Name: Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 학습하세요 쥐 망막 동맥소리 분리법을 통해 혈관 평활근 수축성과 망막 혈류 조절 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 전기생리학 및 압력 근측정법 연구에 활용됩니다.

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박사 조 안 나 Kur Medtronic (트윈-도시, 미네소타, 미국)의 직원은 지금, 그녀의 현재 작업을 충돌 하지 않는 여기에 제시 된 그.

위에서 설명한 프로토콜 연습을 필요로 하지만 최소한의 문제 해결 달성 되어야 합니다. 평균 하루에 우리 6-8 사용할 arterioles 고립에서 얻을 것이 고 3-4 성공적인 실험을 달성. 그러나 문제가 발생 하는 경우, 성공률을 개선 하기 위해 취할 수 있는 몇 가지 단계가 있습니다. 때때로 우리는 발견, 어린 쥐 (< 8 주)를 사용 하는 경우에 특히 arterioles의 수익률 낮은 될 수 있습니다. 이 문제를 회피, 단계 1.12-1.14 단계는 분쇄의 각 사이 망막 조직 (500g x 10-30 s) centrifuging 좋습니다 것 이다. 이 종종 혈관의 수율을 개선 하는 데 도움이 하지만 준비 내 세포 파편의 양을 증가.
때 혈관 압력 myography 연구에 대 한 cannulating arterioles 수 분기 가까운 죽 습 되었습니다가지고 있는 모든 사이드 지점에 대 한 신중 하 게 확인 하기 중요 하다. 이 실험 동안 누설의 일반적인 원인 및 압력의 손실을 나타냅니다. [캘리포니아2 +]나 프로토콜 함께 발생할 수 있는 주요 문제는 염료 로드의 수준 이다. 불 쌍 한 염료 로드 일반 Ca2 + 항상성 장애에 결과 오버 로드 하는 동안 낮은 신호 대 잡음 비율, 리드. 이러한 문제 중 하나에의 가능성을 줄이기 위해, 망막 homogenate의 작은 약 수를 제거할 수 있습니다, 하 고 격리 된 선박 로드 프로토콜 동안 정기적으로 검사 합니다. 사업 패치 클램프 실험, gigaseal 형성의 성공률도 높은 방법에 의존 하는 경우 기저 lamina 소화 되어 있다. 때 처음이 프로토콜 테스트 또는 사용 하 여 새로운 많은 효소의 효소 소화 농도/기간 조정 필요할 수 있습니다. 충분히 기초를 제거 하는 충분 한 소화 보장 한다 내 피 및 평활 근 층의 분리를 신중 하 게 모니터링 액세스 laminal. 주의 깊은 모니터링 하는 것은 또한 혈관 수축 시작으로 매니 페스트 수 있습니다-소화를 방지 하는 데 필요한입니다. 이 경우, 평활 근 세포는 종종 패치 클램프 기록에 대 한 너무 약 합니다. 효소를 적용할 때 그것은 DNAse를 포함 하는 것이 중요 내가 DNA에서 해방의의 제거를 보장 하기 위해 손상 된 세포 격리 과정. DNA 파편은 끈 적 원인과 (4.4 단계), 청소 과정의 최종 단계는 되에 고착을 겸 종종 선박 손실의 결과로. 혈관 청소 기술적으로 어려운 이며 가장 높은 최고의 가능한 팁 직경의 닫힌된 집게의 부드러운 연소 움직임 확대 (20 X)에서 수행 됩니다. 스윕, 사이 랩 롤과 집게 청소.
강조,이 원고에 설명 된 프로토콜의 개발 뒤에 주요 동기 망막 혈관 질환 중 혈 중단 왜 이해를 했다. 날짜를 우리의 작품의 대부분은 당뇨병 안구 질환28,33에 집중 했다. Arterioles 섹션 1에에서 설명 된 방법을 사용 하 여 당뇨병의 실험적인 설치류 모델의 망막에서 격리 될 수 있습니다. 실험에서 당뇨병 동물에서 분리 된 망막 arterioles 때 그것은 밀접 하 게 비보에혈관에 의해 경험 hyperglycemic 조건 복제 하려고 하는 것이 중요. 이러한 이유로, 우리가 일반적으로 우리의 절연 및 25 m m 실험적인 솔루션에서 D-포도 당 수준을 인상 것입니다. 혈관 지하실 막 두껍게 당뇨병34,35동안 망막 혈관에 잘 인식 된 현상입니다. 동물을 사용 하 여 장기간 당뇨병 (> 1 개월 질병 기간) 때 증가 효소 농도 또는 소화 시간 종종 필요 패치 클램프 기록 방법의 응용 프로그램을 활성화 합니다.
비보 전 을 사용 하 여 중요 한 제한 절연 망막 arterioles 망막 혈관 생리학을 공부 하 고 이상 주변 망막 neuropile의 손실 이다. 망막 폐해 및 신경 세포의 제거는 세포 생리학 연구에 대 한 망막 혈관 평활 근 세포에 쉽게 액세스할 수 있습니다,. 비록 vasoactive 중재자에 대 한 혈관의 응답 부재 및 망막의 존재에서 극적으로 변경할 수 있습니다. 조직입니다. 아데노신 트라이-인산 염 (ATP)의 작업은 예를 들어이 포인트의 좋은 그림을 제공합니다. 고립 된 쥐 망막 arterioles, ATP 트리거의 추가 선박36의 강력한 수축, 그대로 neuropile의 존재에 혈관 팽창37. 따라서, 가능 하다 면, 우리가 일반적으로 시도 비보 전 망막 전체 마운트 및 선박 직경 및 혈액 흐름16,37 의 측정 vivo에서 를 사용 하 여 우리의 고립된 되 준비에서 주요 연구 결과 유효성을 검사 하 . 주의 새로운 방법을 최근 작은 arterioles38,39 비보 전전체 끼얹는다 돼지 망막 모세 혈관을 공부 하 고 대 한 나왔다. 이러한 준비 크게 망막 neuropile 망막 arteriolar 및 모 세관 톤을 조절 하는 방법 및 망막 haemodynamics에 변화 망막에 신경 활동을 조절 하는 어떻게의 우리의 이해를 향상 시킬 가능성이 있다.
이 문서에서 설명 하는 절차는 이해 arteriolar 부드러운 근육 세포 생리학에 대 한 고립 된 쥐 망막 arterioles의 사용에 초점을 맞추고 있다, 하지만 우리는 현재 프로토콜에 내 피 세포 기능 연구 활성화를 개발합니다 이러한 선박입니다. 예비 작업에서 우리는 캘리포니아2 + 이미징 및 연구 기록 patchclamp 의무가 가능한 내 피 세포 튜브를 망막 arteriolar 세그먼트의 효소 소화 수정에 성공 되었습니다. Intraluminal 배달, 약물의 사용, 양쪽 끝에 격리 arterioles cannulation 수도 미래에 이러한 선박에 조사를 사용 피 종속 vasodilatory 응답.

