Name: 전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 전체 혈액을 이용한 인간 단핵구 하위 집단의 흐름 세포 분석법을 통한 면역학 연구 방법을. 이 프로토콜은 표준화된 게이팅 전략으로 질병 상태에서 단핵구 비율과 표지자 발현을 정확히 분석할 수 있게 합니다.

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Cytometry 교류 Cytometry 핵심 시설 의료 연구, 웨스트 미드 허브, 암 연구소 뉴 사우스 웨일스, 및 국가 건강 및 의료 연구 위원회 Westmead 연구소에 의해 지원 되는에서 수행 되었다. 이 연구는 임상 화학 연구 및 교육 기금에 의해 지원 되었다.

이 연구는 WSLHD 인간의 연구 윤리 위원회 (HREC) (승인 AU 레드 HREC/15/WMEAD/289)에 의해 승인 되었습니다.
1. 전체 혈액 Cytometry 샘플 준비
참고: 지금까지 인간의 혈액은 잠재적으로 감염에 샘플 설정 biohazard 후드에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>3 mL 에틸렌 diamine tetra 아세트산 (EDTA) 튜브로 참가자 로부터 혈액 샘플을 수집 합니다.</li>
	<li>혈액학 분석기 또는 hemocytometer를 사용 하 여 백혈구 (WBC) 수를 결정 합니다.</li>
	<li>인산 염 버퍼 식 염 수 농도 5 ~ 10 배를 조정 (PBS) (pH ~ 7.4)와 희석6 WBC/mL.</li>
	<li>16 x 50 µ L 혈액의 볼륨, CD14 V450 안티 0.75 µ L, 0.5 µ L CD16-APC, 안티, 0.625 µ L를 결합 하 여 (예를 들어, 14 튜브, 준비 믹스 마스터 x 16) 관의 수에 대 한 충분 한 마스터 믹스를 준비 HLA-DR-PerCP 안티. 소용돌이 피 펫 51.9 µ L 각 튜브 (표 1)로 혼합의. 참고: 항 체 형광 항 체 사용에 대 한 최적의 착 색 농도 결정 하기 위해 적정 한다.</li>
	<li>표면 마커 (m 1와 M2 또는 isotype 제어, phycoerythrin (PE) 표시)을 추가 항 체 (예를 들어 표 2에 의하여)와 PE (CD3) T 세포, B 세포 (CD19), 호 (CD66b), 중구에 대 한 마커 표시 및 자연적인 살인자 (NK) 세포 (CD56) (표 3). 소용돌이 30 분, 4 ° C는 어둠 속에서 품 어. 참고: 세포, 호 중구, 및 NK 세포에 대 한 마커 제어 방법의 유효성 검사에만 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>결합 된 적혈구 세포/WBC 고정 솔루션, 부드럽게 즉시, 소용돌이의 250 µ L을 추가 하 고 4 ° c.에 어둠 속에서 10 분 동안 품 어</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 260 x g 에 아래로 PBS와 스핀 셀 250 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 제거, 다시 1% 포름알데히드의 300 µ L에서 세포를 일시 중단 합니다. 참고: 포름알데히드는 독성이. 니트 릴 장갑 사용 하 고 증기 두건에서 사용.</li>
	<li>빛 으로부터 보호 분석 수행 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다. 참고: 흐름 분석은 시료 준비의 48 h 이내 할 수 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. Cytometry
<ol><li>확인 흐름 cytometer 로그 시설 직원을 보장 하기 위해 품질 관리 검사 수행 했습니다. 참고: 일관성 분석, 악기 품질 관리 및 유지 관리 사이 일관 된 되도록 제어 구슬을 사용 하 여 대상 형광 강도 권장 됩니다.</li>
	<li>클릭 흐름 cytometry 실험을 설정 하려면, "새로운 실험"새로운 견본"그리고"새로운 튜브"튜브를 추가. 아이콘을 클릭 하 여 이항 플롯을 선택 하 고 드롭다운 메뉴를 사용 하 여 축 매개 변수를 선택 합니다. CD16/CD14 플롯 및 인수 모니터링 도면을 표시 시간 함께 검출기의 포함을 확인 합니다.</li>
	<li>튜브를 삽입 하 고 "취득"을 클릭 합니다. 검출기 신호 규모 내려 하지는 확인 악기 전압 설정을 확인 합니다.</li>
	<li>CD14/CD16 플롯의 monocyte 게이트에 세포를 관찰 합니다. 클래식 monocyte 게이트 5000 이벤트 기록 임계값을 설정 하 고 "기록"에 클릭 합니다.</li>
	<li>나머지 튜브에 대 한 기록 데이터를 계속 합니다. 모든 튜브에 대 한 데이터가 기록 되어 후.fcs 파일 분석으로 흐름 데이터를 내보냅니다. 참고: 정확도 보장 하기 위해, 단일 색상 보상 제어 기록 되어야 합니다. 보상 매트릭스 계산 하 고15,16이상의 스펙트럼 유출을 분석 하기 전에 데이터에 적용 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. monocyte 게이팅
<ol><li>분석 소프트웨어에 열기 파일입니다. 더블 튜브 이름 및 앞으로 피해 지역 FSC (A)에 셀 시각화 / 전달 점도 높이 FSC(H) 드롭다운 메뉴에서 선택 매개 변수를 클릭 하십시오. 다각형 게이트 도구 아이콘을 클릭 하 고 (그림 1A)에서 세포를 포함 하 여 더블 릿 제외 게이트를 만듭니다.</li>
