Name: 절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 배우세요 다년생 잔디의 절연, 토양, 뿌리권 미생물 커뮤니티 분석 방법을. DNA 추출 및 현장 실험을 위한 표준화된 프로토콜을 통해 토양 미생물군집 연구의 재현성을 높입니다.

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이 원고를의 개발은 국립 과학 재단 EPSCoR 센터 루트 및 Rhizobiome 혁신 상을 OIA-1557417에 지원 됩니다. 데이터 수집 네브래스카 링컨의 대학, 농업 연구 및 개발에서 자금 및 농 무부에서 해치 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 또한 미국 농 무부-ARS에서 지원 인정 하 고 지원 설정 및 이러한 필드를 관리 하는 미국 농 무부 식품 및 농업에서 농업과 음식 연구 사업 경쟁 보조금 번호 2011-68005-30411에 의해 제공 되었다.

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저자는 공개 없다.

이 원고에 설명 된 방법을 쉽게 토양과 식물 metagenomics의 필드를 입력 하는 과학자를 사용 해야 합니다. 년 동안, 우리는이 원고에서 설명 하는 실험을 실시 이후 우리의 방법을 세련는. 한 변화는 우리가 지금 미리 라벨 튜브 샘플 필드에 외출 하기 전에. 우리의 실험실 바코드 시스템 및 라벨 프린터를 사용합니다. 라벨 프린터는 뿐만 아니라 시간 때 라벨 튜브, 뿐만 아니라 모든 것을 쉽게 추적 하 고 올바르게 식별 인간의 손 쓰기의 vagaries 없이 샘플을 저장 합니다. 또 다른 중요 한 요점은 우리는 다시 가능한 한 빨리 필드에서 그것를 데 려 후 자료를 처리 하려고입니다. 우리는 DNA 분석에 사용 되는 토양 동결, 소독, 뿌리를 고정 필터링 그리고는 rhizosphere 필드에서 반환 된 후 12 ~ 36 시간 이내 동결 하고자 합니다. DNA 추출 절차는 토양을 rhizosphere, 특히 많은 단계로 긴 그래서 우리 DNA 추출 프로토콜에 대 한 시간에 손을 최소화, 도입 될 수 있습니다, 인간의 오류를 감소 하는 로봇 (Kingfisher 플렉스, ThermoFisher) 구입 다른 방법에 일관성을 향상 하 고 토양, 뿌리, 또는 rhizosphere의 일괄 처리 됩니다. 공장 설비 재료를 작업할 때 그것은 공부 또는 "견본"를 루트 종류의 다양 한 루트 형식을 결정 하는 것이 중요. 유지 뿌리 그리고 때 DNA 추출 수행 하는 것이 중요, 96-잘 DNA 추출 접시를 채울 때 샘플 사이의 교차 오염 없이 보장은 냉동된 상태에서 떠난다. 고려해 야 할 또 다른 중요 한 요소는 필드 실험을 디자인 하 고 완전 한를 사용 하 여 무작위로 디자인 가능한 때 사용할 복제의 번호26. 높은 분야 다양성 때문에 그것은 작은 차이 감지 하는 복제의 다 수 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 경험에서 뿌리를 발굴 하는 때 토양은 너무 젖은 하지 있는지 확인이 필수적입니다. 토양 물으로 포화 되는 경우 그것은 작업할 더러운 하지만 그것은 또한 매우 어려운는 rhizosphere를 정의 하 고 뿌리에서 토양을 제거 하.
초기에 이러한 방법을 개발 하는 동안 만들어진 하나의 수정 했다 대신 우리 분야에 더 많은 작업을 쉽게 하기 위해 가스 발전기에 의해 구동 vortexers 업그레이드 rhizosphere 출시를 손으로 튜브를 떨고 표준화의 관점에서 시간과 방식으로 각 튜브 동요 했다. Amplicon 시퀀싱 방법의 한 가지 한계는 결과 분류학 해상도 종종 제한 됩니다 많은 OTUs는 알 수 없는 또는 유일한 알려진 가족 또는 속 수준입니다. 연구의이 분야는 새롭고 개발 방법, 데이터 분석 결과의 해상도 향상 시킬 수 있는 특히 인식 하는 것이 중요 하다 그래서 빠르게 진화 하고있다.
