를 엽니다. Spheroplast 또는 원생 동물의 센터-대부분 슬라이스를 찾아서 한 원형 지역의 관심 (ROI)을 배치 (직경에서 0.3 μ m) 막 (ROI 1), spheroplast 또는 원생 동물 (ROI 2)의 중심에와 spheroplast 또는 측정 하는 원생 동물에 배경 형광 (ROI 3) (그림 5) 포화 픽셀의 포함을 하지 마십시오. 이미징 소프트웨어에 의해 각 ROI의 형광 강도 계산할 수 있습니다. 참고: 경우에 펩 티 드를 막의 전체를 지역화 하지 않습니다, 그릴 때 투자 수익 1 펩 티 드 지역화는 막의 지역에.</li>
	<li>다음 방정식을 사용 하 여 막 펩 티 드 형광 강도 세포내 펩 티 드 형광 강도의 비율 결정. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> 참고: 투자 수익 3에서 형광 강도에서 뺍니다 2 투자 수익 및 투자 수익 1 형광 강렬 배경 형광에 대 한 계정을 위해.</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언 됩니다.

여기에 제시 된 프로토콜 연구자를 더 빠르게 세균 이미지의 더 큰 샘플 크기 확대, 구형 박테리아, 오리엔트, 찾아서 이미지를 훨씬 더 쉽게 하기 때문에 가능 하 게. 이 향상 된 기능은 데이터를 수집 하는 여러 가지 면에서 유용 합니다. 첫째, 펩 티 드 지역화 패턴의 체계적인 정량 분석을 수 있습니다. 동안 질적 동향은 이미지의 작은 세트에서 설명 될 수 있다, 높은-품질의 이미지의 큰 샘플 집합에 대해서만 공개 더 nuanced 지역화 패턴, 동향 펩 티 드 대 translocates 셀의 비율을 localizes 같은 막입니다. 또한, 더 나은 해결 수 막 지역화에서 내부 형광 쉽게 시간 과정 연구를 얼마나 빨리 펩 티 드와 상호 작용 뿐만 아니라 세균성 세포 지역화 패턴 시간이 지남에 변경 하는 방법으로 평가 수행할 수 있습니다. 향상 된 해상도 또한 작은 박테리아 가능 하지 않은 펩 티 드 지역화 추세를 고려 하는 연구를 수 있습니다. 예를 들어 일부 우리의 관찰 된 spheroplasts와 protoplasts, 펩...

항균 성 펩 티 드 (암페어)는 기존의 항생제1,2,3,,45대 안으로 그들의 잠재적인 사용 주의 얻고 있다. 앰프는 여 세포 막에 걸쳐 translocating 핵 산 또는 세포내 구성 요소와 상호 작용 하는 셀 내용을6의 누설을 일으키는 막 permeabilizing 여 박테리아를 죽 일. 항생제로 그들의 사용 이외에 앰프를 translocating 수 있습니다 적응 시킬 약물 전달 응용 프로그램에 대 한 그들은 불 침투성 세포 막7,8교차 비 비정상적으로 수 있기 때문에. 우리, 따라서, 약물 디자인에 그들의 사용을 위한 기초를 누워 행동의 근본적인 앰프 메커니즘을 이해 하고자 합니다.
지역화 액션9,10,,1112, 의 자신의 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 세균성 세포에 붙일 라벨의 패턴을 평가 하는 방법을 제공 하는 confocal 현미경 검사 법 13 , 14. 박테리아의 막의 라벨, 하나 붙일 레이블된 펩 티 드 막에 세균성 세포의 세포내 공간 localizes 경우 확인할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 및 슬라이드15에 박테리아의 변수 방향 도전 이미징 할 수 있는 박테리아의 작은 크기와 막대 모양에 의해 제한 됩니다.
Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 붙일 레이블된 펩 티 드 지역화 패턴의 향상 된 시각화 수 있도록 제시 방법의 목표가입니다. 시각화는 작고, 얇은, 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium)를 설정 하 여 향상 된 확대, 둥근 형태로 박테리아 라고도 (그람 음성 긴장)에 대 한 spheroplasts 그리고 protoplasts (그람 양성 긴장)에 대 한16,17,18,19,,2021. Spheroplasts와 protoplasts는 그들의 증가 크기와 그 영상에 대 한 관련성이 없는 슬라이드에 박테리아의 방향을 만드는 그들의 대칭 모양 때문에 이미지 하기 쉽습니다. 또한, 우리는 양적 앰프 중 막 지역화 또는 translocating로 성격을 나타내기 위하여 confocal 현미경 검사 법 데이터를 분석 하는 체계적인 접근 방법을 제시. 이러한 방법을 적용 쉽게 구별에 놓여있는지 펩 티 드 지역화 패턴 표시 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 다양 한 앰프, 세포 관통 펩 티 드를 포함 하 여 다른 막-활성 에이전트의 지역화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
뚜렷한이 기술의 장점은 그것 셀이15, 일반적으로 식별 하는 데 사용 하는 다른 형광 분석에 반대를 공개 수 있습니다 단일 세포 수준에서의 행동의 메커니즘에 통찰력을 제공 하나는 대량 견적9,22,23,,2425만 제공 하는 앰프의 행동의 메커니즘. Spheroplasts 및 protoplasts 앰프 셀 항목을 평가 사용 때문에 지질 소포24등 셀 항목을 평가 하기 위해 사용 되는 다른 모델 보다 더 순수 관련15 특정 유용한26 입니다.

