향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선
2018년 6월 10일
선물이 epigenomically 안정 순 preimplantation epiblast 같은 만능 상태로, 대량, 효율적이 고 신속한 화학 귀선 기존의 혈통 액 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 대 한 프로토콜. 이 방법은 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에 걸쳐 감소 혈통 액 유전자 발현과 감독된 multilineage 차별화에 표시 되어 있는 개선에 발생합니다.
LIF-3i 방법은 일반적인 인간 다능 줄기 세포를 인간 착상 전 상피의 생화학적, 전사적 및 후성 유전적 특징을 지닌 더 원시적인 다능 상태로 되돌립니다. 이 방법은 일반적인 인간 다능 줄기 세포의 기능성을 개선하여 계통 프라이밍된 유전자 발현을 감소시키고 독립적인 hPSC 라인에서 일반적으로 관찰되는 지향된 분화의 간계통 변이성을 제거합니다. 이 방법을 사용하면 화학적으로 되돌려진 인간 다능 줄기 세포가 확장된 패시지 후에도 카리오타입 및 후성 유전체 안정성을 유지하고 각인된 위치에서도 유지할 수 있으며, 재프라이밍 단계를 필요로 하지 않고 개선된 효율성으로 직접 분화될 수 있습니다.
LIF-3i 방법은 인간 발달 생물학의 초기 연구에 새로운 방향을 열고, 인간 다능 줄기 세포 분화, 유전자 타겟팅 및 종간 키메라 생성을 개선함으로써 재생 의학을 발전시킬 수 있습니다. 프로토콜을 시작하려면 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 기반 피더 배양 시스템 또는 피더 프리 배양 시스템과 공동 배양하여 정상적인 카리오타입을 갖는 검증된 일반적인 인간 다능 줄기 세포 또는 hPSC를 유지 및 확장합니다. 기존의 젤라틴화된 6웰 플레이트에 MEF 피더를 준비하여 LIF-5i에 적응된 일반적인 hPSC 배양을 패시지하기 하루 전까지 준비합니다.
일반적인 hPSC 배양이 약 50% 접종률에 도달하면, 표준 hESC 배양 배지를 각 웰당 2밀리리터의 백혈병 억제 인자 5i 또는 LIF-5i 배지로 교체합니다. LIF-5i 배지에서 일반적인 hPSC 및 MEF를 최대 2일 동안 CO2 인큐베이터에서 배양 및 유지합니다. 후속 패시지 및 LIF-3i에서의 안정한 되돌림에 적응시키기 위해 LIF-5i 배지를 매일 교체합니다.
피더 프리 일반적인 배양의 경우, 다음날 아침에 패시지하기 전에 오버나이트 동안 LIF-5i에서만 hPSC를 배양합니다. 패시지하기 전에, LIF-5i에 적응된 일반적인 hPSC를 PBS로 한 번 세척한 후 각 웰에 1밀리리터의 세포 분리 시약을 추가합니다. 그런 다음, CO2 인큐베이터에서 37도 섭씨에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다.
배양 후, 파이펫으로 세포를 부드럽게 분리하여 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. 무균 15밀리리터 원추형 튜브에 hESC 배지를 최소 2배 희석하여 세포 현탁액을 수집하고, 파이펫으로 부드럽게 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 300 g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
원심분리 후, 상층액을 흡입하여 폐기하고, 세포 펠렛을 1~2밀리리터의 LIF-5i 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음, 세포를 계산합니다. PBS로 미리 준비된 6웰 MEF 플레이트를 두 번 세척합니다.
PBS 세척된 MEF 플레이트의 한 웰에 2밀리리터의 LIF-5i 배지에 1~2배 10의 6승 세포를 분배합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 넣습니다. 다음날, 부착되지 않은 세포를 들어 올리고 배지를 흡입하여 2밀리리터의 LIF-5i 배지로 대체합니다.