	<li>및 새로운 디스플레이에서 상자는 FSC (A)에 셀을 표시 하려면 드롭다운 메뉴 매개 변수를 조정/측면 분산형 SSC(A) 플롯 (두 번 클릭 하 여 문이 지역에) 문이 셀을 선택 합니다. 사각형 게이트 아이콘을 클릭 하 고 아낌없이 세포, NK 세포, 및 granulocytes (그림 1B)의 대부분을 제외 하 고 측면 분산형 속성 기반 monocyte 모집단을 선택.</li>
	<li>문이 셀을 선택 하 고 드롭다운 메뉴를 사용 하 여 매개 변수를 선택 하면 CD14/CD16 음모에 다시 표시. 다각형 게이트 monocytes 그들의 특성 "┐" 모양 (그림 1C)에 따라 선택를 클릭 하십시오.</li>
	<li>문이 셀을 선택 하 고 드롭다운 메뉴를 사용 하 여 매개 변수를 선택 하 여 CD16/HLA-DR 음모에는 monocytes를 표시 합니다. 다각형 게이트 HLA-DR 긍정적인 셀을 선택 하 고 모든 나머지 NK 세포 및 호 중구17 (그림 1D) 제외를 클릭 합니다.</li>
	<li>문이 셀을 선택 하 고 드롭다운 메뉴를 사용 하 여 매개 변수 선택에 CD14/HLA-DR에 HLA-DR 긍정적인 셀 표시. 다각형에 클릭 하 고 (B 세포 표현 하지 CD14 HLA-DR의 상부) HLA-DR 높은/CD14 낮은 셀을 제외 하는 게이트를 그립니다 (그림 1E). 참고: B 세포 오염 발생할 수 있으며 따라서 조사 한다. 그림 1C 에 비 고전 인구 왼쪽 셀에서 고유 하지 않으면 오염 가능성이 높습니다. B 세포는 아닌 클래식 monocytes와 겹치는 하지 경우 단계 3.5를 생략 수 있습니다.</li>
	<li>문이 셀을 선택 하 고 드롭다운 메뉴를 사용 하 여 CD16/CD14 음모에 그들을 표시. 플롯 옵션에서 "얼룩말 음모" monocyte 하위 집합 게이츠 하위 집합의 비율 (그림 1 층)을 결정 하는 그림을 그릴 수 있도록 선택 합니다. 참고: 얼룩말 플롯은 의사 색 (부드러운) 분석 소프트웨어에서 사용할 수 없습니다 또는 등고선 플롯 적합 있을 수 있습니다.</li>
	<li>사각형 게이트 아이콘 클릭 하 고 클래식 monocytes CD14 높은/CD16 낮은, 클래식 monocyte 인구 주위 대략적인 사각형 게이트를 그려서 선택. "표시"에서 "선택 medians" 클래식 monocytes에 대 한 중간 형광 강도 표시. 인구는 왼쪽과 오른쪽 왼쪽에 셀을 모두 포괄에 중간에서는 동등 하 게 분배 되도록 게이트를 조정 합니다.</li>
	<li>사각형 게이트 클래식 게이트의 오른쪽에 있는 셀을 포함 하 여 중간 채우기를 선택 합니다. 완전히 중간 하위 집합에 CD14 식 비교할 수 있도록 고전 monocyte 게이트 내에 있는 동심원의 바닥 문 여 비 고전 셀을 제외 하는 게이트의 하단을 조정 합니다 주요 고전 인구 현재 전문 어와 일치입니다.</li>
	<li>인구 (그림 1 층)의 하단에 모든 셀을 선택 하면 중간 부분 집합의 아래쪽 가장자리에서 직사각형 상자를 그려서 아닌 클래식 하위 집합 게이트.</li>
	<li>"표시"에서 "선택 게이트 주파수" 각 monocyte 하위 집합의 비율을 결정 하.</li>
</ol>4입니다. 방법 게이팅의 유효성 검사
<ol><li>있는지 여부를 확인 잠재적으로 오염 한 세포 유형 효과적으로 문이 아웃, T 세포 (CD3), B 셀 (CD19), 호 중구 (CD66b), 및 NK 세포 (CD56)에 대 한 항 체와 다른 세포 인구를 식별 먼저 (그림 2). 참고: 여기 T 세포 및 호 중구 monocytes의 "┐" 모양 가까이 앉아 고 그림 1C에서 밖으로 문이 있다.</li>
	<li>NK 세포 단계 (그림 1D), 3.4에서에서 제거 되 고 그림 3에서 같이 B 세포 단계 (그림 1E) 3.5에서에서 제거 됩니다 확인 하십시오. NK 세포 나 B 세포 문이 밖으로 하지 않습니다, 다시 게이트를 조정 합니다.</li>
</ol>5. phenotypic Monocyte 마커 식
<ol><li>각 monocyte 하위 집합에서 셀을 선택 합니다. 각 마커 및 그것의 일치 isotype (그림 4) 표시 각 monocyte 하위 집합 (그림 1 층)에 대 한 히스토그램 만들려면 드롭다운 매개 변수를 변경 합니다.</li>
	<li>각 isotype 제어에 비해 각 표식 (중간 또는 기 평균)의 표현 정도 계산 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

전체 혈액 cytometry 세포 감염 및 염증 성 조건에서 그들의 역할에 대 한 통찰력을 제공 그들의 생리 적 microenvironment에 가까운 조건에서 검사는 monocytes를 공부 하는 이상적인 접근 이다. 또한, 신선한 (즉, 처리 되지 않은)를 사용 하 여 변경 또는 셀 변환이 저장 또는18,19, 동결 해 동 monocytes 발생 하는 것으로 알려져 그 같은 처리 발생 수를 최소화 하는 혈액 샘플 20. 프롬프트 샘플 준비로 일부 마커 upregulated 샘플19처리 전에 실 온에서 보관 하는 경우 것이 좋습니다. M1 및 M2 마커의 최적 농도 적정에 의해 결정 되었다 그리고 변화의 정도 항 식 예정 이다 고 항 체의 부족에 의해 제한 되지 않습니다 동안 일반적인 바인딩 제한 하 어떤 새로운 항 체에 대 한 수행 해야. 적혈구의 제거 및 백혈구 세포 솔루션의 고정으로 적혈구의 존재는 교류 cytometry21,22방해할 수 있습니다이 프로토콜에서 중요 한 단계입니다. Note는 일부 세포 솔루션 아니 세척 얼룩과 호환 되는, 명확 하 게는 분명 우리 손에 때 세척 단계 데 사용 됩니다.
