Name: 향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 배우세요 LIF-3i 화학적 방법으로 기존 인간 다능성 줄기세포를 순진한 상태로 되돌리는 기술입니다. 이 프로토콜은 계통 프라이밍 유전자 발현을 감소시키고 분화 효율성을 향상시켜 재생의학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH/네이 (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB 스타인 혁신 상 수상는 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk 과학 포럼 상와 모 슬 리 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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<li>Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Human+Naive+Pluripotency+in+the+Embryo+and+in+the+Dish%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish.</a> Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).</li>
<li>Zimmerlin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+inhibition+promotes+a+stable+human+naive+pluripotent+state+with+improved+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality.</a> Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
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<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).</li>
<li>Collier, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Cell+Surface+Protein+Profiling+Identifies+Specific+Markers+of+Human+Naive+and+Primed+Pluripotent+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).</li>
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<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Pluripotent+Stem+Cells+with+In+Vivo+Embryonic+and+Extraembryonic+Potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency.</a> Cell. 169 (2), 243-257 (2017).</li>
<li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li>
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<li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+progenitors+from+cord+blood-derived+induced+pluripotent+stem+cells+possess+augmented+capacity+for+regenerating+ischemic+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature.</a> Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).</li>
<li>Taapken, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karotypic+abnormalities+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).</li>
<li>Mitalipova, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+copy+number+of+pluripotency+and+cell+proliferation+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+during+reprogramming+and+time+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).</li>
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</ol>

생활 기술 및 존스 홉킨스 대학 (JHU) 사이의 라이선스 계약에 따라 닥터 Zambidis 줄기 세포의 라이센스에 대 한 대학에서 받은 특허권 사용료의 몫을 받을 권리가 있다. 이 계약의 약관 JHU 상충 정책에 따라 관리 합니다. 이 저자의 준수 데이터 및 자료 공유에 저널 정책 변경 하지 않습니다.

LIF 3i 시스템 인간의 pluripotent 줄기 세포 클래식 murine 2i 순진한 귀선 칵테일1 의 수정된 된 버전을 적용합니다. (이 혼자 2에서 확장할 수 없습니다) hPSC의 자기 갱신 tankyrase 억제제 XAV939 함께이 칵테일을 보완 하 여 LIF-2에서 안정 이다. LIF 3i 문화 대량 인간의 preimplantation epiblast3닮은 만능 상태로 기존의 hPSC의 효율적인 복구를 수 있습니다. HPSC에서 XAV939의 행동의 메커니즘은 복잡 한 가능성이 있지만 시너지 2i와 함께, 그들은 가능성이 포함 최소, 중요 한 안정화 및 WNT 경로3신호를 통해 hPSC 자기 갱신의 확대.
기존의 hPSC 문화는 일반적으로 높은 변수...

