Name: 조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 마우스 심장 조직 섹션에서 miRNA와 단백질을 동시에 검출하는 제자리 교잡 방법을. 이 기술은 동일한 조직에서 두 생체분자의 상대적 위치를 시각화하여 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

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우리는 아타 나 시오 스 Papangelis, 원고에 대 한 중요 한 의견에 대 한 감사 하 고 싶습니다. FM은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC;에 의해 지원 BB/M009424/1). IP는 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (17SDG33060002)에 의해 지원 됩니다.

이 연구에 대 한 마우스 심장 조직 샘플 관련 법령 및 기관의 지침에 따라 확인 하 고 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>RNase 무료 ddH2O 준비, 5l ddH2O의 0.1 %diethylpyrocarbonate (DEPC)의 5 mL로 하 여 실 온 (RT)에서 (O/N), 하룻밤. 오토 클레이 브 (121 ° C)에서 DEPC를 비활성화 하려면. 사용 DEPC 처리 ddH2O 준비에 대 한 다운스트림 솔루션으로의 표시. 주의: DEPC는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리.</li>
	<li>DEPC 처리 ddH2O. 압력솥 (121 ° C) 1 리터에 5 PBS 정제를 용 해 하 여 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>1 x PBS의 1 L 당 비 이온 세제의 1 mL를 희석 하 여 0.1% 비 이온 세제/PBS (PBST)를 준비 합니다.</li>
	<li>DEPC 처리 ddH2오 90%, 70%, 50%와 30% 에탄올을 준비</li>
	<li>10 mg/mL DEPC 처리 ddH2오 약 수에에서 성분을 K (ProK)의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 저장 DEPC 처리 ddH2O. 만들어 사용 하기 전에 신선한의 50 ml ProK 재고 솔루션의 100 μ diluting 하 여 ProK의 20 μ g/mL 작업 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>1 x PBS의 50 ml에서 PFA의 2 세대를 추가 하 여 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다. 해산 때까지 가끔 떨고, 65 ° C에서 열. 약 수와-20 ° c.에 게 주의: PFA는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리.</li>
	<li>DdH2O. 압력솥 (121 ° C)의 500 ml 87.8 g를 추가 하 여 3 M NaCl 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>DdH2O. 압력솥 (121 ° C)의 100 ml 20.3 g를 추가 하 여 1 M MgCl2 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>1 M Tris pH 8.0 ddH2O. 조절 pH 8.0의 800 mL에서 녹이는 121.1 g 1 N HCl 몇 방울과 준비, 볼륨 1 L 압력솥 (121 ° C)를가지고. DdH2오의 1 M Tris pH 8.0에서 47.5 ml 2.5 mL를 diluting 하 여 50 mM Tris pH 8.0의 작업 솔루션을 준비</li>
	<li>1 M Tris pH 9.5 ddH2O. 조절 pH 9.5 400 mL에 녹이는 60.6 g 1 N HCl 몇 방울과 준비, 500 mL와 오토 클레이 브 (121 ° C)에 볼륨을가지고.</li>
	<li>3 M NaCl의 1-12 N HCl. 추가 16 mL 약 450 µ L로 DEPC 처리 ddH2O. 조절 pH 8.0의 130 ml Methylimidazole의 1.6 mL diluting 하 여 0.13 M 1 Methylimidazole pH 8.0을 준비 하 고 160 mL에 볼륨을가지고. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다. 주의: 1-Methylimidazole 점 막, 눈과 피부에 유해 하, 증기 두건에서 처리.</li>
	<li>Diluting 176 µ L EDC의 0.13 M 1-Methylimidazole의 10 mL에 의해 0.16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-n ′-ethylcarbodiimide 염 산 염 (EDC)를 준비 합니다. 8.0 사용 하기 전에 12 N HCl. 확인 신선의 약 100 µ L로 pH를 조정 합니다. 주의: EDC는 점 막, 눈, 그리고 피부에 유해한, 증기 두건에서 처리.</li>
	<li>1 x PBS의 50 ml에서 30% H2O2 의 1.5 mL를 희석 하 여 1% H2O2 를 준비 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.</li>
	<li>
준비 20 x SSC pH 7.0 175.3 g의 NaCl 및 나트륨 구 연산 염 (나3C6H5O7) ddH2O. 조정의 800 mL에서의 88.2 g을 용 해 하 여 pH 1의 몇 방울과 7.0 N HCl 1 L 압력솥 (121 ° C)를 볼륨을가지고.
	<ol>
<li>DdH2오 20 x SSC pH 7.0에서 180 mL의 20 mL를 희석 하 여 2 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비</li>
		<li>DdH2오 20 x SSC pH 7.0에서 47.5 ml 2.5 mL를 희석 하 여 1 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비</li>
		<li>DdH2오의 2 x SSC pH 7.0에서 45 mL의 5 mL을 diluting 하 여 0.2 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비</li>
	</ol>
</li>
	<li>DEPC 처리 ddH2O. 만들어 사용 하기 전에 신선한 0.5 mL에 2 x microRNA 분 버퍼의 0.5 mL를 diluting 하 여 교 잡 솔루션 x 1을 준비 합니다.</li>
