Name: 조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 마우스 심장 조직 섹션에서 miRNA와 단백질을 동시에 검출하는 제자리 교잡 방법을. 이 기술은 동일한 조직에서 두 생체분자의 상대적 위치를 시각화하여 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 아타 나 시오 스 Papangelis, 원고에 대 한 중요 한 의견에 대 한 감사 하 고 싶습니다. FM은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC;에 의해 지원 BB/M009424/1). IP는 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (17SDG33060002)에 의해 지원 됩니다.

이 연구에 대 한 마우스 심장 조직 샘플 관련 법령 및 기관의 지침에 따라 확인 하 고 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>RNase 무료 ddH2O 준비, 5l ddH2O의 0.1 %diethylpyrocarbonate (DEPC)의 5 mL로 하 여 실 온 (RT)에서 (O/N), 하룻밤. 오토 클레이 브 (121 ° C)에서 DEPC를 비활성화 하려면. 사용 DEPC 처리 ddH2O 준비에 대 한 다운스트림 솔루션으로의 표시. 주의: DEPC는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리.</li>
	<li>DEPC 처리 ddH2O. 압력솥 (121 ° C) 1 리터에 5 PBS 정제를 용 해 하 여 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>1 x PBS의 1 L 당 비 이온 세제의 1 mL를 희석 하 여 0.1% 비 이온 세제/PBS (PBST)를 준비 합니다.</li>
	<li>DEPC 처리 ddH2오 90%, 70%, 50%와 30% 에탄올을 준비</li>
	<li>10 mg/mL DEPC 처리 ddH2오 약 수에에서 성분을 K (ProK)의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 저장 DEPC 처리 ddH2O. 만들어 사용 하기 전에 신선한의 50 ml ProK 재고 솔루션의 100 μ diluting 하 여 ProK의 20 μ g/mL 작업 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>1 x PBS의 50 ml에서 PFA의 2 세대를 추가 하 여 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다. 해산 때까지 가끔 떨고, 65 ° C에서 열. 약 수와-20 ° c.에 게 주의: PFA는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리.</li>
	<li>DdH2O. 압력솥 (121 ° C)의 500 ml 87.8 g를 추가 하 여 3 M NaCl 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>DdH2O. 압력솥 (121 ° C)의 100 ml 20.3 g를 추가 하 여 1 M MgCl2 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>1 M Tris pH 8.0 ddH2O. 조절 pH 8.0의 800 mL에서 녹이는 121.1 g 1 N HCl 몇 방울과 준비, 볼륨 1 L 압력솥 (121 ° C)를가지고. DdH2오의 1 M Tris pH 8.0에서 47.5 ml 2.5 mL를 diluting 하 여 50 mM Tris pH 8.0의 작업 솔루션을 준비</li>
	<li>1 M Tris pH 9.5 ddH2O. 조절 pH 9.5 400 mL에 녹이는 60.6 g 1 N HCl 몇 방울과 준비, 500 mL와 오토 클레이 브 (121 ° C)에 볼륨을가지고.</li>
	<li>3 M NaCl의 1-12 N HCl. 추가 16 mL 약 450 µ L로 DEPC 처리 ddH2O. 조절 pH 8.0의 130 ml Methylimidazole의 1.6 mL diluting 하 여 0.13 M 1 Methylimidazole pH 8.0을 준비 하 고 160 mL에 볼륨을가지고. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다. 주의: 1-Methylimidazole 점 막, 눈과 피부에 유해 하, 증기 두건에서 처리.</li>
	<li>Diluting 176 µ L EDC의 0.13 M 1-Methylimidazole의 10 mL에 의해 0.16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-n ′-ethylcarbodiimide 염 산 염 (EDC)를 준비 합니다. 8.0 사용 하기 전에 12 N HCl. 확인 신선의 약 100 µ L로 pH를 조정 합니다. 주의: EDC는 점 막, 눈, 그리고 피부에 유해한, 증기 두건에서 처리.</li>
	<li>1 x PBS의 50 ml에서 30% H2O2 의 1.5 mL를 희석 하 여 1% H2O2 를 준비 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.</li>
	<li>
준비 20 x SSC pH 7.0 175.3 g의 NaCl 및 나트륨 구 연산 염 (나3C6H5O7) ddH2O. 조정의 800 mL에서의 88.2 g을 용 해 하 여 pH 1의 몇 방울과 7.0 N HCl 1 L 압력솥 (121 ° C)를 볼륨을가지고.
	<ol>
<li>DdH2오 20 x SSC pH 7.0에서 180 mL의 20 mL를 희석 하 여 2 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비</li>
		<li>DdH2오 20 x SSC pH 7.0에서 47.5 ml 2.5 mL를 희석 하 여 1 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비</li>
		<li>DdH2오의 2 x SSC pH 7.0에서 45 mL의 5 mL을 diluting 하 여 0.2 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비</li>
	</ol>
</li>
	<li>DEPC 처리 ddH2O. 만들어 사용 하기 전에 신선한 0.5 mL에 2 x microRNA 분 버퍼의 0.5 mL를 diluting 하 여 교 잡 솔루션 x 1을 준비 합니다.</li>
	<li>DdH2오 약 수의 5 mL을 250 mg을 추가 하 여 Levamisole의 200 m m 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>9 ml PBST, 양 혈 청 1 mL를 희석 하 고 BSA의 0.1 g을 추가 하 여 5 (10% 양 serum/1% BSA/0.2 m m Levamisol) 단계에 대 한 차단 솔루션을 준비 합니다. 사용 하기 전에 10 μ Levamisole의 추가 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.</li>
	<li>PBST의 9 mL 혈 청 염소의 1 mL를 희석 하 고 BSA의 0.1 g을 추가 하 여 단계 6 (10% 염소 serum/1% BSA) 차단 솔루션을 준비 합니다. 4 ° C에서 저장 하 고 1 주일 이내 사용.</li>
	<li>3의 3.3 mL를 diluting 하 여 prestaining 솔루션 준비 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris pH 9.5, 10 mL의 5 mL 100 µ L 트윈 20, ddH2O. 만들어 신선한 81.5 ml에서 Levamisole의 100 µ L의 사용 전에.</li>
	<li>사용 하는 nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly 인산 (BCIP) 정제 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 제조업체의 지침에 따라 기판 솔루션의 20 mL를 준비 하. 20 μ Levamisole의 추가 합니다. 사용 하기 전에 신선한 고 빛 으로부터 보호.</li>
	<li>4 g의 트리, 4.4 g의 NaCl 및 ddH2O. 압력솥 (121 ° C)의 500 mL에 KCl의 375 mg을 추가 하 여 KTBT 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>선택 사항: 1 x PBS의 50 mL에 DAPI 재고 솔루션 (1 mg/mL)의 50 μ diluting 하 여 DAPI 작업 솔루션 (1 μ g/mL)를 준비 합니다. 참고: 표준 솔루션 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris HCl, nuclease 무료 ddH2O, 1 x PBS와 20 x SSC 또는 구매 될 수 있다. 이 프로토콜, 50 mL 유리 Coplin jar 또는 20 mL 폴 리 프로필 렌 슬라이드 우편물에 대 한 단지 사용 되었습니다.</li>
</ol>2. 조직 준비
참고: 여기 사용 마우스 심장 섹션 했다 포 르 말린-고정/파라핀 끼워 넣어진 조직에서 예일 병 리 조직 서비스, 준비, 5 μ m에서 잘라내어 충전된 슬라이드에 위치.
<ol><li>
조직 재입니다.
	<ol>
<li>따뜻한 파라핀 눈 녹는 때까지 교 잡 오븐에서 10 분 동안 60 ° C에서 슬라이드.</li>
		<li>상용 개간 에이전트 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어 ( 재료의 표참조) 10 분, 두 번.</li>
		<li>두 번, 2 분 50% 에탄올과 2 분 30% 에탄올 유리 Coplin jar 2 분, 100% 에탄올의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번, 뒤에 2 분 동안 90% 에탄올, 2 분, 70% 에탄올에에서 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>DEPC 처리 ddH2O 5 분 동안 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>포함 하는 5 분의 1 x PBS의 50 mL 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직 드-proteinating입니다.
	<ol>
