Name: 마우스에 트랜스 상피 이온 수송 계량 비 전위차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 마우스 비강 전위차 측정법으로 낭포성 섬유증 치료제 효능을 평가하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 이온 수송체 기능을 정량화하여 생쥐 모델에서 신뢰할 수 있는 데이터를 제공합니다.

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저자는 비판적 원고 편집에 대 한 교수 J. Lebacq 감사 합니다. Cftrtm1Eur (homozygous F508del-CFTR (FVB/129) 마우스는 에라스무스, 로테르 담, 네덜란드, 낭 성 섬유 증 EU FP6 연구를 위한 유럽 경제 공동체 유럽 조정 작업의 지원에 의해 개발 되었다 LHHM-CT-2005-018932입니다.

연구 및 절차 연구 (시 n ° 86/609)에서 동물 사용에 대 한 유럽 공동체 규정 동의 UCL (2017/UCL/MD/015)의 동물 연구에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 조사 지침 2010/63/유럽 유럽의 회의 2010 년 9 월 월 22 일의 위원회의 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 따라 동물 실험에 대 한 정규화 됩니다.
1. 테스트 전 평가 및 관리
<ol><li>더블 루멘 비 강 카 테 터를 준비 합니다. 참고: 비 강 카 테 터는 더블 루멘 모 세관 튜브, 한 루멘 솔루션의 지속적인 관류에 대 한 사용 되 고 다른 하나는 측정 채널.<ol>
<li>폴 리 에틸렌 관 (2.0 m m 내경, 3.0 m m 외경;의 조각, 길이, 약 20 m의 중앙 단면도 열 그림 1 한) (10-15 s)를 당기기를 위한 충분히 부드러운 때까지 가스 버너의 화 염에서.</li>
		<li>적절 한 길이 (~ 15 cm)와 코 프로브 (그림 1b)에 대 한 외부 직경 (~0.1 m m)의 매우 얇은 모 세관 튜브를 떨어져 두 끝을 당겨.</li>
		<li>청소 하 고 degrease 순수 에탄올과 같은 두 개의 모세 혈관, 테이프그림 1(c) 그들을 함께 cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 함께 그들을 접착제.</li>
		<li>면도날 또는 약 8 cm (그림 1의d) 더블 루멘 카 테 터의 최적의 길이 메스 프로브의 초과 길이 멀리 잘라.</li>
		<li>주사 투과 하는 것을 확인 하 두 루멘을 통해 물.</li>
		<li>끝에서 5 mm 거리에서 마크를 적용 합니다. 참고: 프로브 삽입 됩니다, 콧구멍에 마크까지 모든 측정은 비 강 내부 같은 사이트에 있도록.</li>
		<li>건조 한 상자에 더블 루멘 카 테 터를 저장 합니다. 참고: 수 있습니다 사용된 6-10 번 적절 하 게 테스트 후 즉시 청소 하는 경우.</li>
	</ol>
</li>
	<li>크림 믹스를 준비 합니다.<ol>
<li>부드럽게 혼합 전해질 크림과 포화 3m KCl 해결책 1:1 비율 (볼륨/볼륨), 작은 기포의 형성을 방지. 참고: 크림 믹스 사용 됩니다 구축 측정 및 참조에 대 한 전극 교량 Ag/AgCl 전극, 그림 1에서 볼 수 있듯이.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> 그림 1 : 전극과 교량 프로브. 그림 (a) 전후 난방 그리고 (b), (c)는 더블 루멘 카 테 터 (d), 실리콘 튜브 커넥터 (e)와 전극 (f)의 두 모 세관 부분에 합류 하는 테이프 폴 리 에틸렌 튜브를 보여 줍니다. 사진 선명도, 커넥터 크림 혼합으로 가득 하지는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>솔루션 레이블</td>
			<td>솔루션 설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>기초 버퍼링 소금 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>소금 솔루션 버퍼링 염화-무료</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>10-2 M amiloride 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>10-3 M 산림 재고 솔루션</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 주식 쥐에서 코 PD 테스트를 위한 솔루션.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>소금</td>
			<td>mM</td>