비정상적인 혈 시력을 위협 하는 다양 한의 병 인에 연루 되어 이후 중요 한 목표는 망막에 혈액 흐름을 제어 하는 방법을 이해 망막 질병1,2,3, 4. 제공 안 망막 신경 그리고 glial 세포, 망막 순환 arterioles 망막 venules 그리고 마지막으로 혈관5모 세관을 통과 하 고 망막 동맥에서 혈액의 모든 최종 동맥 배열을, 있다. 망막에 혈액 흐름의 망막 동맥, arterioles 톤 후 모 세관 venules6,7, 및 망막 모세 혈관의 벽에 있는 pericytes의 수축 성 활동에 의해 통제 된다 8. 망막 혈관 음색의 제어는 복잡 하 고 다양 한 분자와 호르몬, 순환 혈액 가스를 포함 한 주변 망막 조직 하 고 순환 시스템에서 입력에 의해 변조 및 vasoactive 물질에서 발표는 망막 혈관 내 피와 macroglia9,,1011. 망막 arterioles 망막의 작은 동맥 가지 단일 층의 혈관 평활 근 세포의 구성와의 내부 안 감 경도 배열 내 피 세포12,13, 14. 이러한 혈관 망막 순환 내 혈관 저항의 주요 사이트를 형성 하 고 따라서 망막 혈액 흐름의 로컬 제어에서 중요 한 역할. 망막 arterioles dilating 또는 변화 혈관 평활 근 수축10,15,16에 의해 중재 luminal 그들의 직경을 constricting에 의해 망막에 모 세관 혈액의 흐름을 조절 합니다. Arterioles 규제는 망막을 통해 망막 관류 필요 준비 arteriolar 평활 근 세포를 액세스할 수 있으며 가능한 생리 적 조건에 가깝게에서 공부 하는 분자 메커니즘을 이해.
고립 된 망막 혈관의 비보 전 준비 아직도 그들의 기능 및 기본 피와 상호를 유지 하는 동안 혈관 평활 근 세포에 대 한 액세스를 제공 합니다. 격리 된 용기를 사용 하 여 현재까지 대부분의 연구는 큰 소 또는 돼지 동맥 혈관 (60-150 µ m)에 집중 했다. 이러한 상용 와이어 또는 혈관 평활 근 세포 수축 메커니즘17,18의 약리 심문 수 있도록 압력 myograph 시스템에 장착할 수 있습니다. 이러한 준비 정상적인 조건에서 망막 혈관 생리학의 우리의 지식에 크게 기여 했다. 몇 가지 연구는 그들의 작은 직경으로 작은 실험실 동물에서 분리 된 망막 arterioles 사용 (~ 8-45 µ m) 기존의 myography 시스템19,20,,2122에 그들의 사용을 방지. 그러나 중요 한 이점,, 작은 실험 동물에서 혈관을 사용 하 여 유전자 변형, 유전자 변형 및 망막 질환 모델의 넓은 가용성 이다. 작은 실험실 동물 개입 연구 비보에 대 한 더 많은 의무가 있습니다.
여기 우리는 분리 하 고 압력 myography 실험 쥐 망막 arterioles cannulating에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 캘리포니아2 + 이미징 및 전기 생리학 프로토콜 사용 하 여 이러한 혈관도 자세히 나와 있습니다. 이러한 추가 혈관 평활 근 수축 및 망막에 혈액 흐름의 규칙으로 통찰력을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Beakers</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>곡선 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 피펫/전사</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6mL가 가장 좋지만 다른 크기도 허용됩니다; 조리개를 넓히기 위해 팁을 제거하십시오</td></tr>. <tr><td>해부 현미경</td><td>Brunel Microscopes Ltd</td><td></td><td>또는 어떤 등가 제품</td></tr><tr><td>겸</td>자 <td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5 14095</td><td>이에 상응하는 미세 집게</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>11546963</td><td>마찰을 줄이기 위해 화염 연마되었지만 팁을 좁힐 정도는 아님</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>또는 모든 등가 10cm 제품</td></tr><tr><td>피펫 젖꼭지</td><td>Fisherbrand</td><td>12426180</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>정제수 공급</td><td>Merek</td><td>Milli-Q 통합 정수 시스템</td><td>또는 모든 등가 시스템</td></tr><tr><td>라운드 바닥 시험관</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL; 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>Seratted forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>단일 가장자리 블레이드</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>또는 어떤 등가 제품</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>또는 어떤 유연한 표면&nbsp;</td></tr><tr><td>테스트튜브 랙</td><td>Fisherbrand Derlin 10257963</td><td></td><td>또는 어떤 등가 제품</td></tr><tr><td>압력 myography</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3축 기계식 조작기</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>x2(또는 등가 제품)</td></tr><tr><td>3-방향 탭</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>또는 어떤 등가 제품</td></tr><tr><td>에어 테이블</td><td>기술 제조 회사&nbsp;</td><td>클린 벤치</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>분석 소프트웨어&nbsp;</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>무료 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>분석 플러그인</td><td>Myotraker&nbsp;</td><td></td><td>imageJ에 대한 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 사용자 정의 플러그인 무료로 다운로드 할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>캐뉼레이션 피펫 유리</td><td>World Percision 악기</td><td>TW150F-4</td><td>또는 모든 equilavent 제품</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>또는 모든 equilavent 제품</td></tr><tr><td>디지털 온도계</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>또는 모든 equilavent 제품</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>집게</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>이에 상응하는 미세한 집게</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td> DMSO 유리 바닥 녹음 챔버<td>에 1mM 재고</td></tr><tr><td></td><td>제작 Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>도우미 피펫 유리</td><td>World