<li>슬라이드 20 μ g/mL ProK 작업 솔루션, 교 잡 오븐에 15 분 동안 37 ° C에서 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에서 품 어. 주의: 아래의 소화 될 수 있습니다 가난한 또는 아무 신호 개발 동안-소화 배경 얼룩의 개발과 조직 저하 될 수 있습니다. 최적화는이 단계 (1-20 μ g/mL ProK, 5-20 분 보육, RT-37 ° C)에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>RT에 5 분, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직의 고정입니다.
	<ol>
<li>소수 성 펜을 사용 하 여 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.</li>
		<li>각 슬라이드의 길이를 4 %PFA 솔루션의 500 µ L을 적용 하 고 실시간에 10 분 동안 가로 슬라이드를 품 어</li>
		<li>RT에 5 분, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
		<li>워시 0.13 M 1-10 분, RT에 methylimidazole의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.</li>
		<li>각 슬라이드의 길이에 500 µ L 0.16 M EDC 솔루션의 적용 고 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>실시간에서 50 mM Tris pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어</li>
		<li>린스에 RT, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드. 참고: 두 PFA 및 EDC 고정 단계 미르 가교에 필요한 생략할 수 없습니다. 31
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
내 인 성 과산화 효소 블록입니다.
	<ol>
<li>실시간에서 30 분 동안 1% H2O2 의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어</li>
		<li>린스에 RT, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 교 잡
<ol><li>대상 온도까지 교 잡 솔루션 (슬라이드 당 500 µ L) 교 잡의 오븐에서 50 ° C에서 예 열, (10-15 분)에 도달.</li>
	<li>교 잡 챔버 챔버의 하단에 필터 또는 휴지의 2 개를 놓고 종이 50 %formamide / 1 일로 준비 x SSC. 주의: Formamide은 점 막, 눈과 피부, 증기 두건에서 유일한 핸들에 유해한.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 교 잡 솔루션의 200 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 50 ° C에서 1-3 h에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 250 µ L ofhybridization 솔루션 (최종 농도 50 nM)에서 0.5 µ L 재고 조사 (25 µ M)를 혼합 하 여 프로브 솔루션을 준비 합니다. 참고: 다른 miRNAs 표현 됩니다 서로 다른 수준에서 최적화 프로브 농도 관한이 단계 (1-50 nM), 아무 신호 나 높은 배경 개발을 피하기 위해 필요한 수 있습니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 프로브 솔루션의 250 µ L을 적용 하 고 상단에는 RNase 무료 coverslip 장소. 거품의 형성을 하지 마십시오.</li>
	<li>신중 하 게 교 잡 챔버 parafilm으로 밀봉 하 고 O/N 50 ° c.에서 품 어 참고: 교 잡 온도 각 프로브의 RNA 녹는 온도 (Tm) 약 30 ° C 설정 한다. 최적화 해야 합니다. 여기, 50 ° C 미르-182 교 잡/세척 온도로 사용 되, 그에 따라 조정 다른 프로브에 대 한.</li>
</ol>4. 엄중 세척
<ol><li>2의 200 mL prewarm 대상 온도 (20-40 분)를 도달할 때까지 교 잡 오븐에서 50 ° C에서 x SSC.</li>
	<li>슬라이드 2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 세척 50 ° c 5 분, 또는 coverslips는 느슨하게 때까지 x SSC.</li>
	<li>슬라이드 2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 씻어 5 분, 두 번 RT에서 x SSC.</li>
	<li>0.2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어 RT 5 분에서 x SSC.</li>
	<li>5 분에 대 한 실시간에 PBST의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>5 분에 대 한 RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어. 참고: RNase 무료 조건의 사용은 RNA RNA 하이브리드 안정적인 것으로 간주 됩니다 때문에 더 이상 필요.</li>
</ol>5. 파 항 체 검출
<ol><li>소수 성 펜을 사용 하 여 필요한 경우 다시 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 솔루션 차단의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에서 30 분에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 500 µ L ofblocking 솔루션 항 체 발굴의 0.5 μ diluting 하 여 발굴 항 체 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. 주의: 최적화가이 단계에 대 한 필요할 수 있습니다 (1: 500-1:2, 000).</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 발굴 항 체 솔루션의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 분, RT에 PBST의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>워시 유리 Coplin jar RT 5 분에 대 한 솔루션을 두 번 prestaining의 50 mL를 포함 하는 슬라이드.</li>
	<li>슬라이드 6-24 h, 빛 으로부터 보호에 대 한 37 ° C에 20 mL ofAP 기판 솔루션을 포함 하는 폴 리 프로필 렌 슬라이드 우편물 항아리에 품 어. 주의: 색상 개발 검사 되어야 한다 매 2 h. 최적화가이 단계에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>RT 5 분, KTBT 솔루션 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>5 분에 대 한 RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.</li>
</ol>6입니다. cTnT 항 체 검출
<ol><li>소수 성 펜을 사용 하 여 필요한 경우 다시 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 솔루션 차단의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 200 μ ofblocking 솔루션에서 cTnT 항 체의 2 μ diluting 하 여 cTnT 항 체 솔루션 (1: 100)를 준비 합니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 200 µ L cTnT 항 체 솔루션을 적용 합니다. 슬라이드를 품 어 습도 챔버에 4 ° C에서 가로로 O/N.</li>
	<li>5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 250 μ ofblocking 솔루션 항 체 안티 rabbit 568의 0.5 μ diluting 하 여 안티 rabbit 568 항 체 솔루션 (1: 500)를 준비 합니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 반대로 rabbit 568 항 체 솔루션의 250 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>선택 사항: 각 슬라이드의 길이에 DAPI 작업 솔루션의 250 µ L을 적용 하 고 빛 으로부터 보호 하는 RT에 1 분 동안 가로 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
</ol>7. 장착 및 이미징
<ol><li>장착 매체와 유리 커버 슬립의 2-3 방울과 슬라이드를 탑재 합니다. 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 O/N, 평면, 건조를 슬라이드 수 있습니다.</li>
	<li>Epifluorescent 또는 confocal 현미경 검사 법을 진행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+primary+microRNAs+by+the+Microprocessor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex.</a> Nature. 432, 231-235 (2004).</li>
<li>Hutvagner, G., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+in+a+multiple-turnover+RNAi+enzyme+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.</a> Science. 297, 2056-2060 (2002).</li>
<li>Krol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+microRNA+%28miRNA%29+precursors+and+their+relevance+to+miRNA+biogenesis+and+small+interfering+RNA%2Fshort+hairpin+RNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design.</a> Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).</li>
<li>Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12624257">Vertebrate microRNA genes.</a> Science. 299, 1540(2003).</li>