<table><tbody><tr><td>트리즈마 하이드로클로라이드 (트리스 HCl)</td><td>시그마</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스 (트리스 OH)</td><td>시그마</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>시그마</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>시그마</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>데옥시리보뉴클레아제 I</td><td>시그마</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>시그마</td><td>106361</td><td>원래 프로토콜 개발에 사용된 시그마 106361; 106361 ED2SS를 대체품으로 사용하여 단종</td></tr>됨 <tr><td>세팔렉신 수화물</td><td>시그마</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL 트립티카제 콩 육수</td><td>피셔 사이언</td>티픽 <td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A FITC</td><td>네오사이언티픽</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Biotium</td><td>61012</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869</td><td>원래 프로토콜 개발에 Sigma D8779를 사용했습니다. D8779는 34869를 대체품으로 단종</td></tr>했습니다<tr><td>. Maleic acid</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm 주사기 필터 w/ 0.2 &mu; m HT Tuffryn Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5 II</td><td>이미지 획득용</td></tr><tr><td>Leica Application Suite, Advanced Fluorescence</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>이미지 처리용</td></tr></tbody></table>

생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 spheroplasts protoplasts의 시각화

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

박테리아 내에서 펩 티 드 지역화 패턴을 평가 하는 방법으로 confocal 현미경 검사 법의 사용은 일반적으로 기존의 가벼운 현미경의 해결책 한계에 의해 억제 됩니다. 선물이 작은 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 변환 하는 프로토콜 특정된 현미경에 대 한 해상도 쉽게 향상 될 수 없습니다, 더 큰, 쉽게 군데 둥근 모양으로 spheroplasts 또는 protoplasts 라고합니다. 이 변환 관찰자를 펩 티 드 (즉, 막 지역화) 세균 막으로 자신을 결 사 또는 교차 하는 셀 (예: translocating) 입력을 막 신속 하 고 명확 하 게 결정할 수 있습니다. 이 방법을 우리는 또한 막 지역화 또는 translocating으로 펩 티 드를 특성화 하는 체계적인 방법을 제시. 이 메서드를 사용 하 여 막 활성 펩 티 드 및 세균성 긴장의 다양 한 수, 있지만 우리 Buforin II P11A의 상호 작용을 관찰 하 여이 프로토콜의 유틸리티 설명 (BF2 P11A), 대장균 과 항균 성 펩타이드 (AMP), spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts입니다.

박테리아를 확대 하 고 구형, 여 우리가 쉽게 펩 티 드 세균 막에 지역화 또는 세균 막에 걸쳐 이동 쉽게 구분할 수 있습니다. 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 게 도전 막에 지역화 신호 겹칠 나타납니다 때문에 막 또는 정상적인 박테리아 세포내 공간에서 펩 티 드 신호 발생 여부를 구별 하는 세포내 공간 (그림 3A)입니다. 반면, 확대의 크기 spheroplasts (2-5 µ m) 및 protoplasts (2-3 µ m)는 일반적으로 단지 1 개의 µ m 직경에서 정상적인 박테리아에 비해 막 마커를 쉽게 하는 세포내 공간 사이 명확 해상도 결과 펩 티 드 지역화 (그림 3B)를 구별 합니다.
여기, spheroplasts 및 protoplasts 앰...

여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.