Percision instrument</td><td>IB150F-3</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>인라인 히터</td><td>맞춤형</td><td></td><td>상업 등가 SH-27B 솔루션 인라인 히터 하버드 장치</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>압력계</td><td>Riester</td><td>LF1459</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>미세 전극 풀러</td><td>Sutter 계기</td><td>P97</td><td>또는 어떤 동등한 제품</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Olympus CX 31 현미경</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter instruments</td><td>MP-285</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>다중 채널 전달 매니폴드&nbsp;</td><td>Automate Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>또는 어떤 등가 제품</td></tr><tr><td>피펫 필러&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>주사기 가열 및 피펫 내부 직경으로 당겨</td></tr><tr><td>짐 피펫 홀더</td><td>분자 장치</td><td>1-HL-U</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>흡입 펌프</td><td>Interpet</td><td>AP1</td> 벨로우즈 <td>역전에 의한 변환 폭기 펌프</td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>텅스텐 와이어</td><td>어드벤트</td><td>W558818</td><td>75&mu; m 직경</td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>VWR</td><td>기타 크기</td><td>또는 모든 동등 제품</td></tr><tr><td>USB 카메라</td><td>&nbsp; 로지텍&nbsp;</td><td>HD Pro 웹캠 C920</td><td>또는 모든 동등한 제품</td></tr><tr><td>비디오 캡처 소프트웨어</td><td>Hypercam</td><td>버전 2.28.01</td><td>또는 모든 동등한 제품</td></tr><tr><td>수조</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>또는 모든 동등한 제품</td></tr><tr><td>x20 렌즈</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>또는 모든 동등한 제품</td></tr><tr><td>x4 렌즈</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>Y-커넥터</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>패치 클램핑</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-방향 탭</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>3축 기계식 조작기</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>에어 테이블</td><td>기술 제조 회사&nbsp;</td><td>클린 벤치</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg은 매일 50 &mu에 용해됩니다. L of DMSO (sonicate to dissolve)</td></tr><tr><td>증폭기</td><td>분자 장치</td><td>Axopatch 200a</td><td>또는 모든 동등 제품</td></tr><tr><td>아날로그 디지털 컨버터</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>또는 모든 동등 제품</td></tr><tr><td>Collagenase Type 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&nbsp;</td><td>LCH에서 0.1mg/mL</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>디지털 온도계</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>작업 재고 1 MU mL-1 (10 mL LCH에 10 MU 희석)&nbsp;</td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>모든 등가 상업 제품</td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Dumont</td><td>No. 7</td><td>모든 초극세</td></tr><tr><td>집게 유리 바닥 녹음 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>헤드 스테이지</td><td>분자 장치</td><td>CV203BU</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>인라인 히터</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>하버드 장치에서 상업용 등가 SH-27B 솔루션 인라인 히터</td></tr><tr><td>Nikon</td><td></td><td>Eclypse TE 300</td><td>또는 어떤 등가 제품</td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter instruments</td><td>P97</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Olympus CX 31 현미경</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter instruments</td><td>MP-285</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>다중 채널 전달 매니폴드&nbsp;</td><td>과학적인</td><td>관류 연필</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>패치 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>Pclamp v10.2</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>피펫 필러를 자동화하십시오&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>주사기는 가열되어 피펫 내부 직경으로 당겨</td></tr>짐 <tr><td>피펫 홀더</td><td>분자 장치</td><td>1-HL-U</td><td>또는 어떤 등가 제품</td></tr><tr><td>프로테아제 타입 XIV</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5147&nbsp;</td><td>LCH에서 0.01mg/mL</td></tr><tr><td>단일 채널 피펫 유리</td><td>World Percision 기기</td><td>IB150F-3</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>흡입 펌프</td><td>Interpet</td><td>AP1</td> 역<td>전 벨로우즈에 의한 변환된 통기 펌프</td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>텅스텐 