세포가 60~70% 접종률에 도달하거나 3~5일 동안 이 단계를 반복합니다. 이 프로토콜은 인간 배아 및 유도 다능 줄기 세포 라인의 넓은 범위의 나이브 같은 빠르고 대량 되돌림을 지원합니다. 표준화된 분화 또는 비정상적인 카리오타입을 가진 인간 다능 줄기 세포 배양이 신중하게 제외되어야 합니다. 초기 LIF-5i 적응 후, 안정적인 LIF-3i 배양을 매 3~4일마다 바이오 안전 캐비닛에서 또는 배양이 60~70% 접종률에 도달할 때 패시지합니다.
배양 배지를 폐기하고 각 LIF-5i-LIF-3i 배양의 웰을 부드럽게 2밀리리터의
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개요
LIF-3i 방법은 일반적인 인간 다능성 줄기세포(hPSCs)를 나이브(naïve) 상태의 착상 전 배아상피세포 유사 상태로 효율적으로 되돌립니다. 이 프로토콜은 분화 능력을 향상시키고 계통 프라이밍된 유전자 발현을 감소시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 줄기세포 생물학
- 재생 의학
- 발생 생물학
배경
- 기존의 hPSC는 분화 과정에서 변동성을 보입니다.
- 나이브 다능성 상태는 초기 발달 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다.
- 재생 의료 응용을 위해 개선된 분화 방법이 필요합니다.
- LIF-3i 방법이 이러한 과제들을 해결합니다.
연구 목적
- hPSC를 나이브 상태로 되돌리는 프로토콜을 개발한다.
- 지향성 분화의 효율성을 높인다.
- hPSC 라인 간의 변동성을 줄인다.
사용된 방법
- 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)와의 공동 배양.
- 피더 프리 배양 시스템.
- MEF 피더용 젤라틴 처리 6-웰 플레이트 준비.
- 안정성 평가를 위한 환원된 hPSC의 장기 계대 배양.
주요 결과
- hPSC를 안정적인 naïve 상태로 성공적으로 되돌림.
- 계통 프라이밍(lineage-primed) 유전자 발현의 감소 관찰.
- 재프라이밍(re-priming) 없이 개선된 분화 효율.
- 핵형 및 에피게놈 안정성 유지.
결론
- LIF-3i 방법은 인간 발달 생물학의 새로운 가능성을 열어줍니다.
- 이는 재생 의학 응용 분야를 발전시킬 수 있습니다.
- 본 프로토콜은 유전자 타겟팅 및 키메라 연구를 촉진할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 프로토콜은 기존의 인간 다능성 줄기세포를 나이브 유사 상태(naive-like state)로 대량 되돌림으로써, 분화 결과의 세포주 간 변동성을 줄이고 기능적 다능성을 향상시킵니다. 재프라이밍(re-priming) 없이 분화 효율을 높임으로써 보다 예측 가능한 전임상 모델링을 지원하며, 재생 의학 파이프라인의 타겟 검증 리스크를 낮춥니다. 다양한 hESC 및 트랜스진 프리(transgene-free) hiPSC 세포주 전반에 걸친 본 방법의 재현성은 초기 발견 및 중개 연구를 위한 확장 가능하고 표준화된 워크플로우를 용이하게 합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 후성유전적 노이즈가 감소된 발달 초기 상태로 계통이 프라이밍된 hPSC를 리셋함으로써 치료 가설을 검증합니다.
- 운용적 가치: 나이브 유사 상태와 프라이밍 상태 간의 동종 비교를 통한 기능적 타겟 검증을 가능하게 하여 작용 기전을 명확히 합니다.
- 예측적 가치: 리드 물질 식별을 방해하는 세포주 간 변동성을 최소화하여 분화 분석의 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 어세이 개발
- 분석 준비도: 일관된 세포 반응이 필요한 고처리량 스크리닝 플랫폼에 적합하며, 핵형이 정상이고 안정적인 naive-like hPSC를 생성합니다.