<li>Tian, T., Wang, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review%3A+microRNA+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A review: microRNA detection methods.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).</li>
<li>Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+potentiate+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs potentiate neural development.</a> Neuron. 64, 303-309 (2009).</li>
<li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).</li>
<li>Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-specific+MicroRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-specific MicroRNAs.</a> Developmental cell. 5, 351-358 (2003).</li>
<li>Kasper, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+Establish+Uniform+Traits+during+the+Architecture+of+Vertebrate+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos.</a> Developmental cell. 40, 552-565 (2017).</li>
<li>Liu, N., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+regulatory+networks+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development.</a> Developmental cell. 18, 510-525 (2010).</li>
<li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+control+in+the+immune+system%3A+basic+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li>
<li>Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miRNA+Interactome+in+Metabolic+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).</li>
<li>Ying, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Tissue+Macrophage-Derived+Exosomal+miRNAs+Can+Modulate+In+Vivo+and+In+Vitro+Insulin+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.</a> Cell. 171, 372-384 (2017).</li>
<li>Perkins, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+expression+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia+and+schizoaffective+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder.</a> Genome biology. 8, R27(2007).</li>
<li>Miller, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-132+dysregulation+in+schizophrenia+has+implications+for+both+neurodevelopment+and+adult+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).</li>
<li>Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derepression+of+a+neuronal+inhibitor+due+to+miRNA+dysregulation+in+a+schizophrenia-related+microdeletion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion.</a> Cell. 152, 262-275 (2013).</li>
<li>Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+biomarkers+for+psychiatric+disorders+with+a+focus+on+autism+spectrum+disorder%3A+Current+progress+in+genetic+association+studies%2C+expression+profiling%2C+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+research+%3A+official+journal+of+the+International+Society+for+Autism+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research.</a> Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).</li>
<li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+integrative+analysis+implicates+microRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li>
<li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+microRNA+expression+in+human+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomics%22%5BJournal%5D)">Altered microRNA expression in human heart disease.</a> Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).</li>
<li>Mann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NF-kappaB-microRNA+regulatory+network+tunes+macrophage+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses.</a> Nature Communications. 8, 851(2017).</li>
<li>O'Connell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+promotes+autoimmune+inflammation+by+enhancing+inflammatory+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development.</a> Immunity. 33, 607-619 (2010).</li>
<li>Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+microRNAs%3A+from+subtype+profiling+to+predictors+of+response+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+component+of+the+p53+tumour+suppressor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A microRNA component of the p53 tumour suppressor network.</a> Nature. 447, 1130-1134 (2007).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+microRNAs+in+animal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.</a> Developmental cell. 11, 441-450 (2006).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-182+Modulates+Myocardial+Hypertrophic+Response+Induced+by+Angiogenesis+in+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart.</a> Science Reports. 6, 21228(2016).</li>
<li>Meerson, F. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+hyperfunction+of+the+heart+and+cardiac+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency.</a> Circulation Research. 10, 250-258 (1962).</li>
<li>Tardiff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+hypertrophy%3A+stressing+out+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cardiac hypertrophy: stressing out the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).</li>
<li>Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+ventricular+remodeling%3A+mechanisms%3A+part+1+of+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2.</a> Circulation. 128, 388-400 (2013).</li>
<li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146-e603 (2017).</li>
<li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nature Methods. 6, 139-141 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

