애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

물고기 모델은 많은 장점이 있으며 이후 생물 의학 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 개발에서 약물 발견 및 독성학 연구에 이르기까지. 어류 모델의 행동은 환경 및 생물 의학 연구에도 점점 더 많이 사용되고 있습니다.

여기서 환경 생물 의학을 발전시키기 위해 수생 독성학 및 행동 생태학에 대한 수십 년의 연구 경험을 활용하는 것이 특히 중요합니다. 우리의 방법은 화학 물질의 생물학적 특성과 그것이 나타낼 수 있는 이점 및 위험을 이해하는 데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 환경 및 생물 의학 과학에 유용한 화학적 활성을 진단적으로 이해할 수 있는 민감하고 신속한 접근 방식을 제공한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 상업적 생물학적 영향 및 행동 효과의 진단을 지원하기 위한 것입니다. 이러한 화학 물질의 대부분은 종종 중요한 독성 정보가 부족합니다. 그러나 의약품 및 살충제와 같은 다른 화학 물질의 영향을 이해하는 데에도 적용할 수 있습니다.

이 측면은 산업 화합물에 대한 비교 환경 약리학 및 독성학 데이터가 부족한 경우가 많기 때문에 고려하는 것이 중요합니다. 밝고 어두운 사진 기간이 변경되는 동안 유충 운동 활동을 측정하는 것 외에도 이 프로토콜은 유충 광운동 반응을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 빛에서 어둠으로, 그리고 어둠에서 빛으로의 전환 사이의 움직임 차이의 크기를 효과적으로 조사합니다.

먼저 재구성된 경수에 카페인을 녹입니다. 그런 다음 연속 희석을 수행하여 카페인 처리 수준을 낮춥니다. 개별 노출 챔버를 준비하려면 제브라피쉬를 위해 100밀리리터 유리 비커 4개에 20ml의 용액을 붓습니다.

팻헤드 미노우를 위해 3개의 500밀리리터 유리 비커에 200ml의 용액을 붓습니다. 다음으로, 전사 피펫을 사용하여 수정 후 4-6시간 숙성의 제브라피시 배아 10개를 각 비커에 넣습니다. 변형된 이송 피펫을 사용하여 부화 후 24시간 이내에 태어난 10마리의 팻헤드 미노 유충을 각 노출 챔버에 넣습니다.

제브라피시와 팻헤드 피노우 챔버를 인큐베이터에 넣습니다. 96시간 후 개별 물고기를 48웰 플레이트와 24웰 플레이트로 구성된 별도의 웰에 넣습니다. 기록 챔버에 적어도 하나의 애벌레 물고기가 있는 우물 플레이트를 놓습니다.

그런 다음 비디오 추적 소프트웨어에서 파일 생성 프로토콜을 클릭합니다. 대화 상자의 location count(위치 개수) 필드에 웰 플레이트의 개별 웰 수를 입력합니다. 그리고 화면 상단의 OK.At 클릭하고 전체 화면 보기를 클릭합니다.

우물 플레이트의 오버헤드 카메라 뷰를 표시합니다. 그런 다음 그리기 영역 아이콘을 클릭합니다. areas라고 표시된 필드에서 원 아이콘을 선택합니다.

커서를 사용하여 플레이트의 왼쪽 상단 웰에 있는 원형 비디오 추적 영역을 묘사합니다. 오른쪽 상단 표시를 선택하고 오른쪽 상단 우물의 보기 영역을 윤곽을 그립니다. 그런 다음 아래쪽 표시를 선택하여 오른쪽 하단 웰의 윤곽을 그립니다.

웰 추적 영역을 정의한 후 build를 클릭하여 소프트웨어에 나머지 웰의 보기 영역을 설명하라는 메시지를 표시합니다. 보정 영역에서 draw scale을 클릭하고 플레이트를 가로질러 수평선을 그립니다. 선이 그려지면 Calibration measurement라고 표시된 대화 상자가 나타납니다.

이 상자에 웰 플레이트 길이를 입력하고 OK(확인)를 클릭합니다. calibration area(보정 영역)에서 apply to group(그룹에 적용)을 클릭합니다. 도면 관리자를 종료하려면 그리기 영역 아이콘을 클릭합니다. 그런 다음 타일 아이콘을 클릭합니다.

커서를 사용하여 보기 화면에 나타나는 모든 상자를 강조 표시하여 각 상자가 녹색이 되도록 합니다. 보기 및 전체 화면을 클릭합니다. 그런 다음 감지 임계값 상자에서 bkg를 클릭하고 임계값 조정 막대를 사용하여 픽셀 감지 임계값을 설정합니다.

적절한 임계값이 선택되면 그룹에 적용을 클릭합니다. 이동 임계값이라고 표시된 상자에 원하는 이동 속도 추적 매개변수를 입력합니다. 속도 매개변수가 설정되면 그룹에 적용을 클릭합니다.

그런 다음 드롭다운 메뉴에서 Protocol Parameters(프로토콜 매개변수)를 클릭합니다. 대화 상자에서 시간 탭을 선택하고 관측 시간과 적분 시간을 입력합니다. 확인을 클릭하고 매개변수 드롭다운 메뉴에서 경량 주행을 선택하여 조명 드라이버 설정 대화 상자를 엽니다.

각 사진 기간에 대해 밝고 어두운 사진 기간, 시간 및 조명 강도를 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로 관찰 프로토콜을 저장합니다.

먼저 실험용 물고기가 들어 있는 우물 플레이트를 행동 기록 챔버에 놓습니다. 그런 다음 이전에 개발된 추적 프로토콜을 엽니다. 비디오 추적 뷰어에서 모든 유충이 보이는지, 각 웰에 유충이 하나만 있는지, 웰이 정의된 관찰 영역과 정렬되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 실험을 클릭하고 실행합니다. 데이터의 이름과 저장 위치를 지정합니다. 그리고 여러 라이브 이미지 아이콘을 클릭하여 미리 정의된 모든 보기 영역을 강조 표시합니다.

마지막으로 녹음실의 패널을 닫고 배경을 클릭한 다음 컴퓨터 모니터에서 시작을 클릭합니다. 카페인에 96시간 노출된 후, 팻헤드 미노 유충의 광운동 반응은 제브라피쉬보다 낮은 수준의 카페인에 의해 변화되었다. 그러나 현저히 더 많은 수의 광전동기 끝점이 제브라피쉬에서 영향을 받았습니다.

또한 이동 거리, 이동 횟수 및 이동 시간에 대한 세 가지 속도 임계값에 걸쳐 밝은 운동 활동과 어두운 운동 활동을 분석했습니다. 두 종 모두에서 카페인은 운동 종말점에 큰 영향을 미치는 활동을 억제했습니다. 이 절차를 수행하는 동안 행동 분석을 좁고 구체적인 시간 범위와 연결해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

하루 중 시간이 애벌레 물고기의 행동에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 이 절차에 따라 다른 화학 물질의 표준화된 지침에 방법을 적용하여 물고기 행동과 관련된 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 환경 및 생물 의학 관련 표준화된 지침에 따라 독성 생물 분석을 수행할 때 유충 물고기 모델의 행동 및 광운동 반응을 관찰하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

특정 화학 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 프로토콜을 수행할 때 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.