와이어</td><td>어드벤트</td><td>W557418</td><td>50&mu; m 직경</td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>VWR</td><td>기타 크기</td> USB 카메라<td>에 맞는 모든 동등 제품</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; 로지텍&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>수조</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>전체 셀 피펫 유리</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>x20 렌즈</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>x4 렌즈</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>x40 렌즈</td><td>Nikon</td><td>40x/0.55, WD 2.1, &infin;/1.2</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>Y-커넥터</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>Ca2+ 이미징</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3방향 탭</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>3축 기계식 매니퓰레이터</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>수집 소프트웨어&nbsp;</td><td>케언 리서치 주식회사</td><td>획득 엔진 V1.1.5</td><td>또는 모든 등가 제품; 미세 형광 측정</td></tr><tr><td>에어 테이블</td><td>기술 제조 회사&nbsp;</td><td>클린 벤치</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>컨포칼 이미징을 위한 분석 소프트웨어</td><td>이미지 J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>무료 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>또는 어떤 동등 제품</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica Geosystems</td><td>SP5&nbsp;</td><td>또는 모든 등가 제품; 공초점</td></tr><tr><td>디지털 온도계</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Dumont</td><td>No. 7</td><td>모든 초미세 집게</td></tr><tr><td>유리 바닥 녹음 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>인라인 히터</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>상업 등가 SH-27B 솔루션 하버드 장치의 인라인 히터</td></tr><tr><td>반전 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000</td><td>또는 모든 등가 제품; 미세 형광 측정</td></tr><tr><td>Monochromator&nbsp;</td><td>케언 리서치 주식회사</td><td>Optoscan</td><td>또는 어떤 등가 제품; 마이크로 플루오리 메트리</td></tr><tr><td>멀티 채널 전달 매니폴드&nbsp;</td><td>Automate Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>또는 어떤 등가 제품</td></tr><tr><td>피펫 필러&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>주사기를 가열하여 컨</td></tr><tr><td>포칼 현미경 용</td> 피펫 내부 직경으로 당기는 <td>Leica Geosystems</td><td>LAS-AF 버전 3.3.</td><td>또는 모든 등가 제품; 공초점</td></tr><tr><td>흡입 펌프</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>역전 벨로우에 의한 변환된 통기 펌프</td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>텅스텐 와이어</td><td>어드벤트</td><td>W557418</td><td>50&mu; m 직경</td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>VWR</td><td>기타 크기</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr><tr><td>x100 렌즈</td><td>Nikon</td><td>x100 N.A. 1.3 오일</td><td>또는 모든 등가 제품; 미세 형광 측정</td></tr><tr><td>x20 렌즈</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>또는 모든 등가 제품; 미세 형량 측정</td></tr><tr><td>x20 렌즈</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &infin;/0.17/D</td><td>또는 모든 등가 제품; 공초점</td></tr><tr><td>x4 렌즈</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>또는 모든 등가 제품; 미세 형량 측정</td></tr><tr><td>x63 렌즈</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS &infin;/0.17/E</td><td>또는 모든 등가 제품; 공초점</td></tr><tr><td>Y-커넥터</td><td>World Percision 기기</td><td>14012</td><td>또는 모든 등가 제품</td></tr> <tr><td>< 강한>피펫 < / 강></td><td></td><td></td> <td>< 강> 실험 용 피펫 제작을위한 사양 및 설정 < / ></td></tr> <tr><td>도우미 피펫</td><td>World Percision Instruments</td><td>IB150F-3</td><td>내경 : 0.86 mm 램프 : 261 압력 : 300 열 : 280 당기기 : 0 속도 : 56 시간 : 250 사이클 수 : 4 팁 직경 : 0.5-2 &mu; m < / > 연마 : 예 최종 저항 : >10 M & Omega;</td></tr><tr><td>캐뉼레이션 피펫</td><td>World Percision instruments</td><td>TW150F-4</td><td>내경: 1.17 mm 램프: 290 압력: 300 열: 280 당기기: 0 속도: 58 시간: 150 주기 수: 4 팁 직경: 3-10 &mu; m 연마: no 최종 저항: < 1 M&오메가;</td></tr><tr><td>온 셀 패치</td><td>World Percision 기기</td><td>IB150F-3</td><td>내경 : 0.86 mm 램프 : 261 압력 : 300 열 : 280 풀 : 0 속도 : 56 시간 : 250 사이클 수 : 4 팁 직경 : 0.5-2 &mu; m 연마: yes 최종 저항: >5 m&Omega;</td></tr><tr><td>전체 셀 패치</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>내경: 1.17 mm 램프: 296 압력: 200 열: 287 당김 : 0 속도: 50 시간: 250 주기 수: 4 팁 직경: 2-3 &mu; m 연마: 도움이 되지만 반드시 필요한 것은 아님 최종 저항: 1-2 M&Omega;</td></tr></tbody></table>