miRNA 사본 검출 감도, 특이성 및 양적 힘에서 변화 하는 다른 기술을 통해 얻을 수 있습니다. 여기, 우리 미르 교 잡 제자리에 immunostaining와의 커플링을 보여 같은 심장 섹션에 미르와 단백질 분자의 식 레벨의 동시 평가 허용 하는 프로토콜을 설명 하 고. 우리는 먼저 파라핀 포함 심장 섹션에 제자리에서 교 잡 파 표시 된 LNA 미르 프로브를 수행 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 cTnT 같은 섹션에 대 한 immunostaining를 수행 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 결과 색상 및 형광 이미지를 병합 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 포 르 말린 고정 (4 ° C, O/N)에 대 한 최적화 되었습니다 / 파라핀 발굴 표시 된 LNA 미르 프로브 및 cTnT 사용 마우스 심장 조직, 임베디드. 추가 최적화를 다른 조직에 필요할 수 있습니다, 조사 또는 항 체 유형, 아래에 설명 된 대로.
RNas...

마이크로 RNAs (miRNAs)는 짧은 (18-25의 뉴클레오티드), 단일 가닥, noncoding RNAs는 메신저 RNA (mRNA) 번역 억제 및 홍보 mRNA 저하 여 post-transcriptional 수준에서 유전자 발현의 부정적인 레 귤 레이 터 기능 1. miRNAs는 introns 또는 코딩의 exons에서 복사할 수 또는 noncoding 유전자와 전조 miRNAs (pre-miRNAs), 70 뉴클레오티드2의 짧은 줄기 루프 구조를 DROSHA에 의해 핵에서 죽 습. 세포질 다음 내보내기, 사전 miRNAs 더 성숙한 miRNAs는 18-25의 뉴클레오티드3,4로 DICER에 의해 처리 됩니다. 그 후, RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC) 통합이 miRNAs 단일 가닥 RNAs로 그들의 식3,5 억제 하는 3' 되지 않은 지역 (3'-UTR) 그들의 표적 mRNAs의 바인딩을 수 있는 .
그들은 처음으로 확인 했다, 이후 지난 3 년간 내 miRNAs가 유전자 발현, 그 자신의 식 레벨은 긴밀 하 게 제어6의 마스터 레 귤 레이 터 등장 했습니다. 장기 개발7,,89,10,11,12, 항상성13,14의 유지 보수에에서 miRNAs에 대 한 역할 설명 되었습니다. , 질병 컨텍스트 신경15,,1617,18,19, 심혈 관20를 포함 하는 자기 면역 조건21 뿐만 아니라 ,22, 암23,24, 등25. MiRNA 식 패턴의 관련성에 대 한 증가 감사 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검출 방법에 대 한 필요성을 게 앞으로 가져왔다. 이러한 방법 등이 실시간 PCR, microarrays, 북부에 게 더 럽 히기, 제자리에서 교 잡, 사실은 미르 성적표는 짧은 구성 주로 감도, 특이성, 및 양적 발전에 따라 고 매우 일치 순서6.
우리는 최근 미르-182 심근 비 대26, 높은 hemodynamic 요구27,28응답에서 심장의 구조적 적응을 설명 하는 조건 개발에 대 한 중요 한 역할을 했다. 심장 비 대 maladaptive 개장29와 관련 된 경우 심장 마비, 회계 모든 죽음의 8.5%에 기인 심장 혈관 상태에 대 한 위험 증가에 지도할 수 있는 심근 질량에 있는 증가 의해 특징입니다. 질병30.
우리가 현장에서 교 잡은 digoxigenin 표시 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브와 결합 마우스 심장 조직 단면도에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining에 우리의 프로토콜을 설명 하는 여기, 우리의 심장 비 대의 모델입니다.