표현의 monocyte 마커를 비교할 때 교류 cytometer의 올바른 설치 또한 긴요 하다. 연구원 제어 구슬의 일관 된 대상 형광 강도 유지 하 고 다른 일에 실행 하는 다른 샘플에서 일관 된 결과 제공 하는 데 사용할 악기에서 품질 관리를 수행할는 것이 좋습니다. 이, isotype 컨트롤은 일반적인 항 체 바인딩에 의해 생성 된 모든 일반적인 배경 신호 해석에 지원 하기 위해 사용 됩니다. Monocytes Fc 수용 체11 의 높은 수준이 고 따라서 일반적인 바인딩 하는 경향이 있다. 메모의 다른 하위 집합에 대 한 일반적인 바인딩의 수준은 다릅니다 하 고 따라서 isotype 컨트롤의 사용 된다 중요 한 하위 집합 사이 마커 식의 정도 비교할 때.
고려 될 또 다른 중요 한 기준 고용 제어 단계입니다. 일부 연구는 그것이 꽉 게이트는 monocyte 주위 그릴 FSC(A)/SSC(A)에 인구 비 monocytic CD16 긍정적인 세포23,,2425의 대부분의 제거를 플롯만이 일부의 손실로 이어질 수 있습니다 중요 한 제안 monocytes 비 monocyte 셀 FSC/SSC에 monocytes 겹칠 수로26을플롯 합니다. 오히려,는 monocytes를 오염 시킬 수 있습니다 다른 혈액 세포를 제외 하려면 CD14와 CD16, 세 번째 monocyte 마커의 포함 필수26,27이다. 이러한 이유로, HLA-DR은 자주 사용 하 고 NK 세포 또는 호 중구17,28으로 표현 하지는 이상적 이다. 림프 구 (B 세포와 T 세포) HLA-DR을 표현할 수 있습니다, 하지만 그들은 monocytes CD14 식 존경에서에서 다르다. HLA-DR은 이상적인 세 번째 마커, CD865,,2729 추천 되었습니다 또한 하지만 여기 사용 된 M1 표식 이기도 하 고 따라서 monocyte 하위 집합에 식의 정도 평가 했다.
유효성 검사 사용 제어 전략의 중요 한 중요성 이다. NK 세포는 비 classicals와 겹치는 것 그들은28개 문이 아니라는 알려져 있습니다, 하는 동안 우리는 B 세포와 비-classicals (그림 2B); 또한 겹칠 수 있습니다 통지 다른 연구에서 케이스 인지 형광 색소 선택, 악기 구성, 검출기 감도, 또는 심지어 검사 중인 질병 상태에 달려 있습니다. 여기, 겹치는 B 세포 보였다 높은 표현의 HLA-DR 및 그림 1D에 HLA-DR 긍정적인 세포의 선택에 의해 밖으로 문이 안 했다. 오히려, B 세포를 제거 하 우리가 사용 CD14의 추가 줄거리 / HLA-DR, B 세포 비 때문에 그들의 더 높은 HLA-DR classicals에서 분리 하 고 낮은 CD14 식.