이러한 프로토콜은 박테리아와 archaea, 버섯 하지 공부에 합니다. 확대를 위한 다른 프라이 머를 사용 하 여 동일한 DNA 샘플27,28를 사용 하 여 곰 팡이 사회의 연구에 대 한 허용할 것 이다. 이러한 메서드는 방법 단순화 될 수 있기 때문에 대량의 장비 구매를 필요 하지 않습니다. 우리가 설명 하는 방법 "누구 가", 결정 하는 데 주로 운항 하지만 필드의 기능을 테스트 및 샷건 시퀀싱 방법, 격리를 사용 하 여 해결 될 수 있는 함수에 대 한 중요 한 질문에 신속 하 게 진화 하 고 미생물, 또는 시퀀싱 전체 미생물 게놈입니다.
대표 결과 설명 된 방법을 사용 하 여 식별 될 수 있는 미생물 지역 사회에서 차이 강조 표시 합니다. 데이터 분석22에 베타-다양성 방식을 사용 하 여, 작곡 차이 샘플 종류 사이 표시 했다. 이러한 차이 명확 하 게 endosphere, rhizosphere, 및 토양 고유의 미생물 커뮤니티3을 포함 대부분의 다른 연구에서 관찰 되었습니다. Shannon 다양성 지 풍부 하 고 있는 각 식물 종에서 endosphere, rhizosphere, 및 토양 미생물 종의 균일성을 결정 하기 위해 계산 되었다. 이 연구 및 많은 다른 사람에서 같이, 알파 다양성은 토양는 rhizosphere에서 약간 감소 하 고 endosphere3,,529에서 크게 감소 후에 가장 많습니다. 이러한 결과 여기에 설명 된 메서드는 endosphere, rhizosphere, 및 토양에서 구성 변경 내용을 식별 하는 데 적합 한 나타냅니다.
Proteobacteria 의 지배력은 endosphere 및 토양30,,3132에 대 한 연구에서 일반적인 찾아내는 이다. Endosphere는 일반적으로 Proteobacteria의 더 높은 관계 되는 풍부를 가진 낮은 미생물 종의 다양성이 있다. 이 다시 여기 결과 문학에 있는 다른 발견의 대표는 강조 한다. 이 연구에서 치료 효과가 크게 다른 되었고 그에 대 한 두 가지 주요 이유는 치료에 의해 부과 된 차이 감지에 충분 한 변화를 생성 하기에 충분 되지 않은 고이 샘플링 했다의 끝에 있을 수 있습니다는 성장 계절 때 필드 비슷한 수준으로는 무슨 절 기의 끝에 측정 했다 질소 내려 그릴 충분 한 시간을 했다 수 있습니다. 또 다른 연구에서 시간의 긴 기간 동안 비슷한 수정 속도 사용 하 여, 단지 상대적으로 작은 변화는 미생물의 구성에 측정된33했다. 다른 연구 질소 비료34,35인해 곰 팡이 및 세균 지역 사회에서 변화를 보여왔다.
식물 종의 그들의 microbiomes3,,3236 결정에 역할을 알려지고 미생물 지역 사회 변화에도 작은 차이에서 다른 식물 genotypes 사이 입증 되었습니다가 단일 종37 본이 연구에서는 미생물 지역 사회 구성에 상당한 차이 식물 종 사이 발견 되었다. 모든 샘플 종류에 그것은 switchgrass 가장 뚜렷한 미생물 구성 했지만 종 간의 차이 endosphere에 통계적만 했다 나타났다. Rhizosphere 커뮤니티 구성 수 있습니다 더 많은 복제 분석에 사용할 수 있는 경우 중요 한 되고있다.
결합 된 필드, 실험실, 및 여기에서 설명 하는 분석 프로토콜, rhizosphere, 토양과 뿌리36의 endosphere에 미생물 커뮤니티의 구성 어떻게 다른 요인 영향 공부에 대 한 강력한 방법을 제공 합니다. 많은 농업 분야에서 특히 microbiomes의 지역에서 해야 할 일이 있다. 수익률 토양 미생물에 의해 변경 되는 방법에 대 한 중요 한 질문은 아직 완전히 해명 하. 자르기 회전 영향 토양 미생물, 타이밍은 미생물을 변경 하는 방법, 어떻게 비 생물 적인 긴장을 어떻게에 관한 가장 기본적인 질문에도 미생물, 변경 여부 및 토양 유형에 미생물을 변경할 이러한 요소와 상호 작용 하는 방법 특정 작물 및 미국 지역에서 보편적인 미생물 모든 관련 질문은. 이러한 방법은 존재 및 병원 성 및 유익한 박테리아의 지 속성을 식별 하기 위해 역학 연구도 유용할 것 이다. 이러한 방법에 대 한 또 다른 미래 지평선 DNA 방법 여기에 설명 된 식물 및 미생물 RNA 대사 산물 데이터 통합을 시작 하는 것입니다. 추가 개선 및 더 많은 변수 테스트 추가 이러한 프로토콜의 최적화를 위해 중요할 것 이다.