생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

이 방법은 펩타이드가 세포막에 국한되는지 또는 세포막을 가로질러 트랜스 위치에 있는지에 대한 항균 펩타이드 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 스페로플라스트(spheroplast)와 프로토플라스트(protoplast)를 사용하면 박테리아 세포 이미징에서 발생하는 해상도 문제 없이 생리학적으로 관련된 모델 시스템에서 펩타이드 국소화를 시각화하고 분석할 수 있습니다. 이 방법은 항균 펩타이드에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 세포 침투 펩타이드와 같은 다른 막 활성 제제에도 적용할 수 있습니다.그람 음성 E.coli 스페로플라스트 및 그람 양성 B.메가테륨 프로토플라스트는 적절한 멸균 기술을 사용하여 생물 안전 캐비닛 또는 층류 후드에서 준비해야 합니다. 원하는 경우 박테리아 균주에는 항생제 내성 플라스미드가 포함될 수 있으며, 스페로플라스트와 프로톱플라스트는 개방형 실험실 벤치에서 준비할 수 있습니다. 이 비디오에서는 스페로플라스트와 프로토플라스트를 항생제 내성 박테리아 균주를 사용하여 개방형 실험실 벤치에서 준비합니다.하룻밤 배양을 설정하려면 멸균 마이크로피펫 팁을 사용하여 고체 한천 배양 플레이트에서 단일 박테리아 군체를 3% 트립티아제 대두 육수(TSB) 2-3밀리리터가 들어 있는 14ml 배양 튜브로 옮겨 섭씨 37도에서 16-21시간 동안 진탕 후 배양합니다. 그람 음성 대장균 스페로플라스트를 준비하려면 하룻밤 배양을 1:100 비율로 희석하고 250ml 플라스크에 TSB 25ml를 희석한 다음 박테리아를 진탕 인큐베이터에 다시 2.5시간 동안 다시 넣습니다. 용액이 600 나노 미터에서 0.5-0.8의 광학 밀도에 도달하면, 새로운 250 밀리리터 플라스크의 새로운 TSB에서 1 대 10 비율로 배양액을 희석하여 세팔렉신 밀리리터당 60 마이크로그램의 최종 유효 농도로 두 번째 2.5 시간 배양을 합니다.약 50 - 150 마이크로미터 길이의 단일 세포 필라멘트를 1000x 배율로 광학 현미경으로 시각화하는 것. 박테리아 용액을 원심 분리하여 필라멘트를 수확하고 상층액을 디캔팅합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 1ml의 0.8몰 자당을 부드럽게 첨가하여 필라멘트를 세척합니다.1분 후 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버리고 표시된 시약을 각각의 순서로 필라멘트에 첨가합니다. 실온에서 10분 후 1분에 걸쳐 용액 A 1ml를 서서히 첨가하면서 용액을 손으로 부드럽게 휘젓습니다. 실온에서 용액을 4 분 동안 배양한 다음 필라멘트 현탁액을 섭씨 4도 용액 B.Next의 7 밀리리터를 포함하는 두 개의 15 밀리리터 원뿔형 튜브 사이의 두 개의 동일한 부분 표본으로 필라멘트 현탁액을 분할하고 원심 분리에 의해 필라멘트를 펠렛화하고 비소포 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상등액의 1-2 밀리리터를 제외한 모든 것을 조심스럽게 제거합니다.p1000 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 부드럽게 다시 매달아 놓습니다. 광학 현미경으로 샘플의 작은 부분 표본을 검사하여 스페로플라스트(spheroplast) 형성을 확인합니다. 그런 다음 스페로플라스트는 섭씨 영하 20도에서 최대 일주일 동안 또는 세 번의 동결 해동 주기를 거칠 때까지 보관할 수 있습니다.그람 양성 B.메가테리움 프로토플라스트를 준비하려면 250ml 플라스크에 3% TSB 100ml에 하룻밤 동안 배양한 박테리아를 1:1000의 비율로 희석하여 섭씨 37도에서 4.5시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 액체 배양액이 600 나노미터에서 0.9 - 1.0의 광학 밀도에 도달하면 박테리아를 두 개의 50 밀리리터 원추형 튜브로 분할하여 원심분리하고 비시리오로지컬 피펫을 사용하여 상층액을 소멸시킵니다. 튜브당 2.5ml의 프로토플라스트 배지에 펠릿을 다시 현탁시키고 125ml 플라스크에서 배양하기 위해 현탁액을 단일 원뿔형 튜브로 당깁니다.