Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

비정상적인 혈류는 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 분지 정맥 폐색과 같은 시력을 위협하는 다양한 망막 질환의 발병과 관련이 있기 때문에 망막에서 혈류가 어떻게 조절되는지 이해하는 것이 중요한 목표입니다. 망막 세동맥은 내강 직경을 확장하고 수축시킴으로써 망막의 혈류를 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 이러한 혈관을 둘러싸고 있는 평활근 세포의 수축성 변화에 의해 매개됩니다. 따라서 망막 관류 조절의 기초가 되는 분자 메커니즘을 이해하려면 가능한 한 생리학적으로 가까운 조건에서 망막 세동맥 평활근 세포에 접근하고 연구할 수 있는 준비가 필요합니다.

이 비디오에서는 패치 클램프, 칼슘 이미징 및 압력 근조영술 연구에 사용할 수 있는 쥐 망막에서 세동맥을 분리하기 위한 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 지난 몇 년 동안 이 제제는 건강과 질병 모두에서 혈관 평활근 수축성과 망막의 혈류 조절에 대한 추가 통찰력을 제공하는 데 사용되었습니다. 재료 표와 같이 Hanks' 또는 LCH를 함유한 저칼슘 1리터 용액을 구성합니다.

조직을 채취하기 전에 분리 장비를 조립하십시오. 유리 파스퇴르 피펫은 매끄럽게 연마해야하지만 팁을 좁히지 않아야합니다. 플라스틱 피펫을 약 5-7mm의 구멍으로 자릅니다.

LCH 용액에 담근 해부 접시에 눈을 놓습니다. 한 세트의 집게를 사용하여 안와 근육 부착물 또는 시신경을 잡고 접시에 눈을 고정합니다. 눈을 안정시키기 위해 앵커링 포인트가 공막에 최대한 가까운지 확인하십시오.

칼날을 사용하여 오라 세라타를 따라 각막을 절단하고 집게로 공막을 부드럽게 눌러 수정체를 제거합니다. 이 이미지에서 눈 뒤쪽에서 볼 수 있는 작은 원형 영역은 시신경입니다. 블레이드를 사용하여 광학 디스크를 통해 아이컵을 대칭으로 반으로 자릅니다.

닫힌 집게를 사용하여 아이컵의 양쪽 절반에서 망막을 부드럽게 털어내고 시신경 디스크에 남아 있는 부착물을 조심스럽게 제거합니다.두 번째 눈으로 이 과정을 반복하고 플라스틱 피펫과 LCH 배지 소량을 사용하여 절개된 망막을 시험관으로 옮깁니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 시험관에 LCH를 약 5ml까지 채우고 망막이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.

튜브에서 약 4ml의 용액을 제거하고 플라스틱 피펫을 사용하여 새 LCH를 추가하여 조직을 약 3회 세척합니다. 필요한 경우 외부 조직을 제거해야 합니다. 조직이 피펫에 달라 붙는 것을 방지하기 위해 LCH로 광택 처리 된 팁으로 유리 파스퇴르 피펫 내부를 세척하십시오.

동일한 피펫을 사용하여 시험관에서 약 4ml의 용액을 제거하고 약 2ml의 새 LCH를 추가합니다. 유리 피펫 끝을 통해 조직을 천천히 당겨 망막을 부드럽게 해리하고 내용물을 시험관으로 배출합니다. 이 단계에서 거품이 생기지 않도록 하고, 망막이 약 2-3mm 제곱미터 크기로 부서질 때까지 이 과정을 반복한다.

약 2ml의 LCH로 피펫 내부를 세척하고 이를 시험관으로 배출합니다. 내용물이 5분에서 10분 동안 바닥에 가라앉도록 합니다. 조직 조각의 크기가 약 1mm가 될 때까지 앞에서 설명한 대로 약간의 힘으로 분쇄 과정을 반복합니다.