	<li>DdH2오 약 수의 5 mL을 250 mg을 추가 하 여 Levamisole의 200 m m 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>9 ml PBST, 양 혈 청 1 mL를 희석 하 고 BSA의 0.1 g을 추가 하 여 5 (10% 양 serum/1% BSA/0.2 m m Levamisol) 단계에 대 한 차단 솔루션을 준비 합니다. 사용 하기 전에 10 μ Levamisole의 추가 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.</li>
	<li>PBST의 9 mL 혈 청 염소의 1 mL를 희석 하 고 BSA의 0.1 g을 추가 하 여 단계 6 (10% 염소 serum/1% BSA) 차단 솔루션을 준비 합니다. 4 ° C에서 저장 하 고 1 주일 이내 사용.</li>
	<li>3의 3.3 mL를 diluting 하 여 prestaining 솔루션 준비 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris pH 9.5, 10 mL의 5 mL 100 µ L 트윈 20, ddH2O. 만들어 신선한 81.5 ml에서 Levamisole의 100 µ L의 사용 전에.</li>
	<li>사용 하는 nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly 인산 (BCIP) 정제 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 제조업체의 지침에 따라 기판 솔루션의 20 mL를 준비 하. 20 μ Levamisole의 추가 합니다. 사용 하기 전에 신선한 고 빛 으로부터 보호.</li>
	<li>4 g의 트리, 4.4 g의 NaCl 및 ddH2O. 압력솥 (121 ° C)의 500 mL에 KCl의 375 mg을 추가 하 여 KTBT 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>선택 사항: 1 x PBS의 50 mL에 DAPI 재고 솔루션 (1 mg/mL)의 50 μ diluting 하 여 DAPI 작업 솔루션 (1 μ g/mL)를 준비 합니다. 참고: 표준 솔루션 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris HCl, nuclease 무료 ddH2O, 1 x PBS와 20 x SSC 또는 구매 될 수 있다. 이 프로토콜, 50 mL 유리 Coplin jar 또는 20 mL 폴 리 프로필 렌 슬라이드 우편물에 대 한 단지 사용 되었습니다.</li>
</ol>2. 조직 준비
참고: 여기 사용 마우스 심장 섹션 했다 포 르 말린-고정/파라핀 끼워 넣어진 조직에서 예일 병 리 조직 서비스, 준비, 5 μ m에서 잘라내어 충전된 슬라이드에 위치.
<ol><li>
조직 재입니다.
	<ol>
<li>따뜻한 파라핀 눈 녹는 때까지 교 잡 오븐에서 10 분 동안 60 ° C에서 슬라이드.</li>
		<li>상용 개간 에이전트 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어 ( 재료의 표참조) 10 분, 두 번.</li>
		<li>두 번, 2 분 50% 에탄올과 2 분 30% 에탄올 유리 Coplin jar 2 분, 100% 에탄올의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번, 뒤에 2 분 동안 90% 에탄올, 2 분, 70% 에탄올에에서 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>DEPC 처리 ddH2O 5 분 동안 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>포함 하는 5 분의 1 x PBS의 50 mL 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직 드-proteinating입니다.
	<ol>
<li>슬라이드 20 μ g/mL ProK 작업 솔루션, 교 잡 오븐에 15 분 동안 37 ° C에서 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에서 품 어. 주의: 아래의 소화 될 수 있습니다 가난한 또는 아무 신호 개발 동안-소화 배경 얼룩의 개발과 조직 저하 될 수 있습니다. 최적화는이 단계 (1-20 μ g/mL ProK, 5-20 분 보육, RT-37 ° C)에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>RT에 5 분, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직의 고정입니다.
	<ol>
<li>소수 성 펜을 사용 하 여 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.</li>
		<li>각 슬라이드의 길이를 4 %PFA 솔루션의 500 µ L을 적용 하 고 실시간에 10 분 동안 가로 슬라이드를 품 어</li>
		<li>RT에 5 분, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
		<li>워시 0.13 M 1-10 분, RT에 methylimidazole의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.</li>
		<li>각 슬라이드의 길이에 500 µ L 0.16 M EDC 솔루션의 적용 고 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>실시간에서 50 mM Tris pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어</li>
		<li>린스에 RT, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드. 참고: 두 PFA 및 EDC 고정 단계 미르 가교에 필요한 생략할 수 없습니다. 31
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
내 인 성 과산화 효소 블록입니다.
	<ol>
<li>실시간에서 30 분 동안 1% H2O2 의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어</li>
		<li>린스에 RT, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 교 잡
<ol><li>대상 온도까지 교 잡 솔루션 (슬라이드 당 500 µ L) 교 잡의 오븐에서 50 ° C에서 예 열, (10-15 분)에 도달.</li>