			<td>분자량</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화 나트륨 (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7,889</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화 칼슘이 수화물 (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>2 월 25 일</td>
			<td>147</td>
			<td>0.331</td>
		</tr>
<tr>
<td>마그네슘 염화 물 hexahydrate (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203.3</td>
			<td>0.244</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dipotassium 인산 염 (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monopotassium 인산 염 (KH2포4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 기저의 버퍼링 소금 솔루션 (솔루션 주식).
<ol start="3"><li>솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>실험 프로토콜 (표 1)에 필요한 4 개의 재고 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>준비 하는 기저 버퍼 솔루션 (재고 솔루션; 표 2) 그리고 염화 무료 버퍼 솔루션 (재고 솔루션 B; 표 3) 실내 온도에서 순수한 물에 있는 소금 혼합 하 여 PH, 낮은 pH에 1 N HCl 인상 1 N NaOH를 사용 하 여 pH 7.4 (범위 7.0-7.6)를 조정 합니다. 솔루션 (275 mOsm/L)의 osmolarity를 확인 하십시오.</li>
			<li>최대 6 개월까지 최대 3 개월 또는 냉동된에 플라스틱 병에 대 한 4 ° C에서 레이블이 유리병에 저장 합니다.</li>
			<li>순수한 물 10 mL를 amiloride 염의 26.6 mg을 추가 하 여 10-2 M amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C)를 준비 합니다. 70 ° c.에 5 ~ 10 분을 위한 혼합물이 열 Amiloride 빛에 민감한으로, 어두운 컨테이너에서 솔루션 C를 유지. 컨테이너 분류 하 고 최대 3 개월까지 4 ° C에서 저장.</li>
			<li>순수한 물 24.36 mL에 산림의 10 밀리 그램을 추가 하 여 10-3 M 산림 솔루션 (재고 솔루션 D)를 준비 합니다. 0.1 mL aliquots 산림 재고 솔루션의 분류 하 고 최대 6 개월 동안-20 ° C에서 저장.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>신선한 솔루션 A1, B1, b 2를 준비 (표 4).<ol>
<li>신선한 솔루션 a 1을 준비 (기저 버퍼링된 소금 솔루션 플러스 10-4 M amiloride) 기저 소금 솔루션 (재고 솔루션 A)의 10 mL 한 10-2 M amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C)의 0.1 mL을 추가 함으로써. 컨테이너 분류 하 고 준비의 24 시간 이내에 사용.</li>
		<li>신선한 솔루션 B1 준비 (염화 버퍼링 솔루션 플러스 10-4 M amiloride) 염화 무료 버퍼링된 소금 솔루션 (재고 솔루션 B) 10 mL 및 10-2 M amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C)의 0.1 mL를 추가 하 여. 컨테이너 분류 하 고 준비의 24 시간 이내에 사용.</li>
		<li>신선한 솔루션 B2 준비 (염화 무료 버퍼링된 소금 솔루션 플러스 10-4 M amiloride, 10-5 M 산림) 염화 무료 버퍼링된 소금 솔루션 (재고 솔루션 B) 10 mL 및 10-2 M의 0.1 mL를 추가 하 여 amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C) 그리고 10-3 M 산림 솔루션 (재고 솔루션 D)의 0.1 mL. 컨테이너에 레이블을 고 준비의 2 시간 이내에 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>소금</td>
			<td>mM</td>
			<td>분자량</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>글 루 콘 산 나트륨 (monosodium 소금)</td>
			<td>135</td>
			<td>218.1</td>
			<td>29,444</td>
		</tr>
<tr>
<td>글 루 콘 산 칼슘 (무수 분말)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0.947</td>
