Name: 검 시 기반 야생 물고기 건강 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 학습하세요 야생 물고기 건강 평가를 위한 검 시 기반 방법으로, 혈액 채취와 조직 수집을 통해 수중 생태계 건강 지표를 분석합니다. 이 기술은 환경 스트레스 요인의 영향을 평가하는 데 필수적입니다.

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이 작품은 미국 지질 조사국의 생태계 (체 서 피크 베이 환경 및 수 산) 및 환경 건강 (생물학 오염 물질) 프로그램 및 자연 자원의 웨스트버지니아 부에 의해 투자 되었다. 상호의 사용 용도로 이며 미국 정부에 의해 승인을 의미 하지 않습니다.

여기에 설명 된 방법 Leetown 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 물고기 컬렉션
<ol><li>스트레스의 최소 살아있는 물고기를 수집 합니다. 보트 또는 배낭 금광, 후크 및 라인 또는 그물 사용 합니다.</li>
	<li>샘플링까지 라이브 웰 또는 화난된 컨테이너에서 물고기를 잡아. 참고: 미국 수 산업 사회 다양 한 물고기 수집, 처리 및 마 취/안락사26,,2728에 대 한 가이드를 출판 했다. 물고기를 처리 하는 경우 장갑을 착용 한다.</li>
</ol>2. 물고기 검 시
<ol><li>
물고기 안락사
	<ol>
<li>Opercular 운동 중단 되 고 물고기 평형까지 마 취에서 물고기를 놓습니다. 또 다른 2-10 분 후 물고기 안락사 될 것입니다; 그러나,이 또한 종에 의해 달라질 수 있습니다. 참고: 물고기 마 취약 (가장 일반적으로 사용 재료의 표 참조)의 번호와 안락사 될 수 있습니다. 안락사의 방법 조직 수집된29에 지휘 될 것 이다 실험실 측정에 따라 달라 집니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
생체 특성을 측정 합니다.
	<ol>
<li>물고기를 가장 가까운 그램 무게.</li>
		<li>가장 가까운 밀리미터에 물고기 길이 측정 합니다.<ol>
<li>때 함께 슬쩍 꼬리의 끝을 입으로는 주 둥이의 끝에서 총 길이 측정 합니다.</li>
			<li>주 둥이의 끝에는 꼬리에 포크에서 포크 길이 몸 (꼬리의 시작 부분)의 끝에 주 둥이의 끝에서 표준 길이 측정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음 수식을 사용 하 여 상태 인자를 계산. 조건 요소 = (총 몸 무게-생식 체중) / 총 길이3. 참고: 생식 무게에서에서 뺍니다 총 몸 무게 때문에 생식 선 prespawn 여성 생선에 특히 총 몸 무게에 크게 기여할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈액 샘플을 가져옵니다. 참고: 혈액 꼬리 정 맥에서 가장 일반적으로 가져온 것입니다 하지만 수 있습니다 또한 등 쪽 대동맥에서 철회 될 또는 심장에 의해 찔린30.<ol>
<li>물고기의 크기에 따라 1 ~ 5 mL 주사기에 22 또는 23 G 바늘 꼬리 정 맥에서 주변 혈액 샘플을 추출 합니다. 옆 선 (그림 1A 및 1B) 아래 꼬리 영역 앞쪽 바늘을 삽입 합니다. 척추를 타격까지 그것을 위쪽으로 각도 약간 철수 다음. 정 맥은 overlying 척추 복 부. 참고: 혈액 얼룩을 만들 것입니다 또는 혈 청이 필요한, 아니 응고 제 사용 됩니다. 대부분의 경우, 플라즈마를 수집 합니다 그리고, 따라서, 항 응고 제 헤 파 린 나트륨, EDTA 등 리튬 코트 바늘과 주사기를 사용 하 고 또한 혈액 컬렉션 튜브 (예를 들어, vacutainer).</li>
		<li>바늘을 제거 하 고 혈액 컬렉션 튜브에 퍼 팅 전에 sharps 처리 컨테이너에 배치. 참고: 혈액 얼음에 개최 될 수 있습니다 있지만 후속 분석에 따라 가능한30곧 centrifuged 한다.</li>
		<li>핵 이상 또는 차동 혈액 조사, 평가 하는 경우 즉시 중복 깨끗 한 유리 현미경 슬라이드에 혈액 한 방울을 놓습니다. 다음 모 세관 작용에 의해 표면에 걸쳐 그려 놓기에 45 ° 각도로 두 번째 슬라이드를 다시. 31건조를 허용 합니다.</li>
		<li>원심 침전 물에 15 분 동안 1500-2500 x g 에서 혈액 세포. 살 균 전송 피펫으로, 극저온 튜브에 aliquot와 함께 혈장/혈 청을 제거 하 고-80 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig1.jpg"> 그림 1 : 물고기에서 혈액 샘플을 얻기. (A) 최근 안락사 한 물고기의 측면에 있는 옆 라인 꾸며져 있다. (B) 바늘 삽입 된 복 부 선 (화살표), 바늘 등뼈 접촉 될 때까지 위쪽으로 각도 옆에 이다. 그것은 다음 약간, 철회 하 고 흡입 혈액을 철회 하기 시작. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="4"><li>
각 물고기에 검 시 기반 상태 평가 실시 합니다. 참고: 설명 및 병 변 및 이상 게시 수가 있습니다 사용할 수32,33,,3435.<ol>
<li>문서 외부 이상 몸 표면 및 지 느 러 미 (그림 2), 눈과 아가미 (그림 3), 거머리 (그림 2D), grubs 또는 trematode metacercarial cysts (그림 2D, 같은 외부 기생충에 병 변 등 3B) 및 아가미 기생충 (그림 3D). 문서 유형, 위치 및 크기의 데이터 시트에서 관찰 된 이상으로 사진 뿐만 아니라, 가능한 경우.</li>