또한 여러 가지 방법으로는 스스로 monocytes에 대 한 문 문학;에 그려 왔다 있다 사분면 (하위 사분면 마커로 구분 됩니다), 사각형 또는 사다리꼴 상자13 (별도 상자 각 하위 집합에 대 한 그린)는 또한 하나의 하위 집합 끝과 또 다른 시작을 묘사 하는 그들의 배치에 다 포함 됩니다. 이러한 차이 가능성이 monocytes 셀, 클래식, 클래식에서 차별화의 연속체로 보다 명확 하 게 명료한 인구로 존재 하는 사실을 반영 합니다. 그러나, 스스로 하위 집합을 식별 하기 위한 기법에 유사 계산된 monocyte 하위 집합 비율에 차이가 발생할 수 있습니다, 때문에 그것은 된다 제어 메서드는 보다는 주관적, 객관적 합리적으로이 것입니다. 더 강력 하 고 재현 가능한 메서드를 확인 합니다. 일부 연구 CD16 위한 isotype 제어를 사용 하 여 고아 한 중간 하위30사이 경계를 결정. 다른 한편으로, 중간체 및 비 classicals의 구분을 정의 하려면 그것은 제안 되었습니다 수직 또는 경사, 조사, 재생산이 가능 해야 되 고 단서 하지만 사각형 게이트 선택과 커트 오프 라인 있을 수 있습니다. 연구13,,3031사이의 비교를 촉진 하기 위하여 추천 되었습니다 했다. 여기, 증가 객관성 얼룩말에 데이터 플로팅 객관적인 시각적 규칙을 적용 하 여 얻은 얼룩말 플롯 전통적인 컨투어 플롯을 통해 각 동일한 가능성 빈 색상 그라디언트를 혼합 하 여 추가 시각화 큐를 제공 하기 때문에. 인구는 인구 중간 주위 고르게 분산 되도록 클래식 하위 집합의 오른쪽 테두리 그려 했다. 중간체 및 비 classicals 사이 부분 또한 클래식 인구 내의 동심원의 아래쪽 정렬 중간의 기반에 의해 표준화 되었다 (즉, 중간 인구 명확 하 게 표준 명명법1당 CD14, 높은 수준의 표현).
일부 연구에 따르면 성공적인 열거형 monocytes 그리고 그들의 임상 중요성32,33 공개를 위한 6 sulfo LacNAc (SLAN) 또는 C C chemokine 수용 체 타입-2와 같은 추가 마커로 사용 (CCR2) 제안 하는 동안 우리 손에 많은 monocyte 기능 마커의 표현의 수준 개인14사이 널리 다릅니다. 그런 변이 그들의 식에 따라 하위 집합을 정의 하려면 이러한 마커의 유용성을 제한할 수 있습니다. 자동된 전산 접근 또한 시각화 하 고 monocyte 하위 집합 시각적 대화형 확률적 이웃 포함 (viSNE), t 분산 확률 이웃 포함 (tSNE), 또는 스패닝 트리 진행을 포함 하 여 클러스터 사용 되었습니다. 밀도 정규화 이벤트 (스페이드)34,35, 사용 하는 여러 마커 집합에 따라 셀의 시각적 표현을 제공할 수 있는 분석. 이것은 monocyte 하위 분류에 제어 전략의 정확도 향상을 보여줘 왔다, 하는 동안 결점 수 필요한 항 체 (및 해당 fluorophore 채널)은 인식 된다. 그 유용성 질문 되 고;에 따라 달라 집니다. 추가 복잡성 수 수 해야, 예를 들어 열거형 연구에 있습니다.
우리의 기술로 문이 monocytes 문학에 맞춰 비율을 표시 하 고 표면 마커 3 하위 집합에 의해의 식을 쉽게 결정 될 수 있다. 전반적으로, 기술과 방법론 설명 monocyte 하위 집합의 비율을 열거 하 고 뿐만 아니라, 그로 인하여 다른 마커를 포함 하도록 확장 될 수 있습니다 표면 마커 식 평가 표준화 하 고 간단한 방법을 제공 한다 다른 다양 한 조건에서 그들의 기능적인 역할을 유효성 검사.

Monocytes는 백혈구 촉진 하 고 염증을 해결에 주요 역할의 한 유형입니다. Monocytes 인식, 클래식 (~ 85%), 중간 (~ 5%), 그리고 아닌 클래식 (~ 10%) monocytes 분화 (CD) 14의 클러스터와 CD16 식1의 그들의 수준에 의해 특징의 세 가지 주요 하위 집합을 확인 하 고 있습니다. Monocyte 하위 집합의 비율 중간체 중간체의 레벨은 심장 혈관 질병을 포함 하 여 다양 한 염증 성 상태2,3 에 한 증가 비율 등 질병의 존재와 다를 수 있습니다. 임상 이벤트4,5와 관련 된. 또한, 질병 조건에서 monocytes 받을 수 있습니다 또한 많은 변화 표면 마커 식6,7차이 의해 감지 기능 변경. 1 개의 그런 보기는 monocyte M1 기울이기는 심혈 관 질환, 당뇨병, 비만, 그리고 대사 증후군7,,89 에 관찰 되었습니다 마커 M1 세포와 관련 된에서 증가 , 10.
