마우스에 트랜스 상피 이온 수송 계량 비 전위차

비강 전위차는 낭포성 섬유증을 모델링하는 형질전환 마우스의 표현형을 특성화하는 유용한 방법입니다. 이를 통해 낭포성 섬유증에 대한 새로운 유형의 치료법의 효능을 조사할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 지속적으로 사육하는 마우스에서 신뢰할 수 있는 측정을 제공한다는 것입니다.

관련 폐사율을 줄이고 동일한 동물에서 테스트를 반복할 수 있습니다. 이중 내강 비강 카테터를 준비하려면 20cm 길이의 폴리에틸렌 튜브의 중간을 당길 수 있을 만큼 부드러워질 때까지 약 10-15초 동안 화염 속에 두십시오. 그런 다음 양쪽 끝을 당겨 길이가 약 15cm이고 외경이 0.1mm인 매우 얇은 모세관 튜브를 비강 프로브를 얻습니다.

그런 다음 순수한 에탄올로 두 개의 모세혈관을 청소하고 탈지합니다. 테이프로 결합하고 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 함께 붙입니다. 면도날로 프로브의 초과 길이를 잘라내어 약 8cm 길이의 이중 루멘 카테터를 얻습니다.

그런 다음 양쪽 내강을 통해 물을 주입하여 투과성이 있는지 확인하고 팁에서 5mm 거리에 표시를 합니다. 그 후, 전해질 크림과 포화 3몰 칼륨 용액을 1:1의 비율로 혼합하여 작은 기포가 형성되지 않도록 크림 믹스를 준비합니다. 실험 설정의 경우 테스트 중 및 테스트 후에 저체온증을 방지하기 위해 두 개의 가열 패드를 사용하는데, 하나는 측정 설정용이고 다른 하나는 테스트가 끝날 때 회수를 위해 동물을 넣을 상자에 사용합니다.

데이터 메모리, 높은 입력 임피던스 및 고해상도 전압계에 연결된 컴퓨터를 켭니다. 그런 다음 데이터 캡처를 위해 소프트웨어를 엽니다. 전극을 전압계에 연결합니다.

전극 끝을 크림 믹스에 함께 담그십시오. 초기 전극 오프셋 값을 확인하고 값이 플러스 또는 마이너스 2밀리볼트보다 큰 경우 전극을 거부합니다. 그런 다음 연동 펌프를 켜고 펌프 튜브를 비강 카테터의 관류 내강에 삽입합니다.

비강 카테터의 1루멘을 10마이크로리터 피펫 팁을 통해 전해질 크림 혼합물로 채웁니다. 카테터를 실리콘 튜브 커넥터에 맞추고 커넥터를 크림 믹스로 채웁니다. 그런 다음 커넥터에 양극을 삽입하십시오.

측정 전극 브리지 오프셋 값을 확인하고 값이 플러스 또는 마이너스 2밀리볼트보다 큰 경우 브리지를 거부합니다. 그런 다음 펌프 튜브의 근위 배출구를 비강 관류를 위해 선택한 용액이 들어 있는 바이알에 연결합니다. 그런 다음 펌프 튜브의 원위 출구를 비강 카테터의 관류 내강에 연결합니다.

다음으로, 비강 카테터의 두 번째 내강을 새 용액 A1으로 채웁니다. 용액이 들어 있는 바이알에 비강 카테터의 끝을 담그십시오.A.연동 펌프의 방향을 반대로 하여 10초의 관류에 해당하는 비강 카테터의 길이를 채웁니다. 그런 다음 흡수 조직 시트를 접어 마우스 머리를 지지하는 데 사용할 3cm 너비의 베개를 만듭니다. 흡수 조직 시트로 가열 패드를 덮으십시오.

그런 다음 마우스를 가열 패드에 등을 대고 놓고 팔다리와 꼬리를 패드에 테이프로 붙입니다. 그 후, 뒷다리의 피하 공간에 참조 정맥 카테터를 삽입합니다. 바늘을 제거하고 실리콘 튜브 커넥터에 적응합니다.

