생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

이 방법은 펩타이드가 세포막에 국한되는지 또는 세포막을 가로질러 트랜스 위치에 있는지에 대한 항균 펩타이드 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 스페로플라스트(spheroplast)와 프로토플라스트(protoplast)를 사용하면 박테리아 세포 이미징에서 발생하는 해상도 문제 없이 생리학적으로 관련된 모델 시스템에서 펩타이드 국소화를 시각화하고 분석할 수 있습니다. 이 방법은 항균 펩타이드에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 세포 침투 펩타이드와 같은 다른 막 활성 제제에도 적용할 수 있습니다.

그람 음성 E.coli 스페로플라스트 및 그람 양성 B.메가테륨 프로토플라스트는 적절한 멸균 기술을 사용하여 생물 안전 캐비닛 또는 층류 후드에서 준비해야 합니다. 원하는 경우 박테리아 균주에는 항생제 내성 플라스미드가 포함될 수 있으며, 스페로플라스트와 프로톱플라스트는 개방형 실험실 벤치에서 준비할 수 있습니다. 이 비디오에서는 스페로플라스트와 프로토플라스트를 항생제 내성 박테리아 균주를 사용하여 개방형 실험실 벤치에서 준비합니다.

하룻밤 배양을 설정하려면 멸균 마이크로피펫 팁을 사용하여 고체 한천 배양 플레이트에서 단일 박테리아 군체를 3% 트립티아제 대두 육수(TSB) 2-3밀리리터가 들어 있는 14ml 배양 튜브로 옮겨 섭씨 37도에서 16-21시간 동안 진탕 후 배양합니다. 그람 음성 대장균 스페로플라스트를 준비하려면 하룻밤 배양을 1:100 비율로 희석하고 250ml 플라스크에 TSB 25ml를 희석한 다음 박테리아를 진탕 인큐베이터에 다시 2.5시간 동안 다시 넣습니다. 용액이 600 나노 미터에서 0.5-0.8의 광학 밀도에 도달하면, 새로운 250 밀리리터 플라스크의 새로운 TSB에서 1 대 10 비율로 배양액을 희석하여 세팔렉신 밀리리터당 60 마이크로그램의 최종 유효 농도로 두 번째 2.5 시간 배양을 합니다.

약 50 - 150 마이크로미터 길이의 단일 세포 필라멘트를 1000x 배율로 광학 현미경으로 시각화하는 것. 박테리아 용액을 원심 분리하여 필라멘트를 수확하고 상층액을 디캔팅합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 1ml의 0.8몰 자당을 부드럽게 첨가하여 필라멘트를 세척합니다.

1분 후 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버리고 표시된 시약을 각각의 순서로 필라멘트에 첨가합니다. 실온에서 10분 후 1분에 걸쳐 용액 A 1ml를 서서히 첨가하면서 용액을 손으로 부드럽게 휘젓습니다. 실온에서 용액을 4 분 동안 배양한 다음 필라멘트 현탁액을 섭씨 4도 용액 B.Next의 7 밀리리터를 포함하는 두 개의 15 밀리리터 원뿔형 튜브 사이의 두 개의 동일한 부분 표본으로 필라멘트 현탁액을 분할하고 원심 분리에 의해 필라멘트를 펠렛화하고 비소포 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상등액의 1-2 밀리리터를 제외한 모든 것을 조심스럽게 제거합니다.

p1000 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 부드럽게 다시 매달아 놓습니다. 광학 현미경으로 샘플의 작은 부분 표본을 검사하여 스페로플라스트(spheroplast) 형성을 확인합니다. 그런 다음 스페로플라스트는 섭씨 영하 20도에서 최대 일주일 동안 또는 세 번의 동결 해동 주기를 거칠 때까지 보관할 수 있습니다.

그람 양성 B.메가테리움 프로토플라스트를 준비하려면 250ml 플라스크에 3% TSB 100ml에 하룻밤 동안 배양한 박테리아를 1:1000의 비율로 희석하여 섭씨 37도에서 4.5시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 액체 배양액이 600 나노미터에서 0.9 - 1.0의 광학 밀도에 도달하면 박테리아를 두 개의 50 밀리리터 원추형 튜브로 분할하여 원심분리하고 비시리오로지컬 피펫을 사용하여 상층액을 소멸시킵니다. 튜브당 2.5ml의 프로토플라스트 배지에 펠릿을 다시 현탁시키고 125ml 플라스크에서 배양하기 위해 현탁액을 단일 원뿔형 튜브로 당깁니다.