ex vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 arterioles의 절연

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

망막은 상당한 혈액 공급을 필요로 하는 높은 metabolically 활성 조직. 망막 순환 안 배는 대뇌를 공급 하는 동안 내부 망막을 지원 합니다. 당뇨병 성 망막 증을 포함 하 여 수많은 시력을 위협 하는 장애에 기여 하는 망막 관류에 변경, 녹 내장 및 망막 정 맥 않기. 망막이 안구 질병 동안 변경 되는 방법을 통해 혈액 흐름의 제어에 관련 된 분자 메커니즘을 이해 이러한 조건의 치료에 대 한 새로운 목표의 식별 될 수 있습니다. 망막 arterioles, 망막의 주요 저항 혈관 이며 따라서 luminal 직경에서 변화를 통해 망막 hemodynamics 조절에 핵심적인 역할을 담당할. 최근 몇 년 동안, 우리는 다양 한 세포 생리학 연구를 포함 하는 응용 프로그램에 대 한 적당 한 쥐 망막에서 arterioles 격리 하기 위한 방법을 개발 했습니다. 이 준비는 이미 혈은 망막에 제어 방법과 눈 질병 중 발생 하는 주요 변경 사항 중 일부를 식별 하기 위해 우리 수 있다에 새로운 통찰력을 얻을 시작 됩니다. 이 문서에서는, 우리는 쥐 망막 arterioles의 고립 위한 방법을 설명 하 고 패치 클램프 전기 생리학, 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 그들의 사용에 대 한 프로토콜을 포함. 이러한 혈관 PCR-서 부 럽 고 immunohistochemistry-기반 연구에 사용 하기 위해 의무가 있습니다.