미생물 연구 이해 하 고 조작 영양소 사이클링, 유기 물 회전율, 및 개발 또는 토양 병원 균1,2의 저해 등 생태계의 프로세스에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 연구의이 분야는 또한 천연 식물 지역 사회와 agroecosystems의 생산성에 토양 미생물의 영향을 이해 하기 위한 큰 잠재력을 보유 하고있다. 자연 생태계에서 토양 미생물에 초점을 맞춘 많은 연구는, 적은 agroecosystems3공장 rhizosphere 및 endosphere 미생물에 집중 했다. 네브라스카, 농업 농업으로 중요 한 작물 연구에 대 한 중요 한 주제를 재배는 이러한 토양의 연구를 만드는 국가의 큰 부분에 걸쳐 풍경을 지배. 이 방법 종이의 목표는 식물의 뿌리에는 rhizosphere와 endosphere, 그리고 결국 미생물 지역 사회를 수정 하는 방법을 확인 하려면 agroecosystems에 미생물을 설명 하는 프로토콜의 표준 세트와 연구자를 제공 하기 이러한 미생물 토양 건강 및 공장 생산성에서 재생 하는 기능을 이해 합니다.
여기에 제시 된 방법4,5 에서이 종이 어떤 미생물 학습 겨냥은 독점적으로 내부 루트 및 루트 밖에 즉시 미생물에서 서로 어떻게 다른 사람에 의해 사용 되는 방법에서 약간 차이가 있는 rhizosphere입니다. 이 연구에 사용 하는 amplicon 시퀀싱 DNA 샘플에서 발견 미생물 taxa 고 커뮤니티 샘플 형식 또는 치료에 따라 변경 하는 방법을 결정 하는 조사를 허용 합니다. 이 프로토콜 Lundberg 외 에서 사용 하는 매우 비슷한 프로토콜의 주요 차이점 중 하나 6 그 대신 쥡니다,이 프로토콜 사용 하 여 표면 살 균 표 백제와 에탄올 뿌리에서는 rhizosphere를 제거 하는. 다른 사람 또한 효과적으로 표면 살 균 사용7,8,,910. 이러한 메서드는 하지만 약간 다른 다른 방법 보다 더 유리한 있습니다. 이러한 메서드는 충분 한 사람들이 함께 그것은 endosphere, rhizosphere, 및 토양으로 분할 될 때 약 450 샘플까지 추가 하루 150 필드 플롯을 처리할 수 있기 때문에 특히 큰 필드 실험에 적합 합니다. 이 원고 분야에서 샘플, 실험실에서 자료 처리 하 고 추출 하 고, DNA 시퀀싱 하는 데 사용 하는 방법을 자세히 설명 하 고 결과 시퀀싱 데이터를 분석 하는 단계에 대 한 간략 한 개요를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Dneasy PowerSoil HTP 96 키트</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>12955-4</td><td>토양 및 뿌리 줄기용 추출 키트</td></tr><tr><td>Dneasy PowerPlant HTP 96 키트</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>13496-4</td><td>뿌리용 추출 키트</td></tr><tr><td>D-핸들 굴착 삽, 101 cm L</td><td>Fiskars</td><td>9669</td><td></td></tr><tr><td>급속 경운기, 40 cm L</td><td>Truper</td><td>34316</td><td></td></tr><tr><td>지퍼백, 17.7 cm x 19.5 cm</td><td>지퍼락</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>쿨러</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>세척 팬</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 양동이</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>장갑 (작업 및 실험실)</td> <td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>직경 20cm 토양 체 # 8, 2360 &mu; m 메쉬 크기</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-8FS</td><td></td></tr><tr><td>20cm 직경 토양 체 # 4, 4750 &mu; m 메쉬 크기</td><td>이중 제조 유한 시카고 일리노이</td><td>US8-4FS</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 발전기</td><td>혼다 브랜드는 잘 작동합니다</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>멸균 세포 여과기 100 &mu; m 메쉬 크기</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>VWR</td><td>0823</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>VWR</td><td>0404</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Lehman Seeds</td><td>VIS-30</td><td>계면활성제</td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>건조 오븐</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>스케일</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>CLOROX - 가정용 강도</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>드라이 아이스 펠릿</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>11cm 정밀 파인 포인트 핀셋</td><td>Fisher</td><td>17456209</td><td></td></tr><tr><td>18cm 스트레이트 포인트 시편 겸자</td><td>VWR</td><td>82027-436</td><td></td></tr><tr><td>13.5cm 가지치기 가위</td><td>Fiskars</td><td>9921</td><td></td></tr><tr><td>2mL 튜브</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>15mL PP 원뿔형 튜브</td><td>MIDSCI</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>50mL PP 원뿔형 튜브</td><td>MIDSCI</td><td>C50B</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>Millipore-sigma</td><td>Milli-Q Integral, Q-POD</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 형광계</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 어세이 키트</td><td>: Invitrogen</td><td>Q32854</td>: <td>제거된 시료의 DNA 정량화용</td></tr>, <tr><td>QuantiFluor dsDNA 시스템</td>: <td>Promega</td><td>E2670</td>, <td>DNA 정량화용</td></tr><tr><td>, 투명하고 평평한 바닥 플레이트가 있는 96-Well Black,</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>pPNA PCR 차단제</td>, <td>PNA Bio</td><td>PP01-50</td><td></td></tr><tr><td>mPNA PCR 차단제</td><td>PNA Bio</td><td>MP01-50</td><td></td></tr><tr><td>미생물 모의 커뮤니티 B의 게놈 DNA(저농도 포함) v5.1L, 16s rRNA 유전자 염기서열 분석용</td><td>BEI Resources</td><td>HM782D</td><td></td></tr><tr><td>접착제 플레이트용 8웰 스트립</td><td>VWR</td><td>89134-434</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 비드, 직경 3.2mm</td><td>Next Advance</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>1ml 분석 블록(Qiagen/MoBio Dneasy용 DNA 추출 플레이트 PowerPlant HTP Kit)CoStar</td><td></td> <td>3959</td><td></td></tr><tr><td>정전기 방지 PP 계량 깔때기, 토양/뿌리 줄기 TWD Tradewinds용 소형 크기</td><td>, INC</td><td>ASWF1SPK</td><td></td></tr><tr><td>정전기 방지 PP 계량 깔때기용 소형 크기, 뿌리/잎 TWD Tradewinds용 x-small 크기</td><td>, INC</td><td>ASWFXSCS</td><td></td></tr><tr><td>Genie 2 Digital Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>50mL 튜브</td><td>용 Vortex 어댑터Scientific Industries</td><td>SI-H506</td><td></td></tr><tr><td>모르타르 (100 mL) 및 유봉</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metal 마이크로 주걱</td><td>VWR</td><td>80071-672</td><td></td></tr><tr><td>일회용 정전기 방지 마이크로 주걱</td><td>VWR</td><td>231-0106</td><td></td></tr><tr><td>갈색 종이 봉지 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm)</td><td>Duro</td><td>18402</td><td></td></tr><tr><td>5424 2 mL 튜브용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트용 원심분리기</td><td>Sigma4-16S</td><td>81510</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브용 원심분리기 로터</td><td>Sigma4-16S</td><td>12269 - Biosafe</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi DNA 중합효소</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 토양, rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