2i (MEK/ERK 및 GSK3β 억제제) 문화 시스템 유형이 다른 혈 청 기반 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 문화 마우스 preimplantation epiblast1유사 pluripotency의 균일 한 접지 상태를 수정 하기 위해 원래 개발 되었다. 그러나, 2i는 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 라인2의 안정적인 유지 보수를 지원 하지 않습니다. 다양 한 성장 인자를 보충 하는 복잡 한 작은 분자와 유전자 변형 방법 최근 상 캡처 보고 된 유사한 인간의 순 같은 만능 분자 상태2. 그러나, 또한 이러한 메서드를 사용 하 여 만든 "순진한 같은" 상태 karyotypic 불안정성, epigenomic 결함 (예: 글로벌의 손실 부모의 게놈 각 인), 전시 또는 차별화 잠재적 장애인.
에 대비, GSK3β, ERK 및 tankyrase 신호 트리플 화학 억제의 칵테일 및 백혈병 금지 요인 (LIF-3i) 기존의 hPSC 라인3의 광범위 한 레 퍼 토리의 안정 순-같은 버전에 대 한 충분 한 했다. LIF 3i 되돌릴 순 hPSC (N hPSC) 정상적인 karyotypes를 유지 하 고 순진한 특정 인간의 preimplantation epiblast 유전자의 그들의 식을 증가 (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, 스텔라 (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). Phosphorylated STAT3 신호 증가, 포함 mESC 같은 순진한 pluripotency에 고유한 분자와 생 화 확 적인 특성의 배열과 LIF 3i 버전도 수 여 hPSC 감소 ERK 인 산화, 글로벌 5-methylcytosine 포장 소비재 hypomethylation, 배아 줄기 세포 (ESC)에서 게놈 넓은 포장 소비재 demethylation-특정 유전자 발기인, 및 지배적인 원심 OCT4 증강 사용. 또한, 다른 순진한 비해 귀착되 었 다 aberrantly hypomethylated 복귀 방법 각 게놈 loci, LIF 3i 돌 N-hPSC 찍힌된 CpG 패턴의 체계적인 손실 또는 DNA methyltransferase 식의 손실 없는 (예: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
기존의 인간 배아 줄기 세포 (hESC)와 지류 또는 E8 급지대 무료 조건에서 자란 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 광범위 한 배열의 직접 LIF 3i 문화 순진한 epiblast 같은 상태로 신속 하 고 대량 귀선 달성. 그러나, 직접 LIF 3i 순진한 귀선 일부 불안정 한 기존의 hPSC 라인 고유의 게놈 및 혈통 액 variabilities 유전자 다양 한 기증자 배경에서 발생 하는 때문에 효율적인 하지 수 있습니다.
따라서, LIF 3i 메서드의 유틸리티를 확대, stepwise 최적화 개발 되었다 고 여기 제시 수 있는 거의 모든 기존의 hESC 또는 transgene 무료 hiPSC 선 보편적인 순진한 귀선 교양 모이 통에. 이 단신 순진한 귀선 메서드 사용 하 여 두 추가 작은 분자 (LIF-5i) 단백질 키 니 아 제 (산림)와 소닉 더 헤지호그 (sHH) (약효와 LIF 3i 칵테일을 보완 하는 기존의 hPSC에서 일시적인 초기 문화 단계 purmorphamine) 신호입니다. LIF 5i에 기존의 hPSC의 한 초기 통과 이후 안정적인 LIF 3i 버전 대량 수량에서을 그들을 적응 시킨다. 초기 LIF 5i 적응은 크게 E8 또는 지류 (LIF-3i 혼자에서 후속 안정적, 지속적인 통로) 이전에 성장 하는 기존의 hPSC의 초기 단일 세포 클론 증식을 증대 시킵니다. 기존의 hPSC 라인 적응 먼저 LIF 5i에 하나의 통로를 용납 이후 대량 클론 뿌리고 LIF 3i 조건에서 순진한 되돌릴 셀의 따기 및 subcloning 드문 안정적인 식민지, 또는 일상적인 사용의 필요성을 obviates는 안티-apoptotic 분자 또는 단백질으로 관련 된 키 (바위) 억제제.
LIF 3i 메서드는 성공적으로 안정적으로 확장 하 고의 광범위 한 레 퍼 토리를 유지 고용 되었습니다 > 30 독립, 유전으로 다양 한 기존의 hPSC 라인 > 10-30 구절 중 비 효소 또는 효소 분리 방법을 사용 하 여 고 염색체의 유도의 증거 없이 또는 epigenomic 이상, 찍힌된 유전자 loci에서 이상 포함 한. 또한, 순차 LIF-5i/LIF-3i 문화 유일한 순진한 복귀 방법입니다 지금까지 보고 그들의 혈통 액 유전자 발현을 감소 하 여 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리의 기능 pluripotency를 개선 하 고 극적으로 개선 하는 그들의 multipotent 차별화 힘. 고유의 LIF 3i 순진한 복귀 방법 지웁니다 환승 혈통 액, 기존의 hPSC 라인의 차별화의 다양성 그리고 재생 의학 및 세포 치료에 응용 프로그램의 좋은 유틸리티.