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

비정상적인 혈류는 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 분지 정맥 폐색과 같은 시력을 위협하는 다양한 망막 질환의 발병과 관련이 있기 때문에 망막에서 혈류가 어떻게 조절되는지 이해하는 것이 중요한 목표입니다. 망막 세동맥은 내강 직경을 확장하고 수축시킴으로써 망막의 혈류를 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 이러한 혈관을 둘러싸고 있는 평활근 세포의 수축성 변화에 의해 매개됩니다. 따라서 망막 관류 조절의 기초가 되는 분자 메커니즘을 이해하려면 가능한 한 생리학적으로 가까운 조건에서 망막 세동맥 평활근 세포에 접근하고 연구할 수 있는 준비가 필요합니다.이 비디오에서는 패치 클램프, 칼슘 이미징 및 압력 근조영술 연구에 사용할 수 있는 쥐 망막에서 세동맥을 분리하기 위한 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 지난 몇 년 동안 이 제제는 건강과 질병 모두에서 혈관 평활근 수축성과 망막의 혈류 조절에 대한 추가 통찰력을 제공하는 데 사용되었습니다. 재료 표와 같이 Hanks' 또는 LCH를 함유한 저칼슘 1리터 용액을 구성합니다.조직을 채취하기 전에 분리 장비를 조립하십시오. 유리 파스퇴르 피펫은 매끄럽게 연마해야하지만 팁을 좁히지 않아야합니다. 플라스틱 피펫을 약 5-7mm의 구멍으로 자릅니다.LCH 용액에 담근 해부 접시에 눈을 놓습니다. 한 세트의 집게를 사용하여 안와 근육 부착물 또는 시신경을 잡고 접시에 눈을 고정합니다. 눈을 안정시키기 위해 앵커링 포인트가 공막에 최대한 가까운지 확인하십시오.칼날을 사용하여 오라 세라타를 따라 각막을 절단하고 집게로 공막을 부드럽게 눌러 수정체를 제거합니다. 이 이미지에서 눈 뒤쪽에서 볼 수 있는 작은 원형 영역은 시신경입니다. 블레이드를 사용하여 광학 디스크를 통해 아이컵을 대칭으로 반으로 자릅니다.닫힌 집게를 사용하여 아이컵의 양쪽 절반에서 망막을 부드럽게 털어내고 시신경 디스크에 남아 있는 부착물을 조심스럽게 제거합니다.두 번째 눈으로 이 과정을 반복하고 플라스틱 피펫과 LCH 배지 소량을 사용하여 절개된 망막을 시험관으로 옮깁니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 시험관에 LCH를 약 5ml까지 채우고 망막이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.튜브에서 약 4ml의 용액을 제거하고 플라스틱 피펫을 사용하여 새 LCH를 추가하여 조직을 약 3회 세척합니다. 필요한 경우 외부 조직을 제거해야 합니다. 조직이 피펫에 달라 붙는 것을 방지하기 위해 LCH로 광택 처리 된 팁으로 유리 파스퇴르 피펫 내부를 세척하십시오.동일한 피펫을 사용하여 시험관에서 약 4ml의 용액을 제거하고 약 2ml의 새 LCH를 추가합니다. 유리 피펫 끝을 통해 조직을 천천히 당겨 망막을 부드럽게 해리하고 내용물을 시험관으로 배출합니다. 이 단계에서 거품이 생기지 않도록 하고, 망막이 약 2-3mm 제곱미터 크기로 부서질 때까지 이 과정을 반복한다.약 2ml의 LCH로 피펫 내부를 세척하고 이를 시험관으로 배출합니다. 내용물이 5분에서 10분 동안 바닥에 가라앉도록 합니다. 조직 조각의 크기가 약 1mm가 될 때까지 앞에서 설명한 대로 약간의 힘으로 분쇄 과정을 반복합니다.조직이 가라앉을 때까지 기다렸다가 내용물이 완전히 균질화되고 망막 조각이 남지 않을 때까지 훨씬 더 세게 한 번 더 반복합니다. 이 단계의 용액은 외관상 유백색으로 보여야 합니다. 이 기술은 분리당 최대 8개의 세동맥 분절을 생성하며, 길이는 200에서 2, 500마이크로미터입니다.세동맥의 한쪽 끝을 막고 반대쪽 끝을 폐색하면 근육 반응(myogenic response)이라고도 하는 압력 유도 혈관 수축을 측정할 수 있습니다. 세동맥압 근조영술은 다음과 같이 실시한다. 망막 균질액의 분취량은 도립 현미경의 무대에 장착된 생리학적 기록 챔버로 전달됩니다.균질산염을 챔버 바닥에 최소 5분 동안 가라앉히도록 둡니다. 기록실을 육안으로 스캔하여 길이가 200마이크로미터보다 크고 혈관을 캐뉼레이션할 수 있는 열린 끝이 있는 동맥을 식별합니다. 가는 집게와 용기 위에 놓인 작은 텅스텐 와이어 슬립을 사용하여 용기의 한쪽 끝을 고정합니다.텅스텐 와이어의 겹치는 끝을 사용하여 열린 끝이 가압 캐뉼라와 일치하도록 용기를 수조를 가로질러 수평으로 흐르도록 움직입니다. 칼슘이 없는 챔버를 관류합니다.행크스'섭씨 37도. 캐뉼레이션은 유리 피펫으로 수행됩니다.캐뉼러는 미세한 미세 조작기를 사용하여 용기의 열린 끝에 배치됩니다. 