식물 및 토양 미생물 연구 이해 역할 미생물 농업 생산성에서 재생에 대 한 점점 더 중요 한 되 고 있다. 이 논문의 목적은 빠르게 토양, rhizosphere, 및 endosphere 복제 된 현장 실험의 샘플 유형, 치료, 및 식물 유전자 미생물 지역 사회에서 발생할 수 있는 변경 내용을 분석 하는 방법에 정보를 제공 하도록. 이러한 메서드를 보여 주기 위해 사용 하는 실험 웜 시즌 잔디 2, 순수를 포함 하는 복제 필드 플롯의 구성 (Panicum virgatum 및 Andropogon gerardii) 및 낮은 다양성 잔디 혼합물 (A. gerardii, Sorghastrum nutans, 및 Bouteloua curtipendula). 간단히, 식물 발굴, 다양 한 뿌리는 잘라 고 인산 염 버퍼에 배치 다음 동요는 rhizosphere를 수집 하. 뿌리는 얼음 및 표면 소독 표 백제와 에탄올 (EtOH) 실험실에 주어진 다. rhizosphere 필터링 하 고 원심 분리에 의해 집중. 루트 볼 주위에서 발굴된 토양 비닐 봉지에 배치 하 고 토양의 작은 금액을 DNA 추출에 대 한 촬영은 연구실로 가져. DNA는 뿌리, 토양, 및 rhizosphere에서 추출 하 고 16S rRNA 유전자의 v 4 영역에 대 한 뇌관으로 증폭. Amplicons 시퀀싱, 다음 오픈 액세스 생물 정보학 도구와 분석. 이러한 방법을 연구원 미생물 지역 사회 성과 구성 샘플 유형, 치료, 인해 다릅니다 어떻게 테스트 하 고 유전자를 식물. 통계 모델과 함께 이러한 방법을 사용 하 여, 대표적인 결과 입증 뿌리, rhizosphere, 및 토양 미생물 지역 사회에 중요 한 차이가 있다. 여기에 제시 하는 방법 단계 필드 샘플을 수집, 분리, 추출, 계량, 증폭, 및 DNA 시퀀싱 하는 방법에 대 한의 완전 한 세트를 제공 하 고 미생물 지역 사회 성과 복제 필드 재판에서 조성 분석.