Cytometry monocyte 하위 집합 비율 및 기능 평가 인기에도 불구 하 고 샘플 준비와 하위 집합 게이팅 연구 같은 연구 사이 결과 비교 하기 어려운 시키는 사이 상당한 가변성이 있다. 중요 한 것은, 거기 아무 일치 monocyte 하위 집합의 경계에서 아직 표준화 된 접근은 필수적인 여러 가지 질병에 하위 집합 비율에서 변경의 임상 의미를 주어진. 게이팅에 어려움의 일부 monocytes 아닌 클래식 하위 집합11 중간을 통해 클래식에서 차별화 monocytes 고유 인구12 보다는 연속 스펙트럼으로 존재 하는 등, 사실에서 발생 . 흥미롭게도, Zawada 외 는 둘 다 심장 혈관 종점13을 예측 하는 더 높은 중간 하위 집합에 결과 중 하나는 사각형 또는 사다리꼴 게이팅 중간 부분 집합의 사용 하 여, 나타났다. 이것, 적어도 비율 계산, 중요 한 문제는 적용과 사이 다른 샘플 (연구), 일관 된 제어 전략 결정적으로 하위 집합을 구분 하는 대신 강조 한다. 결정적인 게이팅 수도 있지만 더 중요 한 기능을 평가할 때, 마커 식 하위 집합 사이 증분12,14, 이며 따라서 다시, 게이팅에 일관성은 아마도 키. 이와 같이, 객관적인 게이팅 reproducibly 다른 견본 사이의 monocyte 하위 집합을 포함할 할당 방법 필요 합니다. 여기에 제시 된 방법의 목적은 게이트 명확한 설명과 함께 monocyte 하위 집합 및 제어 기법에 대 한 정당성 고용 표면 마커 식, 따라서 연구를 허용 하는 메서드를 제공 하는 하위 집합을 평가 다른 샘플을 평가할 때이 기술의 사용에 자신감.

<table><tbody><tr><td>BD vacutainer 혈액 채취 세트</td><td>Becton Dickinson</td><td>367286</td><td></td></tr><tr><td>BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus 혈액 채취 튜브 -3.0 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>7128959</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>5ml 폴리스티렌 둥근 바닥 FACS 튜브(12mm x 75mm 스타일)</td><td>Invitro 기술</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>V450 Mouse Anti-Human CD14 항체 [M&phi; P9]</td><td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse monoclonal Anti-CD16 항체 [3G8]</td><td>Abcam Australia</td><td>ab140477</td><td></td></tr><tr><td>Per CP Anti-Human HLA-DR 항체 [L243]</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse IgG1 &kappa; Isotype Control [MOPC-21]</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>Lot # 4283901</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD163 항체 [GHI/61]</td><td>BD Biosciences</td><td>556018</td><td>Lot # 2335626</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD64 항체 [10.1]</td><td>BD Biosciences</td><td>558592</td><td>Lot # 36768</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD86 항체 [2331 (FUN-1)]</td><td>BD Biosciences</td><td>555658</td><td>Lot # 3109766</td></tr><tr><td>PE 마우스 Anti-Human CD11b/Mac-1 항체 [ ICRF44]</td><td>BD Biosciences</td><td>561001</td><td>Lot # 3228959</td></tr><tr><td>PE 마우스 IgG2A Isotype control [20102]</td><td>R& D Systems</td><td>IC003P</td><td>Lot # 1212031</td></tr><tr><td>PE Human TNF RII/TNFRSF1B 항체 [22235]</td><td>R& D 시스템</td><td>FAB226P</td><td>로트 # 612051</td></tr><tr><td>PE 마우스 IgG1, &kappa; Isotype Control [MOPC-21]</td><td>BioLegend</td><td>400112</td><td>Lot # B220359</td></tr><tr><td>PE Anti-human CD93 항체 [VIMD2]</td><td>BioLegend</td><td>336107</td><td>Lot # B143544</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD3 항체 [SK7]</td><td>BD Biosciences</td><td>347347</td><td>Lot # 3010929</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD19 항체 [HIB19]</td><td>BD Biosciences</td><td>561741</td><td>Lot # 2307721</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD56 항체 [B159]</td><td>BD Biosciences</td><td>561903</td><td>Lot # 3011796</td></tr><tr><td>PE Anti-human CD66b 항체 [G10F5]</td><td>BioLegend</td><td>305105</td><td>Lot # B154037</td></tr><tr><td>OptiLyse C</td><td>Beckman Coulter</td><td>A11895</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 37%</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 혈액학 분석기, XT-1800i</td><td>Sysmex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 GS-6R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 소프트웨어 v10.0.7</td><td>Tree Star Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전체 혈액에 의해 인간 monocyte 하위 집합의 flow cytometry 분석

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes는 다양 한 염증 성 질환에 주요 참여자 그리고 그들의 하위 집합 비율 및 기능을 포함 하 여 이러한 셀을 변경 병 적인 의미를 가질 수 있습니다. 이 방법으로 샘플의 최소한의 처리 제한 artifactual 세포 활성화로 monocytes 변경 검사를 위한 이상적인 방법을 전체 혈액 cytometry입니다. 그러나, 많은 다른 접근 연구 사이는 하위 집합의 일관성 확인으로 이어지는 monocyte 하위 집합 게이트 찍힌다. 여기 우리를 식별 하 여 인간 monocyte 하위 집합 (클래식, 중간, 및 비-클래식) 특성화 cytometry 전체 혈액을 사용 하 여 메서드를 보여 줍니다. 우리는 cytometry 혈액 샘플 준비, 게이트 (오염 세포 제거 된 수 있도록) 하위 표면 마커 monocyte 하위 집합 식을 결정 하는 방법을 개요-이 예제 M1 및 M2 마커. 이 프로토콜은 monocyte 하위 집합 비율 및 다른 기능 표시의 monocyte 하위 집합 식을 평가 하기 위한 표준 제어 방법이 필요로 하는 다른 연구를 확장할 수 있습니다.