<table><tbody><tr><td>anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>561716</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti- TFCP2L1 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA029708</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-beta-Actin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6276</td><td>use at 1:5000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-CD146 antibody,&nbsp; PE conjugated&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>550315</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 antibody, APC conjugated</td><td>eBioscience</td><td>17-0319-42</td><td>use 2&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 microbead kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>anti-NANOG antibody</td><td>Abcam</td><td>ab109250</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-NR5A2 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA005455</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4695</td><td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td></tr><tr><td>anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>use at 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9145</td><td>use at 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated</td><td>Agilent</td><td>E0432</td><td>use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>FAB1435A</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC1435G</td><td>use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-STAT3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9139</td><td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td></tr><tr><td>anti-STELLA/DPPA3 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4388</td><td>use at a 1:50 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC4770R</td><td>use at&nbsp; a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0068</td><td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0069</td><td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560193</td><td>use 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560161</td><td>use 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>APEL2-Li</td><td>StemCell Technologies</td><td>5271</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere dilution buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>7183</td><td>dilutent for Vitronectin XF&trade; matrix</td></tr><tr><td>CF1 mouse</td><td>Charles river</td><td>023</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R&amp;D System</td><td>L5283</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>confocal microscope system</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>cord blood CD34+ derived iPSC line</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>also referred as 6.2 line</td></tr><tr><td>Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Countess&nbsp; cell counting chamber slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 (E8) medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Stemgent</td><td>04-0025</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Gelatin (porcine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>resuspend in water and sterilize with an autoclave</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene cryogenic vials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Fisher Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Stemgent</td><td>04-0009</td><td>reconstitute at 10mM in DMSO</td></tr><tr><td>recombinant human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>AF-120-14E</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4</td><td>Peprotech</td><td>120-05ET</td><td>resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS</td></tr><tr><td>recombinant human FGF-basic (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>1

향상 된 multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

순진한 인간 만능 줄기 세포 (N hPSC) 향상 된 기능 재생 의학에 다양 한 영향을 있을 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 효율적으로 준비 하는 혈통, 기존의 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 향상 된 기능을 가진 순진한 같은 pluripotency에 피더 무료 또는 급지대 종속 상태에 유지 되돌릴 것입니다. 이 화학 순진한 귀선 메서드 GSK3β, 고전 백혈병 금지 요인 (LIF), 고용 및 MEK/ERK 저해 칵테일 (LIF-2i)는 tankyrase 억제제 XAV939만 보충 (LIF-3i). LIF 3i 안정적인 만능 주 생화학, transcriptional, 채택 및 인간의 사전 주입 epiblast의 후 성적인 기능에 기존의 hPSC 되돌립니다. 이 LIF 3i 메서드가 필요 최소한의 셀 문화 조작 하며 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 transgene 무료 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에서 높은 재현성. LIF 3i 방법 차별화; 전에 다시 프라이 밍 단계를 필요 하지 않습니다. N hPSC 매우 높은 효율성과 직접 분화 될 수 있다 하 고 유지 하는 karyotypic 및 epigenomic 안정성 (찍힌된 loci에 포함). 방법의 보편성을 높이기 위해 기존의 hPSC 처음 두 개의 추가 작은 분자 단백질 키 니 아 제 (산림) 및 소닉 고슴도치 (쉿) (purmorphamine) 신호 (LIF-5i) 약효와 보충 LIF 3i 칵테일에 교양. 이 간단한 LIF 5i 적응 단계 크게 기존의 hPSC의 초기 클론 확장을 강화 하 고 그들 이후에 순진한 LIF-3i 혼자 대량 수량에 따라서 따기/subcloning 드문 N-hPSC에 대 한 필요성을 obviating와 복귀 허용 나중에 식민지입니다. LIF 5i 안정화 hPSCs 그 후에 유지 됩니다 LIF 3i 안티 apoptotic 분자의 필요 없이 혼자. 가장 중요 한 것은, LIF 3i 귀선 현저 하 게 그들의 혈통 액 유전자 발현을 감소 하 고 감독된 차별화의 인터 라인 변화를 일반적으로 지우기에 의해 기존의 hPSC의 광범위 한 레 퍼 토리의 기능 pluripotency를 향상 독립 hPSC 라인 사이 관찰. LIF 3i 돌 N-hPSC의 대표 characterizations 혈통 액 대isogenic hPSC의 기능 비교에 대 한 제공, 그리고 실험적인 전략 있습니다. 순진한 같은 상태 설명 되어 있습니다.

이 프로토콜 두 지류 종속 및 급지대 독립적인 계보 됐다는 기존의 hPSC 문화 (그림 1)에서 LIF 3i와 효율적인 순진한 같은 버전을 최적화합니다. 자세한 프로토콜 설명 여기, LIF-3i 어느 급지대 또는 급지대 무료 기존의 hPSC 조건 (예: E8 매체)에서 시작에 개요 순차적 적응.
여러 기존 hESC LIF 3i 버전에 대 한 결과 대표 하 고 transgene 무료 hiPSC 라인 그림 1-3에 표시 됩니다. 이러한 일반적인 결과 상용 hESC 라인 H9, 유효성을 검사할 수 또는 상업적으로 사용할 수와 함께 혈액 파생 episomal hiPSC 라인 (6.2) Zambidis 실험실8<sup...