라이소자임 1ml를 배양액에 첨가하여 섭씨 37도에서 1시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 광학 현미경으로 원형질체의 성장을 모니터링하고 구체 대신 부풀어 오른 막대로 나타나는 박테리아와 같은 불규칙성을 기록합니다. 배양이 끝나면 원심분리를 위해 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮기고 펠릿을 5ml의 프로토플라스트 배지에 다시 현탁시킵니다.그런 다음 원형질체는 섭씨 영하 20도에서 최대 일주일 동안 또는 세 번의 동결 해동 주기를 거칠 때까지 보관할 수 있습니다. 스페로플라스트 또는 프로토플라스트의 시각화를 위해 5마이크로리터의 관심 현탁액을 Poly L Lysine 코팅된 유리 슬라이드에 옮긴 다음 100-200마이크로몰 항균 펩타이드 또는 AMP로 표시된 fitc 2마이크로리터를 옮깁니다. 빛으로부터 보호되어 3분 동안 배양한 후, 1마이크로리터의 적절한 멤브레인 다이를 샘플에 첨가하여 어둠 속에서 3분 더 배양합니다.배양이 끝나면 라벨이 붙은 스페로플라스트 또는 원형아체를 유리 커버 슬립으로 덮고 커버 슬립을 매니큐어로 밀봉합니다. 세포를 이미지화하려면 컨포칼 현미경과 적절한 레이저를 켜고 63x 대물렌즈를 선택한 다음 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 각 관심 박테리아 세포 전체의 0.5마이크로미터 슬라이스로 구성된 8비트 512 x 512 복합 Z 스택 이미지를 얻습니다. 형광 표지된 AMP의 국소화를 시각화하려면 적절한 이미징 분석 프로그램에서 복합 Z 스택 이미지를 열고 관심 있는 첫 번째 스페로플라스트 또는 원형질체의 가장 중앙 슬라이스를 찾습니다.0.3마이크로미터 직경의 원형 관심 영역 하나를 멤브레인에 배치하고, 하나는 세포 중앙에 배치하고, 다른 하나는 세포에서 멀리 떨어진 곳에 배치하여 배경 형광을 측정하고 포화 픽셀을 피하도록 주의합니다. 그런 다음 각 관심 영역의 평균 형광 강도를 소프트웨어로 계산할 수 있습니다. 기존 광학 현미경의 해상도 한계로 인해 형광 표지된 펩타이드 신호가 정상 박테리아의 멤브레인 또는 세포 내 공간에서 발생하는지 구별하기가 어렵습니다.신호가 멤브레인에 국한됨에 따라 세포 내 공간과 겹치는 것처럼 보일 것입니다. 대조적으로, 정상 박테리아에 비해 스페로플라스트와 원형질체의 크기가 커지면 막 마커와 세포 내 공간 사이에 명확한 해상도가 나타납니다. 펩타이드 국소화를 더 쉽게 구별할 수 있습니다.예를 들어, 방금 시연된 바와 같이 컨포칼 형광 현미경으로 E.coli spheroplast와 B.megaterium protoplast에서 세포막을 가로지르는 전위와 막에 대한 국소화를 시각화할 수 있습니다. 스페로플라스트 또는 원형질체의 막 및 세포 내 공간 및 배경에 관심 영역을 배치하면 AMP와 상호 작용하는 각 스페로플라스트 또는 원형질체의 막에서 세포 내 펩타이드 형광 강도 대 펩타이드 형광 강도의 비율을 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 이 방법은 히스톤 유래 미생물 펩타이드 돌연변이와 E.coli 스페로플라스트 및 B.메가테리움 프로토플라스트의 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.이 실험에서 AMP는 두 박테리아 균주에서 유사한 국소화 패턴을 보여주었습니다. 그것을 강조하면 야생형 펩타이드에 비해 전좌가 감소합니다. 궁극적으로 이 기술을 통해 연구자들은 단일 세포 수준에서 펩타이드 국소화 패턴을 탐색할 수 있습니다.관심 펩타이드의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 연구자들이 펩타이드 메커니즘의 체계적인 특성화를 위해 더 많은 수의 이미지를 수집할 수 있을 뿐만 아니라, 더 큰 스페로플라스트 및 원형질체의 이미지는 더 작은 박테리아 세포의 이미지보다 정량 분석을 위해 더 쉽게 관리할 수 있습니다.

production-visualization-bacterial-spheroplasts-protoplasts-to

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

재조합에서 콜레스테롤 바인딩 독소 streptolysin O를 정화하기위한...