		</tr>
<tr>
<td>마그네슘 황산 염 heptahydrate (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dipotassium 인산 염 (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monopotassium 인산 염 (KH2포4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 염화 무료의 버퍼 솔루션 (재고 솔루션 B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> 그림 2 : 비 강 점 막의 관류 동안 마우스의 위치. 그림에서는 (a)가 열 패드, 전압계 (b), 뒷 다리 (c)는 인접 (d), 연동 펌프는 베개 (f)의 원심 (e) 매장에서 피하 공간에 삽입 참조 전극 그리고 침대 시트 (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
2. 평가 및 테스트 기간 동안 관리
<ol><li>실험적인 체제를 준비 합니다.<ol>
<li>측정 설치 (18.8 x 37.5 cm; 한 생리 적인 온도에서 유지 두 난방 패드를 사용 하는 동안 그리고 테스트 후 저체온증을 방지 하기 위해 그림 2 는), 그리고 다른 하나 (15.5 x 15.5 c m)는 동물 시험의 끝에 복구에 대 한 배치 됩니다 상자.</li>
		<li>데이터 캡처 데이터 메모리 높은 입력된 임피던스에 연결 된 소프트웨어와 함께 로드 된 컴퓨터에서 전환 (&gt; 1012Ω)와 고해상도 (0.1 mV) 전압계 (그림 2b).</li>
		<li>전극은 전압계에 연결 합니다. 그림 2c와 같이 긍정적인 측정 전극 비 강 카 테 터와 뒷 다리에 피하 공간에 삽입 된 카 테 터를 부정적인 참조 전극에 연결 합니다.</li>
		<li>딥 크림 믹스에서 함께 전극의 팁. 초기 전극 오프셋된 값을 확인 합니다. 값 (±) 2 mV 보다 크면 전극 거부 (이상적으로 0 mV).</li>
		<li>연동 펌프에 전환 하 고 그림 2에서 볼 수 있듯이 위치, 펌프 튜브를 삽입 합니다.</li>
		<li>비 강 관류 (그림 2d)에 대 한 선택 된 솔루션에 포함 된 유리병에 펌프 튜브의 인접 콘센트를 연결 합니다. (그림 2e) 비 강 카 테 터의 관류 루멘에 펌프 관의 원심 콘센트를 연결 합니다.</li>
		<li>비 강 카 테 터의 한 루멘 전해질 크림 믹스 10 µ L 피 펫 팁을 통해에 채우십시오. 적응을 실리콘 튜브 커넥터 (그림 1e) 카 테 터, 커넥터 크림 믹스와 커넥터 (그림 1f)에 긍정적인 전극 삽입. 측정 전극 브리지 오프셋된 값을 확인 합니다. 값이 (±) 2 mV 보다 큰 다리를 거부 (이상적으로 0 mV).</li>
		<li>신선한 솔루션 a 1 비 강 카 테 터의 두 번째 루멘을 채우십시오. 유리병을 포함 하는 솔루션 10에 해당 하는 코 카 테 터의 길이 채우기 위해 A. 반대로 연동 펌프의 방향에서 비 강 카 테 터의 끝을 찍어 관류의 s. 참고:이 허용 기저 PD 값 10에 대 한 기록 amiloride를 적용 하기 전에 s. (그림 1) 참조 전극의 커넥터 안에 크림 믹스에서 비 강 카 테 터의 끝을 찍어.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스 처리를 시작 합니다.<ol>
<li>마우스 무게를 계산 하는 복 (ip) 노선17에 의해 주입에 마 취약의 정확한 복용량을 기록 합니다.</li>
		<li>26 G (0.45 x 10 m m) 바늘을 사용 하 여 주사 마 취의 유도 홍보 하는 intraperitoneally premedication: 5 mg/mL midazolam의 50 µ L의 고정된 복용량. 5 분 기다립니다.</li>
		<li>마 취 믹스를 준비 (각각, 펜타닐, medetomidine, droperidol 0.05, 0.40, 및 20 mg/kg의 최종 농도에 몸 무게와 0.375 µ g의 고정 된 복용량에서 clonidine) 최적의 고 안정적인 깊이 마 취 (단계 III, 비행기 2)17 수 있도록 . Intraperitoneally, 마 취 믹스의 볼륨을 주입 하 고 clonidine의 볼륨을 주입. 참고: 15 분 후 마우스 자 고 마 취 30 분 이상 지속 될 수 있습니다.</li>
		<li>3 cm 넓은 '베개' (그림 2f) 마우스 머리에 대 한 지원으로 (그림 2는) 난방 패드의 상단 부분을 다룰 것입니다 수 있도록 조직 흡수의 시트를 접어.</li>
		<li>생리대 흡수 하는 조직 ('침대 시트';의 시트와 커버 그림 2 g). 난방 패드에 그것의 뒤에 마우스를 놓는다. 테이프는 사지 및 꼬리 (그림 2).</li>
		<li>뒷 다리의 피하 공간에서 참조 정 맥 카 테 터 (그림 1g)을 삽입 합니다. 바늘을 제거 하 고 실리콘 튜브 커넥터 (그림 12 c e) 적응.</li>