조직이 가라앉을 때까지 기다렸다가 내용물이 완전히 균질화되고 망막 조각이 남지 않을 때까지 훨씬 더 세게 한 번 더 반복합니다. 이 단계의 용액은 외관상 유백색으로 보여야 합니다. 이 기술은 분리당 최대 8개의 세동맥 분절을 생성하며, 길이는 200에서 2, 500마이크로미터입니다.

세동맥의 한쪽 끝을 막고 반대쪽 끝을 폐색하면 근육 반응(myogenic response)이라고도 하는 압력 유도 혈관 수축을 측정할 수 있습니다. 세동맥압 근조영술은 다음과 같이 실시한다. 망막 균질액의 분취량은 도립 현미경의 무대에 장착된 생리학적 기록 챔버로 전달됩니다.

균질산염을 챔버 바닥에 최소 5분 동안 가라앉히도록 둡니다. 기록실을 육안으로 스캔하여 길이가 200마이크로미터보다 크고 혈관을 캐뉼레이션할 수 있는 열린 끝이 있는 동맥을 식별합니다. 가는 집게와 용기 위에 놓인 작은 텅스텐 와이어 슬립을 사용하여 용기의 한쪽 끝을 고정합니다.

텅스텐 와이어의 겹치는 끝을 사용하여 열린 끝이 가압 캐뉼라와 일치하도록 용기를 수조를 가로질러 수평으로 흐르도록 움직입니다. 칼슘이 없는 챔버를 관류합니다.행크스'섭씨 37도. 캐뉼레이션은 유리 피펫으로 수행됩니다.

캐뉼러는 미세한 미세 조작기를 사용하여 용기의 열린 끝에 배치됩니다. 팁은 현미경의 초점면을 조정하여 평가한 바와 같이 개구부에 바로 인접하여 위치하여 혈관의 끝과 캐뉼러 팁이 동시에 초점이 맞춰지고 가압 캐뉼라가 혈관 조리개로 전진합니다. 캐뉼레이션 과정을 돕기 위해 도우미 피펫이 필요하며 세동맥을 부드럽게 억제하고 캐뉼라가 혈관 내강으로 전진하는 동시에 가압 캐뉼라 위로 세동맥 벽을 안내하는 데 사용됩니다.

이 절차는 높은 성공률을 달성하기 위해 두 매니퓰레이터의 동시적이고 통제된 움직임과 광범위한 연습을 필요로 합니다. 0mm의 수은에서 1분 동안 기록한 후 루미날 내 압력이 40mm의 수은으로 증가하고 용기가 빠르게 확장되어 성공적인 캐뉼레이션을 확인해야 합니다. 압력에 의한 혈관 수축, 즉 근육 반응은 이후 약 15분에 걸쳐 진행됩니다.

망막 혈관 평활근 세포의 패치 클램프 기록을 통해 세포 내 칼슘을 조절하여 세포 수축성을 조절하는 원형질막 이온 전류를 조사할 수 있습니다. 전체 세포 및 단일 채널 기록은 다음과 같이 부모 세동맥에 여전히 박혀 있는 개별 평활근 세포에서 가능합니다. 망막 세동맥은 고립되어 텅스텐 와이어 슬립으로 기록 챔버에 고정됩니다.

기저층은 패치 피펫과 세동맥 평활근 세포막 사이에 높은 저항성 밀봉이 형성될 수 있도록 소화되어야 합니다. 세동맥은 섭씨 37도에서 순차적인 일련의 효소 용액과 중첩되어 있으며, 이는 또한 이미지의 화살표로 표시된 것처럼 인접한 세포의 전기적 분리를 초래합니다. 소화 수준은 초기에 콜라겐분해효소 단계에서 내피층과 평활근층의 시각적 분리에 대해 평가됩니다.

기저층 및/또는 말초 신경더미의 남아 있는 가닥을 제거하는 것은 혈관 표면을 따라 미세한 집게의 닫힌 끝을 조심스럽게 쓸어내면 됩니다. 패치 클램핑의 경우, 패치 피펫의 팁을 관심 세포 위에 수직으로 배치하고 마이크로 매니퓰레이터의 미세하고 느린 움직임을 사용하여 세동맥 평활근 막과 접촉하여 점차적으로 내립니다. 이는 세포 이동과 피펫 저항의 변화로 판단되며, 수집 소프트웨어에서 cell seal 테스트 프로토콜을 사용하여 측정됩니다.