라이소자임 1ml를 배양액에 첨가하여 섭씨 37도에서 1시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 광학 현미경으로 원형질체의 성장을 모니터링하고 구체 대신 부풀어 오른 막대로 나타나는 박테리아와 같은 불규칙성을 기록합니다. 배양이 끝나면 원심분리를 위해 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮기고 펠릿을 5ml의 프로토플라스트 배지에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 원형질체는 섭씨 영하 20도에서 최대 일주일 동안 또는 세 번의 동결 해동 주기를 거칠 때까지 보관할 수 있습니다. 스페로플라스트 또는 프로토플라스트의 시각화를 위해 5마이크로리터의 관심 현탁액을 Poly L Lysine 코팅된 유리 슬라이드에 옮긴 다음 100-200마이크로몰 항균 펩타이드 또는 AMP로 표시된 fitc 2마이크로리터를 옮깁니다. 빛으로부터 보호되어 3분 동안 배양한 후, 1마이크로리터의 적절한 멤브레인 다이를 샘플에 첨가하여 어둠 속에서 3분 더 배양합니다.

배양이 끝나면 라벨이 붙은 스페로플라스트 또는 원형아체를 유리 커버 슬립으로 덮고 커버 슬립을 매니큐어로 밀봉합니다. 세포를 이미지화하려면 컨포칼 현미경과 적절한 레이저를 켜고 63x 대물렌즈를 선택한 다음 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 각 관심 박테리아 세포 전체의 0.5마이크로미터 슬라이스로 구성된 8비트 512 x 512 복합 Z 스택 이미지를 얻습니다. 형광 표지된 AMP의 국소화를 시각화하려면 적절한 이미징 분석 프로그램에서 복합 Z 스택 이미지를 열고 관심 있는 첫 번째 스페로플라스트 또는 원형질체의 가장 중앙 슬라이스를 찾습니다.

0.3마이크로미터 직경의 원형 관심 영역 하나를 멤브레인에 배치하고, 하나는 세포 중앙에 배치하고, 다른 하나는 세포에서 멀리 떨어진 곳에 배치하여 배경 형광을 측정하고 포화 픽셀을 피하도록 주의합니다. 그런 다음 각 관심 영역의 평균 형광 강도를 소프트웨어로 계산할 수 있습니다. 기존 광학 현미경의 해상도 한계로 인해 형광 표지된 펩타이드 신호가 정상 박테리아의 멤브레인 또는 세포 내 공간에서 발생하는지 구별하기가 어렵습니다.

신호가 멤브레인에 국한됨에 따라 세포 내 공간과 겹치는 것처럼 보일 것입니다. 대조적으로, 정상 박테리아에 비해 스페로플라스트와 원형질체의 크기가 커지면 막 마커와 세포 내 공간 사이에 명확한 해상도가 나타납니다. 펩타이드 국소화를 더 쉽게 구별할 수 있습니다.

예를 들어, 방금 시연된 바와 같이 컨포칼 형광 현미경으로 E.coli spheroplast와 B.megaterium protoplast에서 세포막을 가로지르는 전위와 막에 대한 국소화를 시각화할 수 있습니다. 스페로플라스트 또는 원형질체의 막 및 세포 내 공간 및 배경에 관심 영역을 배치하면 AMP와 상호 작용하는 각 스페로플라스트 또는 원형질체의 막에서 세포 내 펩타이드 형광 강도 대 펩타이드 형광 강도의 비율을 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 이 방법은 히스톤 유래 미생물 펩타이드 돌연변이와 E.coli 스페로플라스트 및 B.메가테리움 프로토플라스트의 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.

이 실험에서 AMP는 두 박테리아 균주에서 유사한 국소화 패턴을 보여주었습니다. 그것을 강조하면 야생형 펩타이드에 비해 전좌가 감소합니다. 궁극적으로 이 기술을 통해 연구자들은 단일 세포 수준에서 펩타이드 국소화 패턴을 탐색할 수 있습니다.

관심 펩타이드의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 연구자들이 펩타이드 메커니즘의 체계적인 특성화를 위해 더 많은 수의 이미지를 수집할 수 있을 뿐만 아니라, 더 큰 스페로플라스트 및 원형질체의 이미지는 더 작은 박테리아 세포의 이미지보다 정량 분석을 위해 더 쉽게 관리할 수 있습니다.