		<li>카 테 터와 커넥터 크림 믹스 및 커넥터 (그림 1f)에서 부정적인 전극 삽입.</li>
		<li>카 테 터 및 전극으로 어떤 변위를 방지 하는 데 필요한 테이프와 수정. 기준 전극과 다리의 배치, 후 IV 카 테 터의 커넥터 내부 전극 크림 믹스에서 비 강 카 테 터의 끝을 담거 서 측정 전극 브리지 오프셋된 값을 다시 확인 합니다. (이상적으로 보다는 더 적은 (±) 2 mV) 안정적인 최종 오프셋된 값을 기록 합니다.</li>
		<li>"부드러운" 테이프에 흡수 하는 조직 ('베개' (그림 2f)과 '침대 시트';의 2 개 조각 사이 공간에서가 열 패드와 마우스 귀를 수정 (그림 2g)). 눈을 건드리지 않고 털 (뻣 뻣 한 머리카락 콧구멍 근처 성장)을 수정.</li>
		<li>구강에서 액체를 흡수 하는 혀 옆으로 (그림 3는) 이동 하 고 필터 종이 ('파이프';의 뾰족한 심지를 삽입 그림 3 b) 입에 약 1 cm. 유동성 부족 perfused 콧구멍을 흡수, 필터 종이 ('손수건';의 두 번째 조각 장소 그림 3 c) 코 끝에서 개최.</li>
		<li>입의 내부와 접촉 하 여 비 강 카 테 터의 끝을 배치 하 여 상피 잠재력의 긍정적인 제어 값을 확인 합니다. 참고: 읽기 해야 안정적이 고-10 사이의 범위 mV와-20 mV.</li>
		<li>좋은 직접 조명 아래 좋은 집게와 그것을 잡고, 섬세 하 게 비 강 카 테 터에 소개 4-까지 한 콧구멍 mm 코에서에서 6 팁. 참고: 비 강 PD 카 테 테 르는 최대한 안정 기준선 PD 값17,20를 주는 위치에 중간 비 강 외에 있습니다.</li>
		<li>마 취 약물의 주입 후 5 분 부드럽게 동물 머리 아래쪽으로 약 30 °에 의해가 열 패드를 기울기. 최대한 기초 PD 값을 모니터링 합니다.</li>
		<li>때 그것은 약 30의 기간 동안 안정적인 s, 시작 10 µ L의 일정 한 속도로 비 강 점 막 perfusing / 분, 4 버퍼 솔루션 (A, A1, B1, B2) 연속에서. 10에 대 한 첫 번째 솔루션 (단계 1.3.1.1) perfuse s 고 각 다음 솔루션 (1.4 단계) 5 분 또는 때까지 안정적인 값에 도달 했습니다. 산림 (B2) 과도 산림 응답 추락 시작 될 때 perfusing 중지 합니다.</li>
		<li>기록 데이터에 대 한 1 s 간격을 선택 합니다. 관류 시작의 시간에 데이터를 기록 하는 시작 합니다. 컴퓨터 화면에 시간의 기능으로 데이터를 표시 합니다.</li>
		<li>중지 데이터 캡처 솔루션 B2 관류의 끝에. 스프레드시트 파일로 데이터를 저장 합니다.</li>
		<li>마지막 오프셋된 값을 빼서 올바른 데이터입니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> 그림 3 : 비 강 카 테 터와 필터 종이 생리대에 마우스의 장소에 위치. 그림 옆으로 (a)는 파이프 (b), 손수건 (c)를 넣어 혀를 보여 줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. 테스트 후 평가 및 관리
<ol><li>난방 장치 패드에서 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>'침대 시트'와 마우스 코를 닦아 (그림 2g).</li>
	<li>Intraperitoneally 주사 마 취 적 믹스 naloxone, 경쟁력 있는 모 르 핀 길 항 제, atipamezole, medetomidine 특정 해독 제 (2 mg/kg 체중)의 고정 된 복용량 (4 µ g)의 구성.</li>
	<li>일반적으로 1 ~ 2 시간 후 관찰 하는 전체 복구까지 복구 상자에서 작은 손 난로에 마우스를 놓는다. 참고: UCL 실험실에서 약 10% 사망률, 주로 bronchoaspiration, 테스트 기간 동안 비 강에 끼얹는다 솔루션의 관련은 관찰 성별 또는 유전자 형에 관계 없이.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서의 목적은 이온 운송업 자, 주로 CFTR 그리고 ENaC의 무결성을 테스트 하는 데 필요한 시간의 길이 대 한 자발적 호흡 생쥐에서 솔루션의 지속적인 관류에서 비 강 PD를 측정 하기 위한 적절 한 프로토콜을 설명 하는 것입니다. 프로토콜의 모든 단계 완전 동물 복구 및 좋은 품질 및 재현성 데이터도 최적화 되었습니다. 특히, 중요 한 단계는 마 취 평가 및 관리, 그리고 적절 한 동물 위치 그리고 시험 동안에 관심.
비행기 2 단계 III 칵테일 혼합물을 적용 하 여 얻을 수 있는 마 취 노출의 사용17, 여기 보여 이전 연구는 일반 호흡과 부정적인 inotropic 효과 블 링크, 동 공 및 페달의 부재와 관련 철수의 반사 마 취 깊이의이 수준, 비 강 카 테 터 좋은 공차와 제자리에서 연속 관류 비 강에의 한 측정 전극의 교량으로 사용 하기 위해 보관 수 있습니다. 또한, 기준 전극의 다리 역할 피하 공간에...