선물이 epigenomically 안정 순 preimplantation epiblast 같은 만능 상태로, 대량, 효율적이 고 신속한 화학 귀선 기존의 혈통 액 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 대 한 프로토콜. 이 방법은 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에 걸쳐 감소 혈통 액 유전자 발현과 감독된 multilineage 차별화에 표시 되어 있는 개선에 발생합니다.

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

LIF-3i 방법은 일반적인 인간 다능 줄기 세포를 인간 착상 전 상피의 생화학적, 전사적 및 후성 유전적 특징을 지닌 더 원시적인 다능 상태로 되돌립니다. 이 방법은 일반적인 인간 다능 줄기 세포의 기능성을 개선하여 계통 프라이밍된 유전자 발현을 감소시키고 독립적인 hPSC 라인에서 일반적으로 관찰되는 지향된 분화의 간계통 변이성을 제거합니다. 이 방법을 사용하면 화학적으로 되돌려진 인간 다능 줄기 세포가 확장된 패시지 후에도 카리오타입 및 후성 유전체 안정성을 유지하고 각인된 위치에서도 유지할 수 있으며, 재프라이밍 단계를 필요로 하지 않고 개선된 효율성으로 직접 분화될 수 있습니다.LIF-3i 방법은 인간 발달 생물학의 초기 연구에 새로운 방향을 열고, 인간 다능 줄기 세포 분화, 유전자 타겟팅 및 종간 키메라 생성을 개선함으로써 재생 의학을 발전시킬 수 있습니다. 프로토콜을 시작하려면 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 기반 피더 배양 시스템 또는 피더 프리 배양 시스템과 공동 배양하여 정상적인 카리오타입을 갖는 검증된 일반적인 인간 다능 줄기 세포 또는 hPSC를 유지 및 확장합니다. 기존의 젤라틴화된 6웰 플레이트에 MEF 피더를 준비하여 LIF-5i에 적응된 일반적인 hPSC 배양을 패시지하기 하루 전까지 준비합니다.일반적인 hPSC 배양이 약 50% 접종률에 도달하면, 표준 hESC 배양 배지를 각 웰당 2밀리리터의 백혈병 억제 인자 5i 또는 LIF-5i 배지로 교체합니다. LIF-5i 배지에서 일반적인 hPSC 및 MEF를 최대 2일 동안 CO2 인큐베이터에서 배양 및 유지합니다. 후속 패시지 및 LIF-3i에서의 안정한 되돌림에 적응시키기 위해 LIF-5i 배지를 매일 교체합니다.피더 프리 일반적인 배양의 경우, 다음날 아침에 패시지하기 전에 오버나이트 동안 LIF-5i에서만 hPSC를 배양합니다. 패시지하기 전에, LIF-5i에 적응된 일반적인 hPSC를 PBS로 한 번 세척한 후 각 웰에 1밀리리터의 세포 분리 시약을 추가합니다. 그런 다음, CO2 인큐베이터에서 37도 섭씨에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다.배양 후, 파이펫으로 세포를 부드럽게 분리하여 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. 무균 15밀리리터 원추형 튜브에 hESC 배지를 최소 2배 희석하여 세포 현탁액을 수집하고, 파이펫으로 부드럽게 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 300 g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.원심

chemical-reversion-conventional-human-pluripotent-stem-cells-to-nave

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

우리는 발달 생물학의 지식과 발표된 연구를 바탕으로 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 A9 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜을 개발했으며, 이는 파킨슨병에 대한 질병 모델링 및 세포 대체 요법에 유용할 것입니다.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)에서 분화 된 세포 유형을 생성하는 것은 훌륭한 치료 약속을 보유하고 있지만 여전히 도전적입니다. PSC는 종종 적절한 신호 세트로 자극된 경우에도 차별화할 수 없는 고유한 무능력을 나타냅니다. 여기에 설명된 간단한 도구는 다양한 PSC 라인에서 다중 라인 차별화를 향상시키는 간단한 도구입니다.

분화를 촉진하기 위해 DMSO를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포의 일시적인 치료

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

배우세요 LIF-3i 화학적 방법으로 기존 인간 다능성 줄기세포를 순진한 상태로 되돌리는 기술입니다. 이 프로토콜은 계통 프라이밍 유전자 발현을 감소시키고 분화 효율성을 향상시켜 재생의학 연구에 활용됩니다.

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

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