	<li>교 잡 챔버 챔버의 하단에 필터 또는 휴지의 2 개를 놓고 종이 50 %formamide / 1 일로 준비 x SSC. 주의: Formamide은 점 막, 눈과 피부, 증기 두건에서 유일한 핸들에 유해한.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 교 잡 솔루션의 200 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 50 ° C에서 1-3 h에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 250 µ L ofhybridization 솔루션 (최종 농도 50 nM)에서 0.5 µ L 재고 조사 (25 µ M)를 혼합 하 여 프로브 솔루션을 준비 합니다. 참고: 다른 miRNAs 표현 됩니다 서로 다른 수준에서 최적화 프로브 농도 관한이 단계 (1-50 nM), 아무 신호 나 높은 배경 개발을 피하기 위해 필요한 수 있습니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 프로브 솔루션의 250 µ L을 적용 하 고 상단에는 RNase 무료 coverslip 장소. 거품의 형성을 하지 마십시오.</li>
	<li>신중 하 게 교 잡 챔버 parafilm으로 밀봉 하 고 O/N 50 ° c.에서 품 어 참고: 교 잡 온도 각 프로브의 RNA 녹는 온도 (Tm) 약 30 ° C 설정 한다. 최적화 해야 합니다. 여기, 50 ° C 미르-182 교 잡/세척 온도로 사용 되, 그에 따라 조정 다른 프로브에 대 한.</li>
</ol>4. 엄중 세척
<ol><li>2의 200 mL prewarm 대상 온도 (20-40 분)를 도달할 때까지 교 잡 오븐에서 50 ° C에서 x SSC.</li>
	<li>슬라이드 2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 세척 50 ° c 5 분, 또는 coverslips는 느슨하게 때까지 x SSC.</li>
	<li>슬라이드 2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 씻어 5 분, 두 번 RT에서 x SSC.</li>
	<li>0.2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어 RT 5 분에서 x SSC.</li>
	<li>5 분에 대 한 실시간에 PBST의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>5 분에 대 한 RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어. 참고: RNase 무료 조건의 사용은 RNA RNA 하이브리드 안정적인 것으로 간주 됩니다 때문에 더 이상 필요.</li>
</ol>5. 파 항 체 검출
<ol><li>소수 성 펜을 사용 하 여 필요한 경우 다시 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 솔루션 차단의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에서 30 분에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 500 µ L ofblocking 솔루션 항 체 발굴의 0.5 μ diluting 하 여 발굴 항 체 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. 주의: 최적화가이 단계에 대 한 필요할 수 있습니다 (1: 500-1:2, 000).</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 발굴 항 체 솔루션의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 분, RT에 PBST의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>워시 유리 Coplin jar RT 5 분에 대 한 솔루션을 두 번 prestaining의 50 mL를 포함 하는 슬라이드.</li>
	<li>슬라이드 6-24 h, 빛 으로부터 보호에 대 한 37 ° C에 20 mL ofAP 기판 솔루션을 포함 하는 폴 리 프로필 렌 슬라이드 우편물 항아리에 품 어. 주의: 색상 개발 검사 되어야 한다 매 2 h. 최적화가이 단계에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>RT 5 분, KTBT 솔루션 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>5 분에 대 한 RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.</li>
</ol>6입니다. cTnT 항 체 검출
<ol><li>소수 성 펜을 사용 하 여 필요한 경우 다시 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 솔루션 차단의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 200 μ ofblocking 솔루션에서 cTnT 항 체의 2 μ diluting 하 여 cTnT 항 체 솔루션 (1: 100)를 준비 합니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 200 µ L cTnT 항 체 솔루션을 적용 합니다. 슬라이드를 품 어 습도 챔버에 4 ° C에서 가로로 O/N.</li>
	<li>5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 250 μ ofblocking 솔루션 항 체 안티 rabbit 568의 0.5 μ diluting 하 여 안티 rabbit 568 항 체 솔루션 (1: 500)를 준비 합니다.</li>
	<li>각 슬라이드의 길이를 반대로 rabbit 568 항 체 솔루션의 250 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>선택 사항: 각 슬라이드의 길이에 DAPI 작업 솔루션의 250 µ L을 적용 하 고 빛 으로부터 보호 하는 RT에 1 분 동안 가로 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
</ol>7. 장착 및 이미징
<ol><li>장착 매체와 유리 커버 슬립의 2-3 방울과 슬라이드를 탑재 합니다. 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 O/N, 평면, 건조를 슬라이드 수 있습니다.</li>
	<li>Epifluorescent 또는 confocal 현미경 검사 법을 진행 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