Monocyte 제어 전략 및 흐름 cytometry 분석 여기 사용 (그림 1) 성공적으로 문이 monocyte 하위 집합 하 고 그들의 상대 비율을 밝혔다. (이 샘플)에 대 한 비율 88.1 %classicals, 4.33% 중간체 및 classicals-7.49% 비로 계산 했다. 이러한 하위 집합 게이츠 B 세포, T 세포, 호 중구 또는 마커 CD19, CD3, CD56, 그리고 CD66b, 각각 확인 되었다 NK 세포와 오염 하지 했다. 다른 집단의 상대적 위치를 평가 하 여 그 T 세포 및 호 중구 벗어나는 잘 monocyte "┐" 모양 (그림 2A 및 2D) CD16/CD14 음모에 분명 하다. 그러나, NK 세포와 B 세포 인구 (그림 2B 와 2c) 아닌 클래식 monocyte 인구와 겹쳐. (그림 1D , 1E) 제어 전략의 단계는 NK 세포 (그림 3A)와 B 세포 (그림 3B) 제외 확인 되었다. B 세포 인구 비 고전 monocytes의 작은 부분을 포함, 양을 무시할 수 이었다.
하위 세트를 그들은 다른 표면 마커, m 1을 표현 하는 정도 문이 데 (CD64, CD86, 및 CD120b) 및 M2 (CD163, CD11b, 및 CD93) 평가 되었다. 마커 히스토그램 (그림 4)의 변화에 의해 보이는 것과 같이 그들의 해당 isotype 컨트롤에 비해 긍정적인 표현 했다. 표식의 중간값 isotype 컨트롤 보다 했다.
4 개의 관으로 분할 되었다, 혈액 샘플에이 제어 전략의 적용 스테인드 하 고 별도로, 튜브 (표 4) 사이의 수익률 비교 결과 분석.
<img alt="유세포 분석 산점도; 면역 세포 분류; 다이어그램; CD 마커; 하위 모집단 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 전체 인 혈에 있는 전략 게이팅 대표 monocyte. (A) FSC(A) 대 FSC(H) 줄거리: 따라서 덩어리를 제거 하는 동일한 지역 및 높이 셀 게이팅, (더 큰 FSC(A) FSC(H)) 및 파편 (매우 낮은 FSC) K = 1000. (B) FSC(A) 대 SSC(A) 줄거리: monocytes의 광범위 한 선택의 SSC/FSC 속성에 따라. (C) CD16 대 CD14 줄거리: 그들의 특성 "┐" 모양에 따라 선택 monocytes 게이팅. (D) CD16 대 HLA-DR 줄거리: HLA-DR 긍정적인 셀을 선택 하 고 제거 하는 NK 세포를 제어. (E) CD14 대 HLA-DR: 제어는 monocytes에서 B 세포 (HLA-DR 높은/CD14 낮음)를 제외 하. (F) 선정 monocytes CD16 대 CD14 음모 monocyte 하위 집합 게이트를 다시 표시. A-F 컬러 블루와 그린 낮은 밀도, 레드와 높은 밀도 나타내는 오렌지와 오렌지 중간 밀도 나타내는 나타내는 셀 밀도를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="면역 세포 분화의 유세포 분석 다이어그램: T, B, NK 세포, 호중구; CD 마커." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 전략의 잠재적으로 셀 오염에 의해 게이팅의 유효성 검사. 잠재적으로 오염 셀 표식으로 식별 됩니다 (A) T 세포 (CD3), (B) B 세포 (CD19), (C) NK 세포 (CD56), 및 (D) 호 중구 (CD66b). 왼쪽 패널 (빨간색) (블루) 낮은 각 인구에서 높은 세포 밀도 나타내는 색으로 그림 1A 와 1B, 게이팅 후의 식별을 표시 합니다. 오른쪽 패널 표시 각 셀 인구 (파란색) 이러한 인구 monocytes (빨간색)에 근접을 최종 monocyte CD16/CD14 음모에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="유세포 분석 분석; CD 마커, 데이터 분포에 의한 단핵구, NK 및 B 세포의 산점도." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 제어 단계 오염 세포 제거 확인. 열 (블루) (A) CD56 및 (B) CD19 낮은 높은 (레드)에서 식의 정도 보여주는 지도. 제어 단계는 성공적으로 높은 CD56 셀 제외 (NK 세포)와 높은 CD19 (B 세포). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="유세포 분석 그래프; M1, M2 마커; 대식세포 표현형: 고전적, 중간, 비고전적." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: M1의 Monocyte 식 (CD120b) 및 M2 (CD93) 마커. 부드럽게 monocyte M1 및 M2 마커 식 (블루) (A) classicals, (B) 중간체, 및 (C) 비-classicals (적색)에서 고 isotype 분명 변화를 보여주는 히스토그램. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항 체</td>
			<td>볼륨 (50 µ L 혈액)</td>
			<td>볼륨 (16 배속) 800 µ L 혈액</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14-V450</td>
			<td>0.75 Μ L</td>
			<td>12 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16-APC</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
			<td>8 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR-PerCP</td>
			<td>0.625 Μ L</td>
			<td>10 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 전체 혈액의 흐름과 마스터 믹스에 대 한 항 체.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>튜브</td>
			<td>PE 항 체</td>
			<td>코드</td>
			<td>Isotype 일치</td>
			<td>사진 농도</td>
			<td>작업 볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.0 µ g/20 µ L</td>