이 원고에 제시 하는 대표적인 결과 필드 사이트 미드 근처 대학 네브라스카 링컨 농업 연구 부문 농장에서 2012 년에 설립, 실험, 사이트 니 전에 옥수수-콩 순환으로 관리 했다 . 세 가지 유형의 토양에 위치한 연구 사이트 하지만 측정된 토양 속성의 모든 변경 사항을 부과 하는 치료로 인해 마치 데이터 분석.
분야 사이트 2, 순수 포함, 큰 bluestem, indiangrass (S. nutans), 그리고 '버트' sideoats grama (낮은 다양성 잔디 혼합물 뿐만 아니라 switchgrass (P. virgatum 이력서 자유)와 큰 bluestem (A. gerardii)의 의미 B. curtipendula)입니다. 3 따뜻한 시즌 잔디 플롯 세 번 복제 된 완전 한 무작위 블록 디자인에 있었다. 3 다른 잔디 플롯으로 중첩 되었고 56 (N1) 112kg (N2) N 하는 2 개의 질소 (N) 수정 처리 적용된 요소-1 했다. 성장 시기의 끝에 미생물 샘플링 시 음모에서 포함 된 토양 8.0 ± 1.1 (평균 ± SD) ppm 질산염 함께 수정 112kg N 하-1 과 6.8 ± 0.7 (평균 + SD) 음모에 ppm 질산염 함께 수정 56 kg N 하-1. 음모는 일년에 한 번을 수정 된 했다. 음모는 주요 플롯 (8000 m2) 및 N 치료로 지정 되었다 웜 시즌 잔디 분할 플롯 (4000 m2) 했다. 큰 bluestem '보 난 자'와 '금광'의 50: 50 혼합으로 시드 되었습니다 그리고 Indiangrass '스카우트'와 '전사'의 50: 50 혼합으로 시드 되었습니다. 음모는 2012 년에 설치 했다 그리고 첫 번째 N 응용 프로그램 2013의 봄.
토양 및 루트 샘플링은 2014 년 9 월 15 일에 실시 되었다. 3 복제 (그림 1)과 분할 플롯 무작위 디자인으로 설정 된 필드에 아래 설명 된 작업 실시 됐다. Endosphere에 대 한 샘플은 다음과 같이 모든 평균 시퀀싱 깊이: 4871 ± 5711 (평균 ± SD), rhizosphere: 40726 ± 14684, 토양: 38184 ± 9043. 설명, 방법을 사용 하 여 이러한 실험에 변화의 가장 큰 소스 중 하나 미생물 지역 사회 발견 샘플 형식 (그림 2) 사이에서 차이가 있습니다. 이 대표적인 데이터 세트에서 rhizosphere 및 토양 서로 구성 (그림 2A) endosphere 보다 더 비슷한 것으로 나타납니다. 그러나, 거기 또한 매우 중요 한 했다 (p = 0.001) rhizosphere와 (그림 2B) 토양 미생물 지역 사회 구성에 차이. 샘플 형식에 의해 분석 이러한 실험에서 차지 하 고 총 변화 26% 이었다.
알파 다양성 분석 미생물 지역 사회는 endosphere에서 낮은 토양와 rhizosphere (그림 3) 샘플 다양성에는 나타났다. 어떤 구획에 잔디 종 간의 다양성에만 큰 차이가 큰 bluestem의 endosphere 샘플 및 switchgrass, switchgrass 데 상당히 높은 미생물 종 다양성 (그림 3)와 함께 사이 했다. 관계 되는 풍부 분석 (그림 4) Proteobacteria Actinobacteria 뒤에 모든 샘플 종류에서의 지배를 강조 표시 합니다. 토양 및 rhizosphere는 또한에 의해 지배 Acidobacteria 와 Chloroflexi 는 endosphere Bacteriodetes의 더 큰 상대 풍부 했다 반면.
이 실험에서 두 개의 서로 다른 양의 N 비료 식물 성장 했다 고 우리 치료 효과 있었습니다 여부를 확인 하기 위해 데이터를 분석 하는 따라서. 치료 효과 총 변이의 12%를 차지 하지만 안 수에서 두 치료는 다른 (그림 5) 보지 크게 다른 아니었다. 이 이러한 데이터 집합 보다는 육안 검사 또는 질적 판단에 대 한 통계 분석의 중요성을 강조 한다.
식물 조직 및 토양의 미생물에서 식물 영향 차이 안 수의 제한 된 메서드를 사용 하 여 시각화 했다. 통계적 인 차이 사용 하 여 PERMANOVA 분석은 크게 다른 미생물 커뮤니티 구성 샘플 사이에서 종, 등의 특정 변수 결과 여부 테스트를 결정 했다. 모든 샘플 종류 함께 분석 했다 때 매우 중요 한 차이 때문에 식물 종 (그림 6) 미생물 지역 사회 구성에서 발견 되었다. 이 실험에서 변형 식물 종에 의해의 양은 6.7% 이었다. 마지막으로, 각 샘플 형식 샘플 종류의 운전 하 고 있을 중요 한 식물 종 효과 결정 하기 위해 개별적으로 분석 했다. endosphere에서 서만 거기 있 었 어 매우 중요 한 차이 (p = 0.001) (그림 7) 다른 식물 종의 미생물 커뮤니티 구성 사이. 다른 샘플 형식에서는 종 효과 개별적으로 분석 하면 중요 한 되지 않았습니다. Endosphere, 종 인 백분율 변화 했다 rhizosphere (18%) 및 토양 (15%)에서 낮은 반면 27%, 이었다. 이 더 각 조직 유형을 개별적으로 분석의 중요성을 강조 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> 그림 1: 실험 분야 디자인의 예. 대학 네브라스카 링컨 동부 네브라스카 연구와 미드, 네브라스카 근처 센터에 위치한 필드 사이트의 3 중에서 완전 한 무작위 블록 디자인을 설명 하는 실험 분야 디자인 전체 사이트 설명에 대 한 결과 섹션을 참조. N 1은 낮은 (56 kg N 하-1 요소) 및 N2 (112 k N g 하-1 요소) 적용 된 높은 질소 비율 이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> 그림 2: endosphere, rhizosphere, 및 2014에 다년생 잔디 샘플링에서 토양을 포함 하 여 다른 샘플 형식에서 미생물 구성 비교 베타 다양성 분석. 분석 브 레이 커티스 호환성 매트릭스를 생성 하 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 실행 되었다. 