miRNA 사본 검출 감도, 특이성 및 양적 힘에서 변화 하는 다른 기술을 통해 얻을 수 있습니다. 여기, 우리 미르 교 잡 제자리에 immunostaining와의 커플링을 보여 같은 심장 섹션에 미르와 단백질 분자의 식 레벨의 동시 평가 허용 하는 프로토콜을 설명 하 고. 우리는 먼저 파라핀 포함 심장 섹션에 제자리에서 교 잡 파 표시 된 LNA 미르 프로브를 수행 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 cTnT 같은 섹션에 대 한 immunostaining를 수행 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 결과 색상 및 형광 이미지를 병합 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 포 르 말린 고정 (4 ° C, O/N)에 대 한 최적화 되었습니다 / 파라핀 발굴 표시 된 LNA 미르 프로브 및 cTnT 사용 마우스 심장 조직, 임베디드. 추가 최적화를 다른 조직에 필요할 수 있습니다, 조사 또는 항 체 유형, 아래에 설명 된 대로.
RNas...

마이크로 RNAs (miRNAs)는 짧은 (18-25의 뉴클레오티드), 단일 가닥, noncoding RNAs는 메신저 RNA (mRNA) 번역 억제 및 홍보 mRNA 저하 여 post-transcriptional 수준에서 유전자 발현의 부정적인 레 귤 레이 터 기능 1. miRNAs는 introns 또는 코딩의 exons에서 복사할 수 또는 noncoding 유전자와 전조 miRNAs (pre-miRNAs), 70 뉴클레오티드2의 짧은 줄기 루프 구조를 DROSHA에 의해 핵에서 죽 습. 세포질 다음 내보내기, 사전 miRNAs 더 성숙한 miRNAs는 18-25의 뉴클레오티드3,4로 DICER에 의해 처리 됩니다. 그 후, RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC) 통합이 miRNAs 단일 가닥 RNAs로 그들의 식3,5 억제 하는 3' 되지 않은 지역 (3'-UTR) 그들의 표적 mRNAs의 바인딩을 수 있는 .
그들은 처음으로 확인 했다, 이후 지난 3 년간 내 miRNAs가 유전자 발현, 그 자신의 식 레벨은 긴밀 하 게 제어6의 마스터 레 귤 레이 터 등장 했습니다. 장기 개발7,,89,10,11,12, 항상성13,14의 유지 보수에에서 miRNAs에 대 한 역할 설명 되었습니다. , 질병 컨텍스트 신경15,,1617,18,19, 심혈 관20를 포함 하는 자기 면역 조건21 뿐만 아니라 ,22, 암23,24, 등25. MiRNA 식 패턴의 관련성에 대 한 증가 감사 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검출 방법에 대 한 필요성을 게 앞으로 가져왔다. 이러한 방법 등이 실시간 PCR, microarrays, 북부에 게 더 럽 히기, 제자리에서 교 잡, 사실은 미르 성적표는 짧은 구성 주로 감도, 특이성, 및 양적 발전에 따라 고 매우 일치 순서6.
우리는 최근 미르-182 심근 비 대26, 높은 hemodynamic 요구27,28응답에서 심장의 구조적 적응을 설명 하는 조건 개발에 대 한 중요 한 역할을 했다. 심장 비 대 maladaptive 개장29와 관련 된 경우 심장 마비, 회계 모든 죽음의 8.5%에 기인 심장 혈관 상태에 대 한 위험 증가에 지도할 수 있는 심근 질량에 있는 증가 의해 특징입니다. 질병30.
우리가 현장에서 교 잡은 digoxigenin 표시 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브와 결합 마우스 심장 조직 단면도에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining에 우리의 프로토콜을 설명 하는 여기, 우리의 심장 비 대의 모델입니다.