피펫이 셀 위로 내려가면 밀봉 저항이 약 5배 증가합니다. 음압이 피펫 뒤쪽에 일시적으로 가해지고 기가씰이 서서히 형성됩니다. 이를 위해서는 1분에서 5분 동안 음압을 반복적으로 가해야 합니다.

전체 세포 기록의 경우 천공된 패치 클램프 방법이 주로 사용됩니다. 앞서 설명한 바와 같이 세포 내 유사 용액과 암포테리신 B를 포함하는 피펫으로 기가씰이 형성되며, 접근 저항은 수집 소프트웨어의 멤브레인 테스트 프로토콜을 사용하여 모니터링됩니다. 액세스 저항이 15메가옴 미만으로 떨어지면 직렬 저항 보상이 수행됩니다.

일반적으로 천공 패치 모드에서 직렬 저항을 약 75%까지 보상할 수 있습니다. 그런 다음 전압 단계 또는 램프 프로토콜을 사용하여 전체 셀 전류를 측정할 수 있습니다. 망막의 해리 후, 1차 세동맥, 2차 세컨더리 세컨더리 세동맥은 세뇨병의 구경과 혈관 평활근 세포의 배열에 따라 식별될 수 있습니다.

1차 및 2차 세동맥은 명시야 현미경 검사에서 시각적으로 유사하게 보이지만 크기에 따라 구별할 수 있습니다. 모세혈관 전 세동맥은 제제에서 가장 작은 동맥 혈관이며 혈관 평활근 세포의 간헐적인 배열로 인해 쉽게 알아볼 수 있습니다. 분리된 세동맥은 격리 내에서 모세혈관 및 정맥과 명확하게 구별될 수 있습니다.

모세혈관은 직경이 약 4-10마이크로미터인 소구경 혈관의 그물망으로 뚜렷한 반면, 정맥은 벽이 얇고 평활근 세포가 덮여 있지 않습니다. 1차, 2차 및 모세혈관 전 세동맥은 압력 근조영술, 칼슘 이미징 및 패치 클램프 연구에 적합합니다. 가압 세동맥을 사용하여 근육 반응 생성과 관련된 분자 메커니즘을 조사했습니다.

이 이미지의 현미경 사진은 압력 근조영술 실험 과정에서 다양한 시점에 있는 쥐의 망막 세동맥을 보여줍니다. 아래의 시간 경과 플롯은 실험의 전체 과정 동안 용기 직경의 변화를 보여줍니다. 가압 직후 혈관이 확장되고, 그 후 15분 후에 정상 상태 수준에 도달하는 활성 근육 수축이 이어집니다.

실험이 끝날 때 칼슘이 없는 Hanks 용액에 wortmannin을 첨가하면 정규화 목적을 위해 용기가 수동 직경으로 확장됩니다. 이 슬라이드는 막 스트레칭 전후에 망막 세동맥 평활근 세포에서 기록하는 단일 채널 패치 클램프의 예를 보여줍니다. 이 온-셀 패치에는 두 개의 스트레치 활성화 TRPV2 채널이 포함되어 있으며, 이 채널은 패치 피펫에 음압을 가하면 활성이 증가합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 연습이 필요하지만 최소한의 문제 해결로 달성할 수 있어야 합니다. 격리된 세동맥은 격리와 같은 날에 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 쥐의 망막 세동맥에 최적화되어 있지만 쥐의 망막에도 사용할 수 있습니다.

이제 우리는 이 제제를 광범위하게 사용했지만, 가능한 경우 ex vivo retinal whole-mounts와 혈관 직경 및 혈류의 in vivo 측정을 사용하여 주요 결과를 검증하려고 합니다.