주 좌표 분석 (PCoA) 브 레이 커티스 호환성 매트릭스에 따라 RStudio에서 구상 되었다. PCoA1과 PCoA2 PCoA 분석에 의해 설명 하는 첫 번째와 두 번째로 큰 분산을 나타냅니다. PERMANOVA 통계 분석 샘플 형식 간의 중요성을 결정 하기 위해 수행 하 고 p 값 오른쪽 상단 모서리에 표시 됩니다. 그림에 각 기호는 각 샘플에 대 한 전체 미생물 지역 사회를 나타냅니다. (A) Endosphere, rhizosphere 및 토양 샘플 형식 함께 분석 했다. 모든 87 샘플 샘플 당 486 시퀀스에 올라가기 했다. (B) Rhizosphere 및 토양 샘플 함께 분석 했다. 모든 59 샘플 8231 시퀀스 올라가기 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> 그림 3: endosphere, rhizosphere 및 토양에 각 종족에 대 한 논 지를 사용 하 여 알파 다양성 분석. 분석은 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 실행 되었다. 진공은 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플 형식 샘플 당 486, 17154 및 8231 시퀀스와 각각에 대 한 수행 되었다. 상자 표시 25 그리고 75 백분위 (첫 번째 및 세 번째 quartiles). 상자 안에 가로줄 중간값과 빨간색을 나타냅니다 플러스 평균을 보여 줍니다. 수염 outliers (이 검은 점 들으로 표시 됩니다) 그 보다 1.5 배 interquartile 범위를 제외 하는 데이터의 범위를 표시 (n = 6 sideoats grama 섞는다 어디를 제외 하 고 각 샘플에 대 한 n = 5). 섀 넌 인덱스는 endosphere에 있는 모든 5 종의 rhizosphere와 토양 보다 낮은 했다. 비 파라메트릭 Wilcoxon 순위 합계 테스트 종 사이 의미를 결정 하는 데 사용 했다 하 고 큰 차이가 종 상자 위에 표시 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> 그림 4: endosphere, rhizosphere, 및 토양에 있는 문 수준에 관계 되는 풍부. 샘플 다른 샘플 종류 중에서 미생물 문의의 풍부를 비교 분석 했다 (n = 각 샘플 형식에 대 한 29). 분석은 OTU 테이블에서 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 실행 되었다. 원형 차트 내부 다양 한 색상은 문의 나타냅니다. 백분율은 각 문 각 샘플 형식에의 관계 되는 풍부를 나타냅니다. 문 정보 했다 Ribosomal 데이터베이스 프로젝트 분류자 (RDP)25를 사용 하 여 주석 처리 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> 그림 5: 모든 샘플 형식 간의 제약 요인으로 치료를 사용 하 여 분석. 주 좌표 (모자) 분석의 정식 분석 치료 사이 미생물 지역 사회 구성에 차이가 있었는지 확인 하기 위해 수행 되었다. 치료를 위해 각 N, n = 42 n 1에 대 한 (56 k N g 하-1) 및 n n 2에 대 한 = 45 (112kg N 하-1). 브 레이 커티스 호환성 매트릭스는 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 생성 되었습니다. 브 레이 커티스 호환성 매트릭스에 따라 모자 분석 RStudio에서 요인으로 치료를 제한 하 여 이루어졌다. PERMANOVA 분석 치료 차이 했다 중요 한, p 값은 오른쪽 상단에 표시 됩니다 있는지 확인 위해 수행 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> 그림 6: 모든 샘플 형식 간의 제약 요인으로 식물을 사용 하 여 분석. 분석은 모든 샘플 종류에서 식물 종 사이 미생물 지역 사회 구성에 차이가 있었는지 확인 하기 위해 실시 됐다. 주 좌표 조정 및 모든 샘플 형식 (endosphere, rhizosphere, 및 토양)의 모자 분석 수행 되었다 브 레이 커티스 호환성 매트릭스를 사용 하 여. 브 레이 커티스 호환성 매트릭스 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 생성 되었습니다. 브 레이 커티스 호환성 매트릭스에 따라 모자 분석 RStudio에서 요인으로 제약 하는 식물 종에 의해 이루어졌다. PERMANOVA 통계 분석 식물 종 사이 의미를 결정 하기 위해 수행 하 고 P 값 오른쪽 상단 모서리에 표시 됩니다. 각 기호는 그림에 그 샘플에 대 한 전체 미생물 지역 사회를 나타냅니다. n = n 을 제외한 모든 샘플 종류에 각 종족에 대 한 18 = 15 sideoats grama 믹스에 대 한. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> 그림 7: 종을 사용 하 여 제약 요인으로 각 샘플 유형에 개별적으로 모자 분석의 예. 주 좌표 조정 및 각 샘플 형식 (endosphere, rhizosphere, 및 토양)의 모자 분석 브 레이 커티스 호환성 매트릭스를 사용 하 여. 각 샘플 종류 486, 17154, 및 endosphere, rhizosphere 및 토양에서 각각 샘플 당 8231 읽기에 올라가기는. 종은 안 수를 제한 하는 요인으로 사용 되었다. PERMANOVA 통계 분석 각 샘플 유형에서 식물 종 사이 의미를 결정 하기 위해 수행 하 고 p 값 오른쪽 상단 모서리에 표시 됩니다. 그림에서 각 기호는 각 샘플에 대 한 전체 미생물 지역 사회를 나타냅니다. 샘플 크기는 n = 29 각 샘플 유형, n = sideoats grama 믹스를 제외한 각 샘플 형식에 각 식물 종에 대 한 6 (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