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

출처: Figueroa, DM, et.al. 항균 펩타이드 국소화를 특성화하기 위한 박테리아 스페로플라스트 및 프로토플라스트의 생산 및 시각화. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 먼저 세포 분열을 억제하여 필라멘트화를 유도한 다음 세포벽의 효소 소화를 통해 대 장균 스페로플라스트를 생산하는 방법을 보여줍니다. 이 공정에는 현미경 관찰을 위한 적절한 구형 형성 및 안정성을 보장하기 위해 킬레이트제, DNase 및 삼투압 안정제의 제어된 첨가가 포함됩니다.

대장균 스페로플라스의 준비

출처: Figueroa, DM, et al. 항균 펩타이드 국소화를 특성화하기 위한 박테리아 스페로플라스트 및 프로토플라스트의 생산 및 시각화. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 그람 양성 박테리아 Bacillus megaterium에서 원형질체를 생성하는 단계별 절차를 보여줍니다.

그람 양성 박테리아 Bacillus megaterium에서 원형질체 생성

출처: Bratton, B. P. 외, 『박테리아 세포의 3차원 영상 정밀 세포 표현과 단백질 위치 파악』. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 박테리아 세포의 3차원 형광 이미지를 획득하고 분석하여 단일 세포 수준에서 단백질 조직을 연구하는 방법을 시연합니다.

형광 영상을 통한 3차원 박테리아 단백질 분포 시각화

출처: 피게로아, D. 외. 항균 펩타이드 위치 특성화를 위한 박테리아 구상체 및 원형체의 생성 및 시각화. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 막대 모양의 그람 음성 박테리아로부터 스페롤플라스트를 제조하는 과정을 보여줍니다. 박테리아는 항생제 존재 하에서 성장하여 길쭉한 필라멘트를 형성합니다. 이들은 고장성 용액으로 세척한 후 용해 완충제로 처리하여 세포벽 외곽을 제거합니다. 저장성 처리는 스페로플라스트를 형성하며, 이는 냉각된 등장성 용액으로 안정화되어 냉랭 조건에서 보관됩니다.

그람 음성 박테리아로부터 스페로플라스트 생성

세포 내 단백질 접힘에 대한 고유한 품질 관리 메커니즘을 가진 Escherichia coli twin-arginine translocation pathway를 사용하여 항체 단편 라이브러리에서 결합 친화도 및 세포질 용해도를 동시에 스크리닝하여 내막에 항체 단편을 표시하는 방법을 제공합니다.

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

프로토콜 선물 대장균-lactococcal 항균 성 펩 티 드 nisin에 비정규 아미노산 (ncAAs)의 선택적 압력 관을 기반으로. 재조합 식을 통해 대체 정의 된 성장 매체에서 원하는 ncAAs로 동안 그것의 속성을 변경할 수 있습니다. Bioactivity 결과 변화 성장 금지 분석 실험 및 형광 현미경 검사 법에 의해 매핑됩니다.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 생산 하는 항균 성 펩 티 드

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

본 프로토콜은 세포외 막 결합 소포 내부에 포장된 전형적으로 불용성 또는 이황화 결합 함유 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 박테리아 생산을 위한 상세한 방법을 설명합니다. 이것은 응용 생명 공학 및 의학을 포함한 과학 연구의 다양한 영역에 적용될 가능성이 있습니다.

E. coli의 재조합 단백질 충전 소포의 최적화된 생산 및 분석

이 프로토콜은 양이온성 펩타이드 Mel4와 펩타이드 모방 RK758의 항균 활성과 세포독성을 생성하고 평가하는 방법을 설명합니다. 화학 합성, 재조합 발현, 표준화된 기능 분석법을 통합함으로써, 펩타이드 및 소분자 모방체의 생산 및 시험을 위한 효율적인 워크플로우를 제공합니다.

항균 펩타이드 및 그 모방체의 생산 및 시험

배우세요 항균 펩타이드의 세균막 투과 및 국소화 메커니즘을 E. coli spheroplast와 B. megaterium protoplast를 이용하여 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 단일 세포 수준에서 펩타이드 상호작용을 정량 분석할 수 있게 합니다.

생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

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