거의 3 년간 전기 잠재적인 차이 (PD) 측정 원심 항공1의 대표로 서 비 강 점 막에 표현 하는 막 횡단 이온 전송기의 기능 상태를 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 둘 다의 꼭대기 막에 지역화 다단계 동적 테스트2,3, 코 PD 수 있습니다 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)과 상피 나트륨 채널 (ENaC) 활동의 기능 해 부 상피 세포 하 고 기도 표면 수 분에 중요 한 역할을 발휘. 비 강 PD 테스트의 주요 임상 응용 프로그램은 CF, 유럽 국가에 1 개 2500 라이브 출생의 평균 발생률과 백인 인구에 있는 가장 일반적인 치명적인 유전 질환의 진단에 도움을. 테스트는 오랫동안 감쇠, oligo 또는 모노 증상 형태 일반적으로 나중에 진단 하는 CF와 CF 관련 장애 vas deferens, 특 발성 만성 췌 장 염, 알레르기의 선 천 성 양측 부재 등의 진단에 도움이 입증 bronchopulmonary aspergillosis, 그리고 기관지 확장 증4. 더 최근에, 기본적인 CFTR의 치료 변조의 clinometric 평가5,6,7,,89,10,11 결함 ,12,,1314,,1516 새로운 CF 치료의 임상 시험에서 비 강 PD의 사용 했다. 전 임상 설정에서 테스트 새로운 CF 대상 치료18,19,,2021의 bioactivity의 조사 수 있도록 마우스17 에 적응 되었습니다. 마우스에는 기술은 이다 섬세 한, 설치류와 인간 사이 코 영역의 크기에 종 관련 해 부 차이 설치류에 nasofacial 지역에서 감각 입력의 필수적인 역할에 주로 기반으로. 그것은 훈련 되 고 숙련 된 운영자, 전용된 장비 및 공급을 요구 한다.
CF는 전 샘의 다중 조직 장애는 만성 호흡기 질환에서 임상 그림을 지배 하고있다. 질병은 인코딩 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 유전자에 돌연변이 의해 발생-규제 CFTR 염화 물 채널22. 날짜 하려면, 2000 개 이상의 CFTR 돌연변이 발견된23되었습니다. 가장 일반적인 돌연변이24,25, CF 대립 유전자의 거의 90%에서 발견 위치 508 (F508del-CFTR) 단백질의 polypeptide 사슬에서에서 페닐알라닌의 삭제에 해당 합니다. CFTR 단백질은 순전히 저항 작은 전도성 염화 물 채널 이다. CFTR 다른 전송 메커니즘, 특히 ENaC26,27을 조절 하는 상당한 증거가 있다. 결함이 전해질 수송, CFTR 종속 염화 전도도 감소 등 증가 ENaC 종속 나트륨 전도성, CF epithelia의 특징 이다. 전 결함 감소 또는 폐지 repolarization 전기 그라데이션 좋아하는 염화 경과 isoprenaline (는 β-아드레날린 길 항 제는 세포내 cAMP를 증가) 또는 산림 (는 adenylate의 추가에 의해 반영 된다 있고 주 작동 근, 임상 사용을 위해 승인 되지). 후자의 결점은 비 강 점 막 (더 부정적인 PD)와 amiloride, ENaC28을 차단 하는 뇨 제 약물에 대 한 증가 응답의 기저 hyperpolarization에 의해 반영 됩니다.
CF 마우스 모델 자주 CF 연구에 사용 되 고 CF 병 리 해 부에 귀중 한 되었습니다. 요즘, 적어도 15 모델 설명된29, 중 3 개는 되는 가장 임상 관련 F508del 돌연변이30,,3132homozygous 되었습니다. 이 세30, 로테르 담의 에라스무스 대학에서 개발 중 대학교 catholique 드 루 뱅 (UCL) 실험에서 거의 20 년 동안 사용 되었습니다. Cftrtm1Eur 모델30 CF 질병의 multiorgan 이상 공부 하 고 새로운 치료 전략18,,1920의 효능을 테스트 하는 매우 유용한 것으로 입증 되었습니다. 21. 동안 또는 후 초기 수많은 문제가 발생할 수 있습니다 (< 24 h) 쥐에서 비 강 PD 테스트. 이 논문에서는, broncho-코에 끼얹는다 솔루션의 포부를 피하는 비 강 카 테 터에 현장에서 지속적인 관류 및 측정값에 대 한 유지에 필요한 마 취의 적절 한 깊이 설명 되어 있습니다. 테스트의 끝에 동물 보호, 빠르게 반전 하는 완전 한 복구는 동물의 마 취로 이어지는 마 취 약물의 해독의 조합의 관리를 포함 하 여 설명 이기도 합니다. 이러한 절차 자발적 호흡 마우스, 감소 테스트 관련 사망률과 같은 동물에 테스트 반복에 신뢰성 높은 측정을 허용 합니다. 비 강 PD 테스트와 야생-타입 마우스는 CF에서에서 가져온 대표적인 데이터는 표시 하 고 논의.
Murine 코 PD 테스트 프로토콜은 3 개의 회의에 보고: 평가 및 관리 하기 전에, 하는 동안, 그리고 테스트 후. 사전 테스트 평가 및 관리, 지속적인 비 강 관류에 대 한 사용 되는 솔루션의 이중 루멘 비 강 카 테 터의 준비의 프로토콜 자세히 설명 되어 있습니다. 평가 시험의 관리 부분 동안 실험 설정 및 마우스의 처리는 일 분 해 부. 