필드에서 식물 뿌리의 발굴 뿐만 아니라 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플의 처리는 DNA 추출 및 데이터 분석 방법 등 자세하게에서 설명 되어 있습니다. 이 문서는 토양, endosphere, rhizosphere microbiomes의 연구에 대 한 이러한 기법을 사용 하 여 다른 실험실을 사용 하도록 설계 되었습니다.

절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

이 방법은 토양, 근권 및 뿌리 내구 마이크로바이옴 분야의 주요 질문(예: 샘플 유형, 처리 및 식물 유전자형에 대한 반응으로 미생물 군집 다양성이 어떻게 변화하는지)에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 표본 수와 복제가 필요한 현장 실험에 매우 적합하다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 저와 제 연구실의 대학원생이자 연구 기술자인 Stephanie Futrell이 맡을 것입니다.프로토콜을 시작하려면 세척 팬과 양동이에 식물 샘플 세부 정보가 포함된 스티커 메모를 붙입니다. 라벨이 붙은 양동이를 밭으로 운반하고 세탁팬은 현장에 설치된 워크스테이션에 둡니다. 플롯 내의 다른 영역에서 플롯당 두 개의 식물을 무작위로 선택하고 수집합니다.다음으로, 삽으로 토양을 30cm 깊이까지 뚫어 토양에서 식물을 지탱하고있는 측면 뿌리를 자릅니다. 삽을 사용하여 식물 뿌리를 파내고 라벨이 붙은 양동이에 뿌리 공을 놓습니다. 버킷을 현장의 워크스테이션으로 다시 가져옵니다.뿌리를 흔들고 삽이나 휴대용 경운기를 사용하여 뿌리에서 흙을 제거합니다. 장갑을 착용하고 뿌리를 가공 스테이션 근처에 놓습니다. 뿌리를 흔든 후 세척 팬에 흙을 섞고 휴대용 경운기로 흙 덩어리를 부수십시오.파편이 없는 흙 샘플을 라벨이 붙은 17.7 x 19.5cm 지퍼 보관 가방에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 가지 치기 가위를 70 % 에탄올로 살균하십시오. 멸균 가위를 사용하여 식물 당 약 4-6 개의 뿌리와 각 뿌리 길이가 약 9-12 센티미터의 다양한 뿌리를 잘라냅니다.절제된 뿌리를 Silwet L-77과 같은 계면활성제가 함유된 35ml의 오토클레이브 인산염 완충액이 들어 있는 라벨이 부착된 50ml 튜브에 넣습니다. 2분 동안 튜브를 흔들어 뿌리 표면에서 뿌리구를 분리합니다. 발전기와 와류로 흔들림을 개선합니다.70% 에탄올로 멸균한 집게로 튜브에서 뿌리를 제거하고 종이 타월로 잠시 닦은 다음 라벨이 붙은 새 50ml 튜브에 넣습니다. 뿌리 줄기가 들어있는 튜브와 뿌리가 들어있는 튜브를 모두 얼음 위에 놓습니다. 밭에 모인 뿌리가 있는 50ml 튜브에 약 35ml의 50% 표백제와 0.01% Tween 20을 추가합니다.30-60초 동안 튜브를 소용돌이치거나 흔듭니다. 표백제를 붓고 35ml의 70% 에탄올을 첨가한 다음 30-60초 동안 뿌리를 소용돌이치거나 흔듭니다. 흔든 후 70% 에탄올을 붓고 35ml의 멸균 초순수와 와류를 넣거나 샘플을 1분 동안 흔듭니다.물 헹굼 단계를 두 번 더 반복하여 뿌리가 멸균된 초순수로 총 세 번 헹굽니다. 건조하고 깨끗한 종이 타월로 뿌리를 닦고 각 샘플에 깨끗한 종이 타월을 사용하십시오. 멸균 집게와 가지치기 가위를 사용하여 뿌리를 약 5mm 조각으로 자르고 자른 뿌리를 깨끗하고 라벨이 붙은 15mm 원뿔형 튜브에 넣은 다음 추가 처리될 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.현장의 뿌리구 샘플이 들어 있는 50ml 튜브를 20-30초 동안 흔들어 전체 샘플을 다시 현탁시킵니다. 멸균된 100미크론 메쉬 셀 스트레이너를 사용하여 다시 현탁된 샘플을 새 50ml 튜브에 여과합니다. 그런 다음, 실온에서 5분 동안 3, 000회 g로 튜브를 원심분리하십시오.즉시 상층액을 붓고 버리십시오. 뿌리 줄기 펠릿을 얼음 위의 50ml 튜브에 넣습니다. 다음으로, 계면활성제가 없는 1.5ml의 멸균 인산염 완충액을 뿌리권 펠릿에 추가하고 와류로 처리하여 샘플을 다시 현탁시킵니다.부유 액체를 라벨이 표시된 깨끗한 2ml 마이크로퓨지 튜브에 피펫으로 넣습니다. 실온에서 2분 동안 g을 15, 871회 돌리십시오. 즉시 상층액을 붓고 깨끗한 종이 타월로 튜브를 배수하십시오.추가 처리될 때까지 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 멸균 금속 주걱을 사용하여 DNA 추출을 위해 약 3g의 흙으로 라벨이 표시된 깨끗한 2ml 튜브를 채우고 작은 뿌리 조각과 부스러기를 피하십시오. 각 샘플 사이에 금속 주걱을 70% 에탄올로 헹굽니다.이 토양 샘플은 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 깨끗한 세척 팬에서 흙 주머니를 더 작은 체 위에 더 큰 체가 있는 쌓인 체로 비우고 두 체를 통해 흙을 수동으로 체질합니다. 브러시를 사용하여 샘플 사이의 체를 조심스럽게 청소하십시오.