<table><tbody><tr><td>디에틸피로카보네이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>D5758</td><td>DEPC</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4417</td><td>PBS</td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>미국 생물분석</td><td>AB02038</td><td>비이온 계면활성제</td></tr><tr><td>히스토클리어</td><td>내셔널 진단</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K, 재조합, PCR 등급</td><td>시그마 알드리치</td><td>3115879001</td><td>ProK</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>ThermoFisher</td><td>S271</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>ThermoFisher</td><td>M33</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Tris</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>염산 용액, 1 N</td><td>ThermoFisher</td><td>SA48</td><td>HCl</td></tr><tr><td>염산 용액, 12 N</td><td>ThermoFisher</td><td>S25358</td><td>HCl</td></tr><tr><td>1-메틸이미다졸</td><td>시그마 알드리치</td><td>336092</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-디메틸아미노프로필)-N&프라임;-에틸카르보디이미드 염산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>39391</td><td>EDC</td></tr><tr><td>과산화수소 용액 H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>H2O2</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>Sodium Citrate</td></tr><tr><td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td><td>Qiagen</td><td>339450</td><td>scramble miRNA/U6 snRNA</td></tr><tr><td>miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe</td><td>QIagen</td><td>YD00615701</td><td>5'-DIG 및 3'-DIG 표지</td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>NBT/BCIP 정제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11697471001</td><td>NBT-BCIP</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>ThermoFisher</td><td>P217</td><td>KCl</td></tr><tr><td>DAPI 용액(1mg/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>ThermoFisher</td><td>12-545E</td><td>유리 커버 슬립</td></tr><tr><td>플라스틱 커버 슬립</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td><td>RNA-ase 무료 플라스틱 커버 슬립</td></tr><tr><td>안티 디곡시제닌-AP, 팹 단편</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>DIG 항체</td></tr><tr><td>소수성 장벽 펜</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Pap 펜</td></tr><tr><td>안티 심장 트로포닌 T 항체</td><td>Abcam</td><td>ab92546</td><td>cTnT 항체</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG (H+L) 교차 흡수 2차 항체, Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11011</td><td>항토끼-568 항체</td></tr><tr><td>Dako 형광 장착 매체</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>양 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>탈이온화 포름아미드</td><td>미국 바이오분석</td><td>AB00600</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>ThermoFisher</td><td>UVP HB-1000 하이브리드라이저</td><td></td></tr></tbody></table>