마지막으로, 전체 동물 복구를 향상 시키기 위해 테스트의 끝에 동물의 관리를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Portex 폴리에틸렌 튜브&nbsp;</td><td>Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500; 2.0mm ID, 3.0 mmOD</td><td>비강 프로브용 모세관 준비</td></tr><tr><td>전극 크림</td><td>Parker, Fairfield, NJ, USA</td><td>Redux 크림</td><td>전극 다리</td></tr><tr><td>Ag/AgCl 전극</td><td>Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td><td>JNS131-1,0</td><td>측정 및 참조 전극</td></tr><tr><td>아밀로라이드 염산염</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>A7410</td><td>관류 용액 준비</td></tr><tr><td>forskolin</td><td>시그마, 세인트루이스, 미시건, 관</td><td>류 용액</td>Knick Portamess 전압계 Elektronisch Me&beta를 준비하는 미국 <td>F6886</td></tr><tr><td></td><td>; 게르&아우믈; te, Berlin, Germany</td><td>Portavo 904 pH</td><td>로 전위차 측정</td></tr><tr><td>Paraly SW 112 소프트웨어&nbsp;</td><td>Elektronisch Me&beta; 게르&아우믈; 테, 베를린, 독일</td><td>Paraly SW112 소프트웨어는</td><td>전위차 데이터</td></tr><tr><td>미다졸람을 캡처합니다&nbsp;</td><td>Mylan, Hoeilaart, Belgium</td><td>Dormicum 15mg/3ml</td><td>는 마취제 사전 약물로 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td><td>는 마취제로 사용됩니다</td><td></td></tr>. <tr><td>Medetomidine</td><td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td><td>Domitor 1 mg/ml</td><td>는 마취제로 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>droperidol&nbsp;</td><td>얀센&nbsp; Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td><td>마취제 clonidine으로 사용</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td><td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td> <td>마취제</td></tr><tr><td>참조 IV 카테터</td><td>역할을 하는 Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td><td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td><td>는 전극 브리지를 구축하기 위해</td></tr><tr><td>집게&nbsp;</td><td>Fine science Tools, 하이델베르크, 독일</td><td>Dumont #5,</td><td>비강 카테터 naloxone을 배치하는</td>Fine science Tools</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Braun Medical, 벨기에 브뤼셀</td><td>Narcan, 0.4 mg/ml</td><td>, 마취 길항제</td></tr><tr><td>아티파메졸 역할&nbsp;</td><td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td><td>Antisedan, 5 mg/ml</td><td>, 메데토메딘 특정 해독제 역할을 합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>발열 패드&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td><td>테스트 중 및 테스트 후 저체온증을 피하기 위해</td></tr><tr><td>연동 펌프 P1</td><td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td><td>18111091</td><td>마우스 코에 용액을 관류하기 위해</td></tr><tr><td>시아 노 아크릴 레이트 접착제</td><td>Loctite, Henkel, D &uuml; 독일 셀도르프&nbsp;</td><td></td><td>코 프로브</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0926S-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>M7304</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551128</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551139</td><td>제약 등급, USP</td></tr><tr><td>Na 글루코네이</td>트 <td>시그마, 세인트루이스, 미시건, 미국</td><td>S2054</td><td>제약 등급, USP</td></tr><tr><td>캘리포니아 글루코네이</td>트 <td>시그마, 세인트루이스, 미시건, 미국</td><td>C8231</td><td>제약 등급, USP</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>시그마, 세인트루이스, 미시건, 미국</td><td>RES0089M-A7</td><td>제약 등급, USP</td></tr><tr><td>BD 바늘&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, 미국</td><td>BD 26G(0.45x10mm)</td><td>복강내 주사</td></tr></tbody></table>