향후 토양 물리 화학적 및 질감 분석을 위해 17.7 x 19.5cm 지퍼가 달린 가방에 100-125g의 체로 거른 토양을 따로 보관하십시오. 단기 보관을 위해 흙 주머니를 섭씨 4도에 놓습니다. 다음으로, 깨끗한 주걱이 있는 플라스틱 비커와 깨끗한 모르타르에 액체 질소를 붓습니다.얼린 티슈를 절구에 넣고 유봉과 함께 고운 가루로 갈아냅니다. 샘플을 냉동 상태로 유지하기 위해 분쇄하는 동안 액체 질소를 지속적으로 첨가하십시오. 주걱을 사용하여 라벨이 붙은 깨끗한 2mm 튜브에 분쇄 조직을 옮긴 다음 섭씨 영하 80도에서 조직을 보관합니다.70%의 에탄올과 1%의 가정용 표백제로 작업 영역을 닦습니다. 영하 20도의 창고에서 토양 샘플을 꺼내 얼음 양동이에 넣어 해동합니다. 96웰 추출 플레이트에서 밀봉 매트 덮개를 제거하고 두 개의 종이 닦음 사이에 덮개를 놓아 사용하지 않을 때 깨끗하게 유지합니다.오염을 방지하기 위해 플레이트의 12개 열을 접착식 8웰 PCR 스트립으로 덮습니다. 멸균된 크기의 작은 계량 깔때기를 저울에 올려놓고 200-250mg의 토양의 무게를 잰다. 접착 스트립을 조심스럽게 들어 올리고 채워진 계량 깔때기의 목을 적절한 우물에 놓고 토양 샘플을 적절한 우물로 부드럽게 안내합니다.우물을 덮도록 접착 스트립을 교체하십시오. 각 샘플에 대해 새로운 멸균 깔때기를 사용하여 모든 웰에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 추출 플레이트의 밀봉 매트 커버를 교체하고 DNA 추출 준비가 될 때까지 플레이트를 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.영하 20도의 저장소에서 뿌리 줄기 샘플을 제거하고 얼음 양동이에서 해동합니다. 이전 섹션에서 수행한 것처럼 DNA 추출 플레이트를 준비합니다. 깨끗한 종이 닦음을 저울에 놓고 저울에 멸균 금속 주걱을 얹습니다.주걱을 사용하여 샘플 튜브에서 뿌리 줄기 펠릿의 일부를 조심스럽게 퍼냅니다. 200에서 250mg 사이의 뿌리권 샘플의 무게를 잰다. 접착 스트립을 조심스럽게 들어 올려 추출 플레이트의 첫 번째 웰을 엽니다.채워진 주걱을 우물에 비스듬히 넣고 멸균 이쑤시개로 뿌리 줄기 물질을 적절한 우물에 긁어냅니다. 금속 주걱을 물로 헹군 다음 샘플 사이에 70% 에탄올을 헹굽니다. 마지막으로, 플레이트가 채워질 때까지 플레이트의 모든 웰에 대해 이 프로세스를 반복하고 하나의 웰은 추출 블랭크 컨트롤로 비워둡니다.이 대표적인 데이터 세트에서는 표본 유형 간에 매우 큰 차이가 있었으며 뿌리권과 토양은 뿌리보다 구성이 서로 더 유사한 것으로 보입니다. 추가 분석에 따르면 근권과 토양 사이의 미생물 군집 구성에도 매우 중요한 차이가 있는 것으로 나타났습니다. 알파 다양성 분석은 내구의 미생물 군집이 토양 및 근권의 군집보다 낮다는 것을 보여줍니다.잔디 종 간의 다양성에서 유일하게 중요한 차이는 큰 블루스템과 스위치그래스의 내구 샘플 사이였습니다. 상대적 존재도 분석은 모든 샘플 유형에서 프로테오박테리아(Proteobacteria)가 우세하고 악티노박테리아(Actinobacteria)가 그 뒤를 잇는다는 것을 강조합니다. 토양과 근권은 애시도박테리아(Acidobacteria)와 클로로플렉시(Chloroflexi)가 우세한 반면, 뿌리는 상대적으로 박테리오데테(Bacteriodetes)가 더 많았습니다.모든 샘플 유형에 대한 PERMANOVA 분석은 식물 종으로 인한 미생물 군집 구성에 매우 큰 차이가 있음을 밝혔습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 토양, 내구 및 뿌리권 마이크로바이옴 연구에 사용하기 위해 일련의 단계를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 교육용 비디오에 대한 부분 자금을 지원해 주신 Nebraska EPSCoR과 National Science Foundation EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1에 감사드립니다.

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Research

연구

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Environment

환경

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여기에서 우리는 식물 다양성 구배를 따라 초원 군집의 생태계 기능에 대한 식물 역사와 토양 역사의 독립적이고 상호 작용적인 영향을 연구하기 위해 지상 및 지하의 환경 조건이 통제된 지상 반폐쇄 우주 챔버인 iDiv Ecotron에 설립된 연구를 제시합니다.

JenaTron - 식물의 역사와 토양의 역사가 초원 생태계 기능에 미치는 영향을 연구하는 실험적 접근 방식

배우세요 다년생 잔디의 절연, 토양, 뿌리권 미생물 커뮤니티 분석 방법을. DNA 추출 및 현장 실험을 위한 표준화된 프로토콜을 통해 토양 미생물군집 연구의 재현성을 높입니다.

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