<table><tbody><tr><td>디에틸피로카보네이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>D5758</td><td>DEPC</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4417</td><td>PBS</td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>미국 생물분석</td><td>AB02038</td><td>비이온 계면활성제</td></tr><tr><td>히스토클리어</td><td>내셔널 진단</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K, 재조합, PCR 등급</td><td>시그마 알드리치</td><td>3115879001</td><td>ProK</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>ThermoFisher</td><td>S271</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>ThermoFisher</td><td>M33</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Tris</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>염산 용액, 1 N</td><td>ThermoFisher</td><td>SA48</td><td>HCl</td></tr><tr><td>염산 용액, 12 N</td><td>ThermoFisher</td><td>S25358</td><td>HCl</td></tr><tr><td>1-메틸이미다졸</td><td>시그마 알드리치</td><td>336092</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-디메틸아미노프로필)-N&프라임;-에틸카르보디이미드 염산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>39391</td><td>EDC</td></tr><tr><td>과산화수소 용액 H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>H2O2</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>Sodium Citrate</td></tr><tr><td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td><td>Qiagen</td><td>339450</td><td>scramble miRNA/U6 snRNA</td></tr><tr><td>miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe</td><td>QIagen</td><td>YD00615701</td><td>5'-DIG 및 3'-DIG 표지</td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>NBT/BCIP 정제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11697471001</td><td>NBT-BCIP</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>ThermoFisher</td><td>P217</td><td>KCl</td></tr><tr><td>DAPI 용액(1mg/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>ThermoFisher</td><td>12-545E</td><td>유리 커버 슬립</td></tr><tr><td>플라스틱 커버 슬립</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td><td>RNA-ase 무료 플라스틱 커버 슬립</td></tr><tr><td>안티 디곡시제닌-AP, 팹 단편</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>DIG 항체</td></tr><tr><td>소수성 장벽 펜</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Pap 펜</td></tr><tr><td>안티 심장 트로포닌 T 항체</td><td>Abcam</td><td>ab92546</td><td>cTnT 항체</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG (H+L) 교차 흡수 2차 항체, Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11011</td><td>항토끼-568 항체</td></tr><tr><td>Dako 형광 장착 매체</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>양 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>탈이온화 포름아미드</td><td>미국 바이오분석</td><td>AB00600</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>ThermoFisher</td><td>UVP HB-1000 하이브리드라이저</td><td></td></tr></tbody></table>

