절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

이 방법은 토양, 근권 및 뿌리 내구 마이크로바이옴 분야의 주요 질문(예: 샘플 유형, 처리 및 식물 유전자형에 대한 반응으로 미생물 군집 다양성이 어떻게 변화하는지)에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 표본 수와 복제가 필요한 현장 실험에 매우 적합하다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 저와 제 연구실의 대학원생이자 연구 기술자인 Stephanie Futrell이 맡을 것입니다.

프로토콜을 시작하려면 세척 팬과 양동이에 식물 샘플 세부 정보가 포함된 스티커 메모를 붙입니다. 라벨이 붙은 양동이를 밭으로 운반하고 세탁팬은 현장에 설치된 워크스테이션에 둡니다. 플롯 내의 다른 영역에서 플롯당 두 개의 식물을 무작위로 선택하고 수집합니다.

다음으로, 삽으로 토양을 30cm 깊이까지 뚫어 토양에서 식물을 지탱하고있는 측면 뿌리를 자릅니다. 삽을 사용하여 식물 뿌리를 파내고 라벨이 붙은 양동이에 뿌리 공을 놓습니다. 버킷을 현장의 워크스테이션으로 다시 가져옵니다.

뿌리를 흔들고 삽이나 휴대용 경운기를 사용하여 뿌리에서 흙을 제거합니다. 장갑을 착용하고 뿌리를 가공 스테이션 근처에 놓습니다. 뿌리를 흔든 후 세척 팬에 흙을 섞고 휴대용 경운기로 흙 덩어리를 부수십시오.

파편이 없는 흙 샘플을 라벨이 붙은 17.7 x 19.5cm 지퍼 보관 가방에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 가지 치기 가위를 70 % 에탄올로 살균하십시오. 멸균 가위를 사용하여 식물 당 약 4-6 개의 뿌리와 각 뿌리 길이가 약 9-12 센티미터의 다양한 뿌리를 잘라냅니다.

절제된 뿌리를 Silwet L-77과 같은 계면활성제가 함유된 35ml의 오토클레이브 인산염 완충액이 들어 있는 라벨이 부착된 50ml 튜브에 넣습니다. 2분 동안 튜브를 흔들어 뿌리 표면에서 뿌리구를 분리합니다. 발전기와 와류로 흔들림을 개선합니다.

70% 에탄올로 멸균한 집게로 튜브에서 뿌리를 제거하고 종이 타월로 잠시 닦은 다음 라벨이 붙은 새 50ml 튜브에 넣습니다. 뿌리 줄기가 들어있는 튜브와 뿌리가 들어있는 튜브를 모두 얼음 위에 놓습니다. 밭에 모인 뿌리가 있는 50ml 튜브에 약 35ml의 50% 표백제와 0.01% Tween 20을 추가합니다.

30-60초 동안 튜브를 소용돌이치거나 흔듭니다. 표백제를 붓고 35ml의 70% 에탄올을 첨가한 다음 30-60초 동안 뿌리를 소용돌이치거나 흔듭니다. 흔든 후 70% 에탄올을 붓고 35ml의 멸균 초순수와 와류를 넣거나 샘플을 1분 동안 흔듭니다.

물 헹굼 단계를 두 번 더 반복하여 뿌리가 멸균된 초순수로 총 세 번 헹굽니다. 건조하고 깨끗한 종이 타월로 뿌리를 닦고 각 샘플에 깨끗한 종이 타월을 사용하십시오. 멸균 집게와 가지치기 가위를 사용하여 뿌리를 약 5mm 조각으로 자르고 자른 뿌리를 깨끗하고 라벨이 붙은 15mm 원뿔형 튜브에 넣은 다음 추가 처리될 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

현장의 뿌리구 샘플이 들어 있는 50ml 튜브를 20-30초 동안 흔들어 전체 샘플을 다시 현탁시킵니다. 멸균된 100미크론 메쉬 셀 스트레이너를 사용하여 다시 현탁된 샘플을 새 50ml 튜브에 여과합니다. 그런 다음, 실온에서 5분 동안 3, 000회 g로 튜브를 원심분리하십시오.

즉시 상층액을 붓고 버리십시오. 뿌리 줄기 펠릿을 얼음 위의 50ml 튜브에 넣습니다. 다음으로, 계면활성제가 없는 1.5ml의 멸균 인산염 완충액을 뿌리권 펠릿에 추가하고 와류로 처리하여 샘플을 다시 현탁시킵니다.

부유 액체를 라벨이 표시된 깨끗한 2ml 마이크로퓨지 튜브에 피펫으로 넣습니다. 실온에서 2분 동안 g을 15, 871회 돌리십시오. 즉시 상층액을 붓고 깨끗한 종이 타월로 튜브를 배수하십시오.

추가 처리될 때까지 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 멸균 금속 주걱을 사용하여 DNA 추출을 위해 약 3g의 흙으로 라벨이 표시된 깨끗한 2ml 튜브를 채우고 작은 뿌리 조각과 부스러기를 피하십시오. 각 샘플 사이에 금속 주걱을 70% 에탄올로 헹굽니다.