팁은 현미경의 초점면을 조정하여 평가한 바와 같이 개구부에 바로 인접하여 위치하여 혈관의 끝과 캐뉼러 팁이 동시에 초점이 맞춰지고 가압 캐뉼라가 혈관 조리개로 전진합니다. 캐뉼레이션 과정을 돕기 위해 도우미 피펫이 필요하며 세동맥을 부드럽게 억제하고 캐뉼라가 혈관 내강으로 전진하는 동시에 가압 캐뉼라 위로 세동맥 벽을 안내하는 데 사용됩니다.이 절차는 높은 성공률을 달성하기 위해 두 매니퓰레이터의 동시적이고 통제된 움직임과 광범위한 연습을 필요로 합니다. 0mm의 수은에서 1분 동안 기록한 후 루미날 내 압력이 40mm의 수은으로 증가하고 용기가 빠르게 확장되어 성공적인 캐뉼레이션을 확인해야 합니다. 압력에 의한 혈관 수축, 즉 근육 반응은 이후 약 15분에 걸쳐 진행됩니다.망막 혈관 평활근 세포의 패치 클램프 기록을 통해 세포 내 칼슘을 조절하여 세포 수축성을 조절하는 원형질막 이온 전류를 조사할 수 있습니다. 전체 세포 및 단일 채널 기록은 다음과 같이 부모 세동맥에 여전히 박혀 있는 개별 평활근 세포에서 가능합니다. 망막 세동맥은 고립되어 텅스텐 와이어 슬립으로 기록 챔버에 고정됩니다.기저층은 패치 피펫과 세동맥 평활근 세포막 사이에 높은 저항성 밀봉이 형성될 수 있도록 소화되어야 합니다. 세동맥은 섭씨 37도에서 순차적인 일련의 효소 용액과 중첩되어 있으며, 이는 또한 이미지의 화살표로 표시된 것처럼 인접한 세포의 전기적 분리를 초래합니다. 소화 수준은 초기에 콜라겐분해효소 단계에서 내피층과 평활근층의 시각적 분리에 대해 평가됩니다.기저층 및/또는 말초 신경더미의 남아 있는 가닥을 제거하는 것은 혈관 표면을 따라 미세한 집게의 닫힌 끝을 조심스럽게 쓸어내면 됩니다. 패치 클램핑의 경우, 패치 피펫의 팁을 관심 세포 위에 수직으로 배치하고 마이크로 매니퓰레이터의 미세하고 느린 움직임을 사용하여 세동맥 평활근 막과 접촉하여 점차적으로 내립니다. 이는 세포 이동과 피펫 저항의 변화로 판단되며, 수집 소프트웨어에서 cell seal 테스트 프로토콜을 사용하여 측정됩니다.피펫이 셀 위로 내려가면 밀봉 저항이 약 5배 증가합니다. 음압이 피펫 뒤쪽에 일시적으로 가해지고 기가씰이 서서히 형성됩니다. 이를 위해서는 1분에서 5분 동안 음압을 반복적으로 가해야 합니다.전체 세포 기록의 경우 천공된 패치 클램프 방법이 주로 사용됩니다. 앞서 설명한 바와 같이 세포 내 유사 용액과 암포테리신 B를 포함하는 피펫으로 기가씰이 형성되며, 접근 저항은 수집 소프트웨어의 멤브레인 테스트 프로토콜을 사용하여 모니터링됩니다. 액세스 저항이 15메가옴 미만으로 떨어지면 직렬 저항 보상이 수행됩니다.일반적으로 천공 패치 모드에서 직렬 저항을 약 75%까지 보상할 수 있습니다. 그런 다음 전압 단계 또는 램프 프로토콜을 사용하여 전체 셀 전류를 측정할 수 있습니다. 망막의 해리 후, 1차 세동맥, 2차 세컨더리 세컨더리 세동맥은 세뇨병의 구경과 혈관 평활근 세포의 배열에 따라 식별될 수 있습니다.1차 및 2차 세동맥은 명시야 현미경 검사에서 시각적으로 유사하게 보이지만 크기에 따라 구별할 수 있습니다. 모세혈관 전 세동맥은 제제에서 가장 작은 동맥 혈관이며 혈관 평활근 세포의 간헐적인 배열로 인해 쉽게 알아볼 수 있습니다. 분리된 세동맥은 격리 내에서 모세혈관 및 정맥과 명확하게 구별될 수 있습니다.모세혈관은 직경이 약 4-10마이크로미터인 소구경 혈관의 그물망으로 뚜렷한 반면, 정맥은 벽이 얇고 평활근 세포가 덮여 있지 않습니다. 1차, 2차 및 모세혈관 전 세동맥은 압력 근조영술, 칼슘 이미징 및 패치 클램프 연구에 적합합니다. 가압 세동맥을 사용하여 근육 반응 생성과 관련된 분자 메커니즘을 조사했습니다.이 이미지의 현미경 사진은 압력 근조영술 실험 과정에서 다양한 시점에 있는 쥐의 망막 세동맥을 보여줍니다. 아래의 시간 경과 플롯은 실험의 전체 과정 동안 용기 직경의 변화를 보여줍니다. 가압 직후 혈관이 확장되고, 그 후 15분 후에 정상 상태 수준에 도달하는 활성 근육 수축이 이어집니다.실험이 끝날 때 칼슘이 없는 Hanks 용액에 wortmannin을 첨가하면 정규화 목적을 위해 용기가 수동 직경으로 확장됩니다. 이 슬라이드는 막 스트레칭 전후에 망막 세동맥 평활근 세포에서 기록하는 단일 채널 패치 클램프의 예를 보여줍니다. 이 온-셀 패치에는 두 개의 스트레치 활성화 TRPV2 채널이 포함되어 있으며, 이 채널은 패치 피펫에 음압을 가하면 활성이 증가합니다.여기에 설명된 프로토콜은 연습이 필요하지만 최소한의 문제 해결로 달성할 수 있어야 합니다. 격리된 세동맥은 격리와 같은 날에 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 쥐의 망막 세동맥에 최적화되어 있지만 쥐의 망막에도 사용할 수 있습니다.이제 우리는 이 제제를 광범위하게 사용했지만, 가능한 경우 ex vivo retinal whole-mounts와 혈관 직경 및 혈류의 in vivo 측정을 사용하여 주요 결과를 검증하려고 합니다.