			<td>0.625 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>CD163</td>
			<td>BD (556018)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0.125 µ g/20 µ L</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>CD64</td>
			<td>BD (558592)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0.06 µ g/20µL</td>
			<td>10 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.0 µ g/20 µ L</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>CD86</td>
			<td>BD (555658)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1.0 µ g/20 µ L</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD (561001)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1.0 µ g/20 µ L</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>R &amp; D (IC003P)</td>
			<td>NA</td>
			<td>25 µ g/mL</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>CD120b (TNFRII)</td>
			<td>R &amp; D (FAB226P)</td>
			<td>R &amp; D IgG2a</td>
			<td>25 µ g/mL</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BL (400112)</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
			<td>2.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>CD93</td>
			<td>BL (336108)</td>
			<td>BL IgG1</td>
			<td>50 µ g/mL</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: M1/M2-PE 형광 색소 표시 전체 혈액 흐름에 대 한 단일 클론 항 체.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>튜브</td>
			<td>항 체</td>
			<td>작업 볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>CD3</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>CD19</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>CD66b</td>
			<td>1.25 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>CD56</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: PE 형광 색소 단일 클론 항 체 림프 톨 (T 세포, B 세포), 호 중구, 및 NK 세포에 대 한 분류.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>튜브</td>
			<td>% 클래식</td>
			<td>% 중급</td>
			<td>% 비 클래식</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.11</td>
			<td>10.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>84.2</td>
			<td>5.05</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.03</td>
			<td>10.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>81.6</td>
			<td>5.03</td>
			<td>12.1</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4: Monocyte 하위 집합 비율 스테인드과 별도로 분석 한 혈액 샘플에서.

여기 선물이 monocyte 하위 집합 전체 혈액 cytometry에 의해 특성화에 대 한 프로토콜. 이 하위 게이트 그들의 표현의 표면 마커를 평가 하는 방법을 설명 하 고 (염증 성) M1 및 M2 마커 (염증)의 식 평가의 예를 포함 됩니다.

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

이 기술은 면역학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들면, 단핵 하위 집합 비율, 또는 다른 마커의 표현이 질병 상태에서 어떻게 변경되는지 결정합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 네이티브 상태에 가깝고 명확한 지침과 정당화가 표준화 된 게이팅 방법을 제공하기 위해 사용된다는 것입니다.일반적으로, 많은 논문이 세포의 게이팅이 수행 된 방법에 대한 명확한 지침을 제공하지 않기 때문에이 방법에 새로운 개인은 투쟁 할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 바와 같이 혈액 샘플 의 수집 및 백혈구 수의 결정과 함께이 프로토콜을 시작합니다. 인산염 완충식식염으로 혈액을 희석하고 밀리리터 당 약 5백만 개의 백혈구로 농도를 조절합니다.혈액, 안티 CD14-V450, 안티 CD16-APC 및 안티 HLA-DR-PerCP를 결합하여 튜브 의 수에 대한 충분한 마스터 믹스를 준비합니다. 소용돌이와 파이펫 51.9 마이크로리터가 각 튜브에 섞어 넣습니다. PE 표지M1 및 M2 마커 항체뿐만 아니라 T 세포, B 세포, 호중구 및 천연 킬러 세포를 해당 튜브에 첨가하십시오.소용돌이와 어둠 속에서 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양하십시오. 