이 토양 샘플은 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 깨끗한 세척 팬에서 흙 주머니를 더 작은 체 위에 더 큰 체가 있는 쌓인 체로 비우고 두 체를 통해 흙을 수동으로 체질합니다. 브러시를 사용하여 샘플 사이의 체를 조심스럽게 청소하십시오.

향후 토양 물리 화학적 및 질감 분석을 위해 17.7 x 19.5cm 지퍼가 달린 가방에 100-125g의 체로 거른 토양을 따로 보관하십시오. 단기 보관을 위해 흙 주머니를 섭씨 4도에 놓습니다. 다음으로, 깨끗한 주걱이 있는 플라스틱 비커와 깨끗한 모르타르에 액체 질소를 붓습니다.

얼린 티슈를 절구에 넣고 유봉과 함께 고운 가루로 갈아냅니다. 샘플을 냉동 상태로 유지하기 위해 분쇄하는 동안 액체 질소를 지속적으로 첨가하십시오. 주걱을 사용하여 라벨이 붙은 깨끗한 2mm 튜브에 분쇄 조직을 옮긴 다음 섭씨 영하 80도에서 조직을 보관합니다.

70%의 에탄올과 1%의 가정용 표백제로 작업 영역을 닦습니다. 영하 20도의 창고에서 토양 샘플을 꺼내 얼음 양동이에 넣어 해동합니다. 96웰 추출 플레이트에서 밀봉 매트 덮개를 제거하고 두 개의 종이 닦음 사이에 덮개를 놓아 사용하지 않을 때 깨끗하게 유지합니다.

오염을 방지하기 위해 플레이트의 12개 열을 접착식 8웰 PCR 스트립으로 덮습니다. 멸균된 크기의 작은 계량 깔때기를 저울에 올려놓고 200-250mg의 토양의 무게를 잰다. 접착 스트립을 조심스럽게 들어 올리고 채워진 계량 깔때기의 목을 적절한 우물에 놓고 토양 샘플을 적절한 우물로 부드럽게 안내합니다.

우물을 덮도록 접착 스트립을 교체하십시오. 각 샘플에 대해 새로운 멸균 깔때기를 사용하여 모든 웰에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 추출 플레이트의 밀봉 매트 커버를 교체하고 DNA 추출 준비가 될 때까지 플레이트를 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

영하 20도의 저장소에서 뿌리 줄기 샘플을 제거하고 얼음 양동이에서 해동합니다. 이전 섹션에서 수행한 것처럼 DNA 추출 플레이트를 준비합니다. 깨끗한 종이 닦음을 저울에 놓고 저울에 멸균 금속 주걱을 얹습니다.

주걱을 사용하여 샘플 튜브에서 뿌리 줄기 펠릿의 일부를 조심스럽게 퍼냅니다. 200에서 250mg 사이의 뿌리권 샘플의 무게를 잰다. 접착 스트립을 조심스럽게 들어 올려 추출 플레이트의 첫 번째 웰을 엽니다.

채워진 주걱을 우물에 비스듬히 넣고 멸균 이쑤시개로 뿌리 줄기 물질을 적절한 우물에 긁어냅니다. 금속 주걱을 물로 헹군 다음 샘플 사이에 70% 에탄올을 헹굽니다. 마지막으로, 플레이트가 채워질 때까지 플레이트의 모든 웰에 대해 이 프로세스를 반복하고 하나의 웰은 추출 블랭크 컨트롤로 비워둡니다.

이 대표적인 데이터 세트에서는 표본 유형 간에 매우 큰 차이가 있었으며 뿌리권과 토양은 뿌리보다 구성이 서로 더 유사한 것으로 보입니다. 추가 분석에 따르면 근권과 토양 사이의 미생물 군집 구성에도 매우 중요한 차이가 있는 것으로 나타났습니다. 알파 다양성 분석은 내구의 미생물 군집이 토양 및 근권의 군집보다 낮다는 것을 보여줍니다.

잔디 종 간의 다양성에서 유일하게 중요한 차이는 큰 블루스템과 스위치그래스의 내구 샘플 사이였습니다. 상대적 존재도 분석은 모든 샘플 유형에서 프로테오박테리아(Proteobacteria)가 우세하고 악티노박테리아(Actinobacteria)가 그 뒤를 잇는다는 것을 강조합니다. 토양과 근권은 애시도박테리아(Acidobacteria)와 클로로플렉시(Chloroflexi)가 우세한 반면, 뿌리는 상대적으로 박테리오데테(Bacteriodetes)가 더 많았습니다.

모든 샘플 유형에 대한 PERMANOVA 분석은 식물 종으로 인한 미생물 군집 구성에 매우 큰 차이가 있음을 밝혔습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 토양, 내구 및 뿌리권 마이크로바이옴 연구에 사용하기 위해 일련의 단계를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 교육용 비디오에 대한 부분 자금을 지원해 주신 Nebraska EPSCoR과 National Science Foundation EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1에 감사드립니다.