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

마이크로 RNAs (miRNAs) 단일 가닥 RNA 사본 메신저 RNAs (mRNAs) 바인딩할 및 그들의 번역을 억제 또는 그들의 저하를 촉진 하는. 날짜 하려면, miRNAs 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검색 방법에 대 한 필요성을 의미 했다 생물학 및 질병 과정의 많은 수에 연루 되었습니다. 여기, 우리 digoxigenin 분류 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브 기반 미르 검색, 마우스 심장 섹션에 단백질 immunostaining와 함께 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 현장에서 교 잡 기술을 미르-182 식 제어 및 심장 비 대 쥐에서 심장 섹션에서을 식별 하는 프로브를 사용 하 여 수행. 다음, 우리는 공동 cardiomyocyte 셀 미르-182 지역화를 동일한 섹션에 심장 분 T (cTnT) 단백질에 대 한 immunostaining를 수행 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 통해 미르-182 기반 색도계 분석 결과, 및 형광 성 얼룩 통해 cTnT 감지할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 모든 miRNA LNA 발굴 표시 된 프로브를 통해 관심의 표현 및 마우스 심장 조직 섹션에 관련 된 단백질 표정 감지 하 사용할 수 있습니다.

miRNA에 제자리 교 잡 출 격 miRNA와 U6-snRNA, 부정과 긍정적인 컨트롤을 각각 역임을 사용 하 여 마우스 심장 섹션에 최적화 되었다. 색상 개발의 부족에 의해 표시 됩니다 부정적인 얼룩 동안 파란색, 표시는 긍정적인 얼룩 (그림 1A-1B). 미르-182의 Cardiomyocyte 특정 식 제어 및 PlGF overexpressing 쥐에서 심장 섹션에서 평가 했다. ΑMHC 발기인 아래 PlGF transgene 들고 쥐 transgene 활성화26의 6 주 이내에 심장 비 대, 보조 증가 신생 개발. 우리 현장에서 교 잡 수행 하 고 컨트롤에 비해 PlGF 쥐의 마음에 있는 미르-182의 증가 식 (그림 2A-2 H</stron...

마이크로 RNAs (miRNAs) 메신저 RNAs (mRNAs)의 post-transcriptional 레 귤 레이 터로 봉사 하는 짧고 높은 동종 RNA 시퀀스입니다. 현재 미르 탐지 방법 감도 특이성에서 변화 한다. 우리는 현장에서 교 잡 및 마우스 심장 조직 섹션에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining를 결합 하는 프로토콜을 설명 합니다.