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

마이크로 RNAs (miRNAs) 단일 가닥 RNA 사본 메신저 RNAs (mRNAs) 바인딩할 및 그들의 번역을 억제 또는 그들의 저하를 촉진 하는. 날짜 하려면, miRNAs 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검색 방법에 대 한 필요성을 의미 했다 생물학 및 질병 과정의 많은 수에 연루 되었습니다. 여기, 우리 digoxigenin 분류 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브 기반 미르 검색, 마우스 심장 섹션에 단백질 immunostaining와 함께 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 현장에서 교 잡 기술을 미르-182 식 제어 및 심장 비 대 쥐에서 심장 섹션에서을 식별 하는 프로브를 사용 하 여 수행. 다음, 우리는 공동 cardiomyocyte 셀 미르-182 지역화를 동일한 섹션에 심장 분 T (cTnT) 단백질에 대 한 immunostaining를 수행 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 통해 미르-182 기반 색도계 분석 결과, 및 형광 성 얼룩 통해 cTnT 감지할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 모든 miRNA LNA 발굴 표시 된 프로브를 통해 관심의 표현 및 마우스 심장 조직 섹션에 관련 된 단백질 표정 감지 하 사용할 수 있습니다.

miRNA에 제자리 교 잡 출 격 miRNA와 U6-snRNA, 부정과 긍정적인 컨트롤을 각각 역임을 사용 하 여 마우스 심장 섹션에 최적화 되었다. 색상 개발의 부족에 의해 표시 됩니다 부정적인 얼룩 동안 파란색, 표시는 긍정적인 얼룩 (그림 1A-1B). 미르-182의 Cardiomyocyte 특정 식 제어 및 PlGF overexpressing 쥐에서 심장 섹션에서 평가 했다. ΑMHC 발기인 아래 PlGF transgene 들고 쥐 transgene 활성화26의 6 주 이내에 심장 비 대, 보조 증가 신생 개발. 우리 현장에서 교 잡 수행 하 고 컨트롤에 비해 PlGF 쥐의 마음에 있는 미르-182의 증가 식 (그림 2A-2 H</stron...

마이크로 RNAs (miRNAs) 메신저 RNAs (mRNAs)의 post-transcriptional 레 귤 레이 터로 봉사 하는 짧고 높은 동종 RNA 시퀀스입니다. 현재 미르 탐지 방법 감도 특이성에서 변화 한다. 우리는 현장에서 교 잡 및 마우스 심장 조직 섹션에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining를 결합 하는 프로토콜을 설명 합니다.