카테터와 커넥터를 크림 믹스로 채웁니다. 다음으로, 양극 측정 전극을 비강 카테터에 연결하고 음극 참조 전극을 동물의 뒷다리 피하 공간에 삽입된 카테터에 연결합니다. 그런 다음 변위를 방지하기 위해 필요에 따라 카테터와 전극을 테이프로 고정합니다.

기준 전극과 브리지를 배치한 후 비강 카테터의 끝을 IV 카테터의 커넥터 내부에 있는 전극 크림 믹스에 담궈 측정 전극 브리지 오프셋 값을 다시 확인합니다. 안정적인 최종 오프셋 값을 기록합니다. 이제 두 흡수 조직 사이의 여유 공간에서 발열 패드에 테이프로 마우스 귀를 고정하십시오.

눈을 건드리지 않고 생동감을 고정합니다. 구강에서 체액을 흡수하려면 혀를 옆으로 움직여 약 1cm 정도의 뾰족한 여과지 심지를 입 안으로 넣는다. 관류된 콧구멍에서 흘러나오는 액체를 흡수하려면 두 번째 여과지를 콧구멍에 놓습니다.

비강 카테터 끝을 입 안쪽에 삽입하여 상피 전위의 자세 조절 값을 확인합니다. 가는 집게로 잡고 직사광선이 잘 들어오는 곳에서 코끝에서 최대 4-6mm 떨어진 한쪽 콧구멍에 비강 카테터를 섬세하게 삽입합니다. 마취제를 주입한 후 5분 후에 동물의 머리를 아래로 향하게 하여 발열 패드를 약 30도 정도 부드럽게 기울입니다.

최대 기초 PD 값을 모니터링합니다. 30초 이상 안정되면 4개의 완충 용액을 연속적으로 사용하여 분당 10마이크로리터의 속도로 코 점막을 관류하기 시작합니다. 첫 번째 용액을 10초 동안 관류하고 다음 용액을 각각 5분 동안 또는 안정적인 볼륨에 도달할 때까지 관류합니다.tage에 도달했습니다.

일시적인 Forskolin 응답이 내려가기 시작하면 Forskolin 관류를 중지합니다. 평가가 끝나면 가열 패드에서 마우스를 놓습니다. 마취제 길항제 혼합물과 함께 투여하고 완전히 회복될 때까지 가열 패드가 있는 회수 상자로 옮깁니다.

다음은 F508 결실 CFTR 돌연변이에 대한 동형접합적, 정상 마우스 및 동형접합 마우스의 대표적인 비강 PD 추적과 비강 PD 매개변수에 대해 얻은 개별 값입니다. 아밀로라이드 반응은 아밀로라이드를 함유한 기저 완충염 용액과 코 점막의 관류 끝과 시작 시 비강 PD 값의 차이입니다. 염화물이 없는 반응은 염화물이 없는 완충염 용액과 아밀로라이드를 더한 코 점막의 관류 끝과 시작 부분의 비강 PD 값 간의 차이입니다.

Forskolin 응답은 염화물 자유로운 완충된 소금 해결책, 플러스 Forskolin 및 amiloride를 가진 코 점막의 관류의 끝과 시작에 코 PD의 가치 사이 다름입니다. 총 염화물 반응은 제로 염화물 관류에서 얻은 마지막 두 매개변수의 합입니다. 이 프로젝트는 마우스뿐만 아니라 말랑말이, 큰 쥐 및 흰 족제비 낭성 섬유증 모델을 탐색하고 제공하는 데 사용할 수 있습니다.

그리고 내시 마우스 모델의 나트륨 수송 배반자. 모든 수송체는 프로토콜을 채택하여 연구할 수 있습니다. 설치류의 비강에서 일하는 것은 코 안면 영역에서 오는 감각 입력의 필수적인 벽 때문에 매우 섬세합니다.

적절한 마취 사멸은 마우스 비강에서 수술할 때 특히 어렵습니다.