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

이 방법은 단백질과 microRNA 분자 모두의 상대적 lcalization을 검출하는 도구를 제공함으로써 microRNA 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 조직 섹션에서 단백질과 microRNA 분자를 모두 검출할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 슬라이드 장착 조직의 재수화로 시작됩니다.하이브리드화 오븐에서 슬라이드를 섭씨 60도에서 10분간 데우십시오. 파라핀은 눈에 띄게 녹아야 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 시판 가능한 클리어링 에이전트를 포함하는 유리 코플린 항아리에 슬라이드를 배양.두 번 이 작업을 수행합니다. 다음으로 슬라이드를 세척에서 세척으로 옮겨 조직을 수화합니다. 수분을 공급하면 단백질AE K 작업 용액의 조직을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.단백질제 K를 제거하려면 슬라이드를 1x PBS로 두 번 세척합니다. 지금, 조직을 해결합니다. 첫째, 소수성 펜을 사용하여 슬라이드에 있는 저수지를 만들어 준비 주위에 발수 원을 그립니다.다음으로, 장벽 내에 4%PFA 용액의 500마이크로리터를 적용하고 슬라이드를 연기 후드에 배양합니다. 고정을 제거하려면 실온에서 PBS가 들어있는 코플린 항아리에서 슬라이드를 실온에서 2 회 2 회 2 회 세척하십시오. 다음으로, 0.13 어금니 1-메틸리미다졸레로 슬라이드를 10분간 세척합니다.실온에서 연기 후드에이 작업을 수행하고, 두 번 세척을 수행합니다. EDC 고정을 추가하고 연기 후드의 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 50 밀리머 트리스와 함께 슬라이드를 헹구십시오.혼성화를 준비하기 위해 먼저 가습 챔버를 구축하십시오. 두 개의 필터 또는 티슈 페이퍼를 상자 바닥에 적재하고 포름아미데와 1x SSC의 일대일 혼합물로 종이를 적십니다. 다음으로, 각 슬라이드에 미리 따뜻워진 혼성화 용액 200마이크로리터를 적용하고, 50°C에서 1~3시간 동안 슬라이드의 가습 챔버를 배양한다.인큐베이션 후 하이브리드화 솔루션을 250마이크로리터의 프로브 솔루션으로 교체하고 슬라이드를 RNase 프리 커버 슬립으로 덮습니다. 커버 슬립 아래에 기포가 포획되지 않도록 하십시오. 이제 파라필름으로 챔버를 조심스럽게 밀봉하고 프로브의 RNA 용융 온도 보다 약 섭씨 약 30도에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.최적화가 필요할 수 있습니다. 올바른 인큐베이션 온도를 설정하는 것 외에도 상이한 microRNA가 상이한 수준으로 표현되므로 프로브 농도에 대한 최적화도 최적의 신호를 얻기 위해 필요할 수 있습니다. 혼성화 에 따라 문자열 세차를 수행합니다.첫째, 5 분 동안 섭씨 50도에서 2 x SSC에 있었고, 덮개가 느슨해질 때까지. 그런 다음 실온에서 2x SSC로 2개의 세척을 5분 동안 수행합니다. 그런 다음 실온에서 계속하여 0.2x SSC에서 5분 동안 슬라이드를 세척하고 PBST에서 5분, 마지막으로 1x PBS에서 5분 동안 세척합니다.이 시점에서 RNA-RNA 하이브리드는 안정적이며 RNA-엄격한 조건이 더 이상 필요하지 않습니다. DIG 항체 검출을 위해 먼저 소수성 장벽을 터치하고 30 분 동안 블로킹 용액 500 마이크로 리터를 적용하십시오. 가습 챔버에서 실온에서 슬라이드를 배양합니다.다음으로, 차단 용액을 제거하고 DIG 항체 용액의 500 마이크로리터로 대체하십시오. 1 시간 동안 가습 챔버에서 실온에서 슬라이드를 배양. 그런 다음 코플린 항아리를 사용하여 PBST에서 슬라이드를 세 번 씻고 세척 당 5 분 동안 씻습니다.다음으로 슬라이드를 스테인딩 용액으로 두 번 5분간 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 폴리프로필렌 슬라이드 메일러 jar로 옮기고 AP 기판 용액20 밀리리터를 추가합니다. 이제 슬라이드를 섭씨 37도에서 6~24시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.먼저 AP 기판을 사용하는 경우 반응을 따르는 것이 중요합니다. 2시간 간격으로 최적의 잠복기가 결정될 때까지 현미경을 사용하여 슬라이드의 색상 개발을 확인하십시오. 초과 AP 기판을 제거하려면 KTBT 용액에서 슬라이드를 세척당 5분 동안 두 번 세척한 다음 PBS에서 5분간 세척합니다.cTNT 항체를 검출하기 위해 먼저 조직을 한 시간 동안 차단한다. 그런 다음, cTNT 항체 용액의 200 마이크로리터를 적용하고, 가습 챔버에서 섭씨 4도에서 밤새 슬라이드를 배양한다. 다음 날, 5 분 동안 PBS가 들어있는 코플린 항아리에 슬라이드를 씻으십시오.세 번 이 작업을 수행합니다. 이어서, 250마이크로리터의 항토끼 568 항체 용액을 적용하고, 가습챔버에서 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양한다. 과잉 이차 항체를 씻어 내려면 PBS에서 3 개의 5 분 세척을 사용하십시오.그런 다음 원하는 경우 DAPI 작업 솔루션 250 마이크로리터를 적용하고 슬라이드를 1분 동안 인큐베이션하여 빛으로부터 보호합니다. 과도한 DAPI 얼룩을 제거하려면 5분 PBS 세서히 2개를 사용하고 세동 후 슬라이드를 장착합니다. microRNA 인-시투 혼성화는 음성 제어를 위한 스크램블 마이크로RNA를 사용하여 마우스 심장 단면도에 최적화되었고, U6 snRNA는 양성 대조군으로서 최적화되었다.microRNA-182의 심근 세포 특이적 발현은 대조군 및 PlGF 과잉 발현 마우스로부터 심장 섹션에서 평가되었다. 마우스는 알파-MHC 프로모터의 밑에 PlGF 전염유전자를 운반하고, 심장 비대, 증가한 혈관신생에 이차, 간질 활성화의 6 주 안에 개발했습니다. 염색 프로토콜은 PlGF 마우스의 심혼에 있는 microRNA-182의 증가한 발현을 밝혔습니다.다음으로, 어떤 세포 유형이 microRNA-182를 발현했는지 를 결정하기 위해, 동일한 섹션은 cTNT를 위해 면역염색되었다. DAPI 염색도 사용되었습니다. 대조군과 PlGF 마우스 심장 단면 모두에서, microRNA-182는 cTNT 양성 심근세포 세포의 핵 구획에서 발견되었다.이 비디오를 시청한 후, 당신은 단백질 면역 염색 다음에 microRNAse 혼성화를 수행하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 소품 혼성화로 이어지는 모든 단계 동안 하루 종일 RNAse가없는 조건을 유지하는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라, 실시간 PCR에서 서양 블롯과 같은 다른 방법은 다른 조직에서 이 특정 microRNA의 상대적 발현 수준은 무엇이거나, 또는 동일한 조직 섹션에서 이 특정 단백질과 같은 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있다.PFA 및 ADC와 같은 고정 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행할 때는 장갑과 실험실 코트 착용뿐만 아니라 연기 후드를 사용하는 것이 포함됩니다.