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

이 방법은 단백질과 microRNA 분자 모두의 상대적 lcalization을 검출하는 도구를 제공함으로써 microRNA 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 조직 섹션에서 단백질과 microRNA 분자를 모두 검출할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 슬라이드 장착 조직의 재수화로 시작됩니다.하이브리드화 오븐에서 슬라이드를 섭씨 60도에서 10분간 데우십시오. 파라핀은 눈에 띄게 녹아야 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 시판 가능한 클리어링 에이전트를 포함하는 유리 코플린 항아리에 슬라이드를 배양.두 번 이 작업을 수행합니다. 다음으로 슬라이드를 세척에서 세척으로 옮겨 조직을 수화합니다. 수분을 공급하면 단백질AE K 작업 용액의 조직을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.단백질제 K를 제거하려면 슬라이드를 1x PBS로 두 번 세척합니다. 지금, 조직을 해결합니다. 첫째, 소수성 펜을 사용하여 슬라이드에 있는 저수지를 만들어 준비 주위에 발수 원을 그립니다.다음으로, 장벽 내에 4%PFA 용액의 500마이크로리터를 적용하고 슬라이드를 연기 후드에 배양합니다. 고정을 제거하려면 실온에서 PBS가 들어있는 코플린 항아리에서 슬라이드를 실온에서 2 회 2 회 2 회 세척하십시오. 다음으로, 0.13 어금니 1-메틸리미다졸레로 슬라이드를 10분간 세척합니다.실온에서 연기 후드에이 작업을 수행하고, 두 번 세척을 수행합니다. EDC 고정을 추가하고 연기 후드의 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 50 밀리머 트리스와 함께 슬라이드를 헹구십시오.혼성화를 준비하기 위해 먼저 가습 챔버를 구축하십시오. 두 개의 필터 또는 티슈 페이퍼를 상자 바닥에 적재하고 포름아미데와 1x SSC의 일대일 혼합물로 종이를 적십니다. 다음으로, 각 슬라이드에 미리 따뜻워진 혼성화 용액 200마이크로리터를 적용하고, 50°C에서 1~3시간 동안 슬라이드의 가습 챔버를 배양한다.인큐베이션 후 하이브리드화 솔루션을 250마이크로리터의 프로브 솔루션으로 교체하고 슬라이드를 RNase 프리 커버 슬립으로 덮습니다. 커버 슬립 아래에 기포가 포획되지 않도록 하십시오. 이제 파라필름으로 챔버를 조심스럽게 밀봉하고 프로브의 RNA 용융 온도 보다 약 섭씨 약 30도에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.최적화가 필요할 수 있습니다. 올바른 인큐베이션 온도를 설정하는 것 외에도 상이한 microRNA가

tissue-specific-mirna-expression-profiling-mouse-heart-sections-using

Research

연구

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Genetics

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여기, 우리는 효율 높은 처리량을...

높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 Urogenital 트랙트의 mRNA의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

이 문서는 포르말린 고정 신장 섹션의 마이크로 RNA 발현 colormetric 검출에 최적화의 현장 하이브리드 프로토콜을 설명합니다.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

제브라 피쉬의 심장 개발하는 동안 심장 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위해, 총 RNA는 고립 된 마음에서 추출해야합니다. 여기서 우리는 심장 별의 mRNA를 얻기 위해 제브라 피쉬 배아에서 빠른 설명서를 해부하여 기능 / 구타 마음을 수집하기위한 프로토콜을 제시한다.

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

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여기에서는 miRNA in situ hybridization을 사용하여 유방암 환자 샘플에서 miRNA 발현을 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

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특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.

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Drosophila oogenesis는 미토콘드리아 증식 및 유전 연구에서 매우 유용합니다. 이 원고는 초파리 성인 난소의 복제 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)으로 표지하는 데 사용되는 자세한 프로토콜을 설명하며, 이는 이전에 논쟁의 여지가 있었던 미토콘드리아 유전과 관련된 메커니즘을 밝히는 데 도움이 됩니다.

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조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

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