이제 결합된 적혈구 용해와 백혈구 고정 용액의 250 마이크로리터를 추가하고 혼합물을 부드럽게 소용돌이시십시오. 소용돌이 혼합물을 어둠 속에서 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.10분 후, PBS 250마이크로리터를 넣고 실온에서 10분 동안 260g의 셀을 회전시합니다. 상체를 제거하고 1% 포름알데히드의 300 마이크로리터에서 세포를 다시 분리합니다. 분석이 수행될 때까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 셀을 저장합니다.유동 세포측정은 시료 준비 후 48시간 이내에 이루어져야 합니다. 먼저 유동 세포계 로그를 확인하여 시설 직원이 품질 관리 검사를 수행했는지 확인합니다. 유동 세포 측정 실험을 설정하려면 새로운 실험을 클릭하고 새로운 표본과 새로운 튜브를 클릭하여 튜브를 추가합니다.아이콘을 클릭하여 바이바리에이트 플롯을 선택하고 드롭다운 메뉴를 사용하여 액세스 매개 변수를 선택합니다. CD16/CD14 플롯과 감지기를 시간과 함께 표시하는 플롯을 포함하여 수집을 모니터링합니다. 튜브를 삽입하고 클릭하여 획득합니다.계측기 전압 설정을 확인하여 검출기 신호가 스케일이 끊어지지 않도록 합니다. CD14/CD16 플롯의 단핵구 게이트에 속하는 세포를 관찰한다. 클래식 단핵구 게이트에 대한 레코딩 임계값을 5, 000 이벤트로 설정하고 레코드를 클릭합니다.나머지 튜브에 대한 데이터를 계속 기록합니다. 모든 튜브에 대한 데이터가 기록된 후 흐름을 분석을 위한 fcs 파일로 내보냅니다. 단일 세포 게이팅을 수행하려면 분석 소프트웨어에서 파일을 열고 튜브 이름을 두 번 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 매개 변수를 선택하여 전방 분산 영역과 전방 분산 높이 플롯의 셀을 시각화합니다.다각형 게이트 도구 아이콘을 클릭하고 셀을 둘러싸서 이중 제외 게이트를 만듭니다. 게이트 된 영역을 두 번 클릭하여 게이트 된 셀을 선택합니다. 새 디스플레이 상자에서 드롭다운 메뉴 매개 변수를 조정하여 측면 분산 영역 플롯과 셀을 전방 분산 영역에 표시합니다.직사각형 게이트 아이콘을 클릭하고, 림프구, 자연 킬러 세포 및 과립구의 대부분을 제외하려면 전방 및 측면 산란 특성에 따라 단핵 구군을 아낌없이 선택합니다. 게이트된 셀을 선택하고 CD14/CD16 플롯에서 다시 표시하여 드롭다운 메뉴를 사용하여 매개변수를 선택합니다. 다각형 게이트를 클릭하여 특성에 따라 단핵구를 선택합니다.비고전 적 집단이 세포에서 왼쪽으로 구별되지 않으면 오염가능성이 있으며 조사되어야 합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 매개 변수를 선택하여 게이트된 셀을 선택하고 CD/16 HLA-DR 플롯에 단핵구를 표시합니다. 다각형 게이트를 클릭하여 HLA-DR 양성 세포를 선택하고 남은 자연 킬러 세포 및 호중구를 제외합니다.게이트된 셀을 선택하고 드롭다운 메뉴를 사용하여 CD14/HLA-DR 플롯에 HLA-DR 양수 셀을 표시하여 매개 변수를 선택합니다. 다각형 게이트를 클릭하고 게이트를 그려 HLA-DR 하이/CD14 로우 B 셀을 제외합니다. 게이트된 셀을 선택하고 드롭다운 메뉴를 사용하여 CD16/CD14 플롯에 표시합니다.플롯 옵션에서 단핵구 하위 집합 게이트를 그려 하위 집합 비율을 결정할 수 있는 얼룩말 플롯을 선택합니다. 이제 직사각형 게이트 아이콘을 클릭하고 CD14 하이/CD16 낮은 클래식 단화 모집단 주위에 대략적인 직사각형 게이트를 그려 클래식 단핵구를 선택합니다. 디스플레이 아래에서 중앙값을 표시하여 클래식 단핵구의 중앙형광 강도를 표시합니다.모집단이 왼쪽과 오른쪽의 중앙값에서 동일한 분포를 가지도록 게이트를 조정하고, 왼쪽에 있는 모든 세포를 포괄한다. 고전적인 게이트의 오른쪽에 있는 셀을 포괄하는 직사각형 게이트를 그려 중간 인구를 선택합니다. 게이트의 바닥을 조정하여 게이트를 고전적 단핵구 게이트 내에 있는 동심 원의 바닥과 정렬하여 비고전적으로 셀을 제외합니다.비고전 적 하위 집합을 게이트, 중간 하위 집합의 아래쪽 가장자리에서 아래로 직사각형 상자를 그려, 인구의 하단에 모든 셀을 선택. 표시에서 게이트 주파수를 표시하여 각 단세포 하위 집합의 백분율을 결정합니다. 마지막으로 각 단세포 하위 집합에서 셀을 선택합니다.드롭다운 매개변수를 변경하여 각 단세포 하위 집합에 대한 히스토그램을 생성하여 각 마커를 표시합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 중앙값 또는 기하학적 평균을 사용하여 식 의 정도를 계산합니다. 성공적으로 문이 닫힌 단두구 개체 수가 여기에 표시됩니다.그리고 비율은 문학에 있는 것과 일치합니다. 이 샘플의 비율은 88.1 % 고전, 4.33 %의 중간및 7.49 %의 비고전으로 계산되었습니다. 다른 집단의 상대적 위치를 평가함으로써, 여기에 표시된 T 세포와 호중구가 CD16/CD14 플롯에서 단세포, 반전 된 l 모양 밖에서 잘 따르는 것이 분명합니다.그러나, 자연 킬러 세포와 B 세포 인구, 파란색으로 여기 표시, 비 고전적인 단세포 인구와 겹쳐. 오염 세포 유형이 제거되었음을 확인하는 열지도가 여기에 표시됩니다. 천연 킬러 세포는 HLA-DR CD16 단계에 의해 밖으로 문이 되었습니다., 반면, B 세포는 HLA-DR CD/14 단계에 의해 밖으로 게이트 되었습니다.빨간색으로 된 등색 컨트롤을 기준으로 파란색으로 M1 및 M2 마커의 표현이 여기에 표시됩니다. CD120b M1 마커는 모든 단세포 하위 집합에 대해 동종형 컨트롤 보다 명확한 변화를 보여줍니다. 이것은 또한 CD93 M2 마커의 경우, 표현은 고전에서 더 높고 중간에 중간정도, 비 고전적 에서 낮은.이 절차를 시도하는 동안, 오염된 세포가 정량화된 식에 기여할 수 있기 때문에, 밖으로 문이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 다른 마커를 검사 할 수 있습니다. 단세포 마커 발현이 질병에서 어떻게 변하는지와 같은 추가 질문에 대답하기 위해.인간의 혈액과 포름알데히드와 함께 일하는 것은 위험할 수 있으므로 개인 보호 장비 및 생물학적 위험 후드 사용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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