마우스에 트랜스 상피 이온 수송 계량 비 전위차

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

비 강 잠재적인 차이 테스트 낭 성 섬유 증 (CF)의 진단에 도움을 거의 3 수십 년 동안 사용 되었습니다. 그것은의 경우에 도움이 될 감쇠, 일반적으로 나중에 진단 하는 CF와 CF 관련 장애 vas deferens, 특 발성 만성 췌 장 염, 알레르기의 선 천 성 양측 부재 등의 oligo 또는 모노 증상 형태 입증 bronchopulmonary aspergillosis, 그리고 기관지 확장 증입니다. 임상 및 전 임상 설정에서 테스트로 cf. Adapting 마우스를 테스트에 대 한 타겟된 치료 전략에 대 한 응답을 측정 하는 바이오 마커 도전 이며 관련된 사망률을 수반할 수 있습니다 사용 되었습니다. 이 문서는 비 강 카 테 터에 현장에서 지속적인 관류에 대 한 유지 하는 데 필요한 마 취의 적절 한 깊이 설명 합니다. 그것을 코에 끼얹는다 솔루션의 broncho-열망을 피하기 위해 조치를 나열 합니다. 그것은 또한 빠르게 반전 하는 전체 복구는 동물의 마 취로 이어지는 마 취 약의 해독의 조합의 관리를 포함 하 여 테스트의 끝에서 동물 관리를 설명 합니다. 대표적인 데이터는 CF와 CF와 CF 비 사이 차별 테스트 야생-타입 마우스 쇼에서 가져온. 모두, 여기에 설명 된 프로토콜 신뢰할 수 있는 측정 가능 줄이면서 동일한 동물에 여러 테스트로 서 저절로 호흡 쥐, 트랜스 상피 나트륨과 염화 물 전송기의 기능 상태의 테스트 관련 사망입니다.

CF에서 특성 이온 수송 이상을 설명 하기 위해 비 강 PD 측정 수행한 다음 위에서 설명한 F508del CF 마우스와의 브뤼셀 식민지의 유전 배경 FVB/129의 야생 유형 제어 프로토콜 Cftrtm1Eur 마우스30. 가장 일반적인 및 가장 심각한 F508del CFTR 돌연변이23,,2425, 중 하나를 품고이 임상 관련 모델은 최고의 현재 CF 마우스 모델30,31, 32.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

여기, 선물이 쥐에서 코 전위차를 측정 하는 프로토콜. 테스트는 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 및 상피 나트륨 채널 같은 막 횡단 이온 전송기의 기능을 단정. 그것은 낭 성 섬유 증에 대 한 새로운 치료의 효능을 평가 하기 위해 중요 합니다.