isolation-of-retinal-arterioles-for-ex-vivo-cell-physiology-studies

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Ex vivo ERG는 동물 또는 인간의 분리된 온전한 망막에서 직접 망막 세포의 전기 활동을 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 망막 세포의 전기적 활동을 해부하기 위해 생체 외 ERG 기록에 일반적인 생체 내 ERG 시스템을 적용할 수 있는 방법을 보여줍니다.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

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망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

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이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

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일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

이 프로토콜은 성인 마우스로부터 수득한 망막 외식편의 분리, 해부, 배양 및 염색을 위한 단계를 제시하고 설명한다. 이 방법은 당뇨병 성 망막증과 같은 다양한 망막 신경 혈관 질환을 연구하기위한 생체 외 모델로서 유익합니다.

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산화 스트레스 및 사이토카인과 같은 당뇨병/당뇨병성 망막병증 관련 모욕으로 인한 사망에 대한 망막 혈관의 복원력을 모니터링하기 위해 보호 분석법이 개발되었습니다.

마우스의 당뇨병 관련 사망으로부터 망막 혈관 보호를 감지하기 위한 분석

여기에서는 확장된 생체 외 실험을 위해 쥐의 눈에서 망막을 분리하는 자세한 방법론을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 조직에서 망막 신경교세포를 제자리 로 유지함으로써 제공되는 연구 방법을 활용하고자 하는 연구자가 기술적으로 까다로운 접근 방식에 접근할 수 있도록 하는 것을 강조합니다.

마우스 망막의 신경교세포(glial interactions)를 연구하기 위한 생체 외 이식 모델(Ex vivo Explant Model for Study Glial Interactions in the Mouse Retina)

학습하세요 쥐 망막 동맥소리 분리법을 통해 혈관 평활근 수축성과 망막 혈류 조절 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 전기생리학 및 압력 근측정법 연구에 활용됩니다.

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