tissue-specific-mirna-expression-profiling-mouse-heart-sections-using

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기, 우리는 효율 높은 처리량을...

높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 Urogenital 트랙트의 mRNA의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

어린 배아 마우스 판막의 단백질 발현 분석은 이용 가능한 조직의 한계로 인해 방해를 받았습니다. 이 원고는 웨스턴 블롯 분석을 위해 발달 중인 배아 마우스 판막 영역에서 단백질을 준비하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

제브라 피쉬의 심장 개발하는 동안 심장 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위해, 총 RNA는 고립 된 마음에서 추출해야합니다. 여기서 우리는 심장 별의 mRNA를 얻기 위해 제브라 피쉬 배아에서 빠른 설명서를 해부하여 기능 / 구타 마음을 수집하기위한 프로토콜을 제시한다.

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

여기에서는 miRNA in situ hybridization을 사용하여 유방암 환자 샘플에서 miRNA 발현을 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

miRNA의를 사용하여 유방암 조직에서의 miRNA 발현의 임상 병리학 적 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

학습하세요 마우스 심장 조직 섹션에서 miRNA와 단백질을 동시에 검출하는 제자리 교잡 방법을. 이 기술은 동일한 조직에서 두 생체분자의 상대적 위치를 시각화하여 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

더 많은 동영상 탐색