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

비강 전위차는 낭포성 섬유증을 모델링하는 형질전환 마우스의 표현형을 특성화하는 유용한 방법입니다. 이를 통해 낭포성 섬유증에 대한 새로운 유형의 치료법의 효능을 조사할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 지속적으로 사육하는 마우스에서 신뢰할 수 있는 측정을 제공한다는 것입니다.관련 폐사율을 줄이고 동일한 동물에서 테스트를 반복할 수 있습니다. 이중 내강 비강 카테터를 준비하려면 20cm 길이의 폴리에틸렌 튜브의 중간을 당길 수 있을 만큼 부드러워질 때까지 약 10-15초 동안 화염 속에 두십시오. 그런 다음 양쪽 끝을 당겨 길이가 약 15cm이고 외경이 0.1mm인 매우 얇은 모세관 튜브를 비강 프로브를 얻습니다.그런 다음 순수한 에탄올로 두 개의 모세혈관을 청소하고 탈지합니다. 테이프로 결합하고 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 함께 붙입니다. 면도날로 프로브의 초과 길이를 잘라내어 약 8cm 길이의 이중 루멘 카테터를 얻습니다.그런 다음 양쪽 내강을 통해 물을 주입하여 투과성이 있는지 확인하고 팁에서 5mm 거리에 표시를 합니다. 그 후, 전해질 크림과 포화 3몰 칼륨 용액을 1:1의 비율로 혼합하여 작은 기포가 형성되지 않도록 크림 믹스를 준비합니다. 실험 설정의 경우 테스트 중 및 테스트 후에 저체온증을 방지하기 위해 두 개의 가열 패드를 사용하는데, 하나는 측정 설정용이고 다른 하나는 테스트가 끝날 때 회수를 위해 동물을 넣을 상자에 사용합니다.데이터 메모리, 높은 입력 임피던스 및 고해상도 전압계에 연결된 컴퓨터를 켭니다. 그런 다음 데이터 캡처를 위해 소프트웨어를 엽니다. 전극을 전압계에 연결합니다.전극 끝을 크림 믹스에 함께 담그십시오. 초기 전극 오프셋 값을 확인하고 값이 플러스 또는 마이너스 2밀리볼트보다 큰 경우 전극을 거부합니다. 그런 다음 연동 펌프를 켜고 펌프 튜브를 비강 카테터의 관류 내강에 삽입합니다.비강 카테터의 1루멘을 10마이크로리터 피펫 팁을 통해 전해질 크림 혼합물로 채웁니다. 카테터를 실리콘 튜브 커넥터에 맞추고 커넥터를 크림 믹스로 채웁니다. 그런 다음 커넥터에 양극을 삽입하십시오.측정 전극 브리지 오프셋 값을 확인하고 값이 플러스 또는 마이너스 2밀리볼트보다 큰 경우 브리지를 거부합니다. 그런 다음 펌프 튜브의 근위 배출구를 비강 관류를 위해 선택한 용액이 들어 있는 바이알에 연결합니다. 그런 다음 펌프 튜브의 원위 출구를 비강 카테터의 관류 내강에 연결합니다.다음

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

electroolfactogram (EOG) 녹음은 후각 상피의 수준에서 후각 기능을 평가의 유익 - 실시 - 쉽고 안정적​​인 방법입니다. 이 프로토콜은 녹음 설정, 마우스 조직 준비, 데이터 수집, 그리고 기본적인 데이터 분석을 설명합니다.

에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

이 프로토콜은 살아있는 두뇌의 세포 외 공간 (ECS)의 물리적 매개 변수를 측정하는 방법 인 실시간 이온 삼투압을 설명합니다. ECS로 방출 된 불활성 분자의 확산은 ECS 부피 분율 및 비틀림을 계산하는 데 사용됩니다. 그것은 뇌의 ECS에 대한 급격한 가역적 인 변화를 연구하는데 이상적입니다.

뇌의 세포 외 공간의 부피비와 비틀림을 정량화하기위한 테트라 메틸 암모늄을 이용한 실시간 이온 도입

이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

여기, 우리 코 전위차 (NPD)를 측정 하는 표준화 된 프로토콜을 제시. 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)과 상피 나트륨 채널 (ENaC) 기능 평가 전압에서 변화에 의해 비 강 상피에서 이온 채널 활동을 수정 하는 솔루션의 superfusion 후 제공 하는 결과 측정입니다.

코 막 Transepithelial 잠재력 차이 (NPD)의 표준화 된 측정

장 상피는 영양 흡수뿐만 아니라 유해 물질에 대한 보호를 제공합니다. 정점-대부분의 상피 세포간 접합, 즉 타이트한 접합은 부세포 용질 및 이온 투과성을 조절한다. 여기에서, 점막 시트의 제조 및 어싱 챔버 기술을 사용하여 타이트한 접합부의 이온 선택성의 평가를 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

챔버 기술을 사용하여 기본 조직의 장 타이트 접합 장벽 및 이온 투과성의 기능 평가

여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

이 프로토콜은 막 전위의 변화를 측정하여 전기적 막 단백질을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 상피 세포주에서 내인성으로 발현되는 여러 이온 채널의 기능적 판독을 위한 플랫폼을 제공합니다.

두 개의 상피 세포주에서 두 개의 내인성 이온 채널에 대한 고처리량 기능 연구를 위한 막 전위의 형광 기반 분석

배우세요 마우스 비강 전위차 측정법으로 낭포성 섬유증 치료제 효능을 평가하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 이온 수송체 기능을 정량화하여 생쥐 모델에서 신뢰할 수 있는 데이터를 제공합니다.

마우스에 트랜스 상피 이온 수송 계량 비 전위차

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