- 정량적 결과: 배엽 전반에 걸쳐 측정 가능한 분화 효율을 지원하여, 강력한 용량-반응 및 표현형 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 확장성: 클론 선택 없이 대량 회귀를 허용하여, 대규모 분석 준비 및 시약 스크리닝 캠페인을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 초기 발달 장애 모델링을 위해 발달 단계적으로 정확한 인간 착상 전 에피블라스트 유사 시스템을 제공합니다.
- 중개 연구의 연속성: 각인 유전자좌의 에피게놈 안정성을 유지하여, 생체 내 분화 및 기형종 형성으로의 신뢰할 수 있는 외삽을 지원합니다.
- 기전적 위험 감소: 지향성 분화의 세포주 간 변이를 제거하여, 전임상 효능 연구에서의 위음성 및 위양성을 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
LIF-5i에서 LIF-3i로 이어지는 순차적 방법은 분화 분석, 리드 물질 식별 및 전임상 검증 단계 이전에 표준화된 나이브 상태 생성을 가능하게 함으로써 발굴 워크플로우에 통합됩니다.
- 발견 생물학: naive-like 상태와 primed 상태의 hPSC를 isogenic하게 비교함으로써 가설 검증을 지원하며, 이를 통해 표적 메커니즘과 경로 의존성을 명확히 합니다.
- 스크리닝: 재현 가능하고 분화 능력이 있는 세포 집단을 제공하여, 웰 간 변동성을 줄인 어세이 표준화 및 화합물 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 분석: 3배엽 분화 효율의 정량적 판독과 조건 간 비교를 위한 유전자 발현 정규화를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 장기간의 계대 배양 동안 에피게놈 및 핵형 안정성을 유지하여, 종단적 전임상 연구와 바이오마커 일치화를 지원합니다.
- 기업 내 재사용: 여러 프로젝트와 세포주에 걸쳐 naive-like hPSC를 생성할 수 있는 가역적이고 플랫폼 독립적인 방법을 구축하여, 중복되는 최적화 과정을 줄여줍니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 계통 프라이밍 신호의 감소와 다능성 안정성 향상을 통한 분화 결과의 예측 신뢰도 확보.
- 운영적 가치: 조작을 최소화하고 실험실 간 재현성이 높은, 피더 세포 포함 또는 피더 프리 방식의 표준화된 프로토콜 제공.
- 전략적 가치: 분화 분석의 생물학적 노이즈를 최소화하여 후기 단계의 탈락 리스크를 줄임으로써, 고/노고(go/no-go) 결정 최적화.
- 포트폴리오 영향: 유전적 배경의 변동성보다는 기능적 리셋 능력에 기반하여 세포주의 리스크 조정 우선순위 설정 가능.
실행 시 고려 사항
- 계대 배양, 해리 및 다능성 마커 검증을 포함한 줄기세포 배양에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- MEF 공동 배양 또는 피더 프리(feeder-free) 적응을 위해 CO2 인큐베이터, 생물안전 작업대 및 표준 세포 배양 장비가 필요합니다.
- LIF-3i의 경우 LIF, GSK3β 및 MEK/ERK 억제제, tankyrase 억제제 XAV939를 포함한 표준화된 배지 조성이 필요하며, LIF-5i 적응을 위해서는 선택적으로 forskolin과 purmorphamine이 필요합니다.
- 성공적인 되돌림(reversion)을 보장하기 위해 시작 hPSC 라인의 정상 핵형 및 낮은 자발적 분화율에 대한 검증이 필요합니다.
- 모델 시스템 간의 적응 시, 클론 확장을 위해 초기 도말 밀도와 LIF-5i 노출 기간의 최적화가 필요할 수 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
1:14
Bulk Stabilization of Conventional hPSC Cultures for Subsequent Naïve Reversion with a Brief LIF-5i Adaptation
4:38
Long-term Maintenance and Expansion of N-hPSC in LIF-3i Medium
7:14
Results: Effective Reversion of Human Pluripotent Stem Cells
7:47
Conclusion