		<li>한가 위를 사용 하는 내부 장기를 노출 하는 operculum에 항문 지역에서 절단 하 고 근육의 플랩 제거 여 복 부 구멍 (그림 4A)를 엽니다. 참고: 이전 신장 수집 될 경우 면역에 대 한 함수 (아래의 5 단계 참조) 또는 샘플 또는 바이러스학 세균 학에 대 한 수집, 외부 몸 표면 70% 알코올로 소독 한다는 검 시를 수행 하기 전에 그 샘플을 얻을 수 있어야. 조직만 시각적 관찰, 플라즈마 분석과 histopathology 살 균에 사용 되는 경우에 기술을 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>문서 내부 이상 (그림 4) 등 다양 한 장기 (그림 4B-4D)의 존재의 일반 또는 초점 변색 (그림 4E), cysts, 기생충, 고 이상 (크기 확대, 위축 시키는).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig2.jpg"> 그림 2 : 보이는 병 변의 예 몸 표면에 물고기의 지 느 러 미 관찰. (A) A 작은, 약간 침식 병 변 (화살표) 측면 몸 표면에. (B) 대형 reddened 영역 (화살표) 꼬리 몸 표면에 관련 된. (C) 올린, 몸 표면과 지 느 러 미에 검은 병 변 (화살표) (D) 거머리 (흰색 화살표) 고은 지 느 러 미에 작은 검은색 반점 (검은 화살표). 눈금 막대 = 3 mm. (E), A multilobed, 창백한 병 변 (화살표) 몸 표면에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig3.jpg"> 그림 3 : 아가미의 보이는 병 변 및 물고기의 눈의 예. (A) A 영역 (화살표) 눈의 렌즈를 창백. 눈금 막대 = 5 mm. (B) 백색 cysts (흰색 화살표) 및 취재 (a) 아가미 operculum에 trematode 기생충으로 인 한 작은 검은색 반점 (검은 화살표). 눈금 막대 = 1 cm. (C) A 창백, 침식 영역 (화살표)에 길 (a). 눈금 막대 = 5 mm. (D)은 기생충 (화살표)를 보여주는 제거 된 길 길 필 라 멘 트에 연결 된. 눈금 막대 = 2 m m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig4.jpg"> 그림 4: 는 검 시 및 물고기의 내부 이상 예. (A)는 검 시 동안 물고기는 자르면 (흰색 화살표)을 따라와 근육 (검은색 화살표)의 플랩 생식 선 (a)와 집게와가 위 개최 되 고, 비장을 제거. (B) 룩 간 (a), testes (b), 내장 둘러싸인 지방 지방 (c)와 복 부 (d). 눈금 막대 = 5 mm. (C) (a)와 어두운 빨간색 영역 (화살표), 난소 (b) 내장 (c) 간. 눈금 막대 = 5 mm. (D) 간 녹색 변색 영역 (화살표). 눈금 막대 = 1 cm. (E) (a) 정상의 예 고와 비정상적인 testes (b) 제기 혹. 눈금 막대 = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="5"><li>
Hepatosomatic 지 수 (HSI)를 가져옵니다.
	<ol>
<li>간 간 동맥과 앞쪽 끝의 결합 조직 절단 하 여 제거 합니다. 부드럽게 트리밍 유착 및 다른 연결 내장 및 많은 지방 질을 동안 밖으로 리프트. 쓸 개를 펑크 하지 주의 하십시오. 간 무게. 참고: 일부 물고기, cyprinids, 같은 필요가 없습니다 개별 간 하지만 오히려 간 조직 감싸 내장 및 다른 기관. 이 종 간 가중치를 얻을 수 하지 않을 수 있습니다.</li>
		<li>Hepatosomatic 인덱스 (HSI) 수식을 사용 하 여 계산 합니다. HSI 간 무게/총 몸 무게 =</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gonadosomatic 인덱스를 계산 합니다.
	<ol>
<li>생식 기를 제거 하 고 그것의 무게.</li>
		<li>Gonadosomatic 인덱스 (GSI) 수식을 사용 하 여 계산 합니다. GSI 생식 무게/총 몸 무게 =</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 현미경 병 리에 대 한 조직 유지
참고: fixatives Z-수정, 아연, 포 르 말린 기반 정착 액 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 등의 숫자 필드에는 조직의 보존을 위해 사용할 수 있습니다. 후자는 원하는 경우에 현장에서 교 잡 또는 형광 항 체 염색 같은 방법을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>조심 스럽게 잘라 하지만 조직 샘플을 꺼내 하지 마십시오. 개별 조직 조각을 계속 &lt; 크기가 2 cm와 &lt; 적절 한 고정을 위한 두께 5 m m. 엄지손가락의 규칙으로 서 볼륨 조직 보다 약 10 배 더 많은 정착 액을 사용 하 여 적절 한 보존에 대 한. 샘플링 되는 물고기의 크기에 따라 적절 한 크기의 동일한 누출 방지 용기에 생선에서 모든 조직 샘플을 배치 합니다.</li>
	<li>통 컨테이너에 모든 외부 이상의 조각을 놓으십시오. 또한, 정상 조직의 인접 한 조각 포함. 참고: 부적 절 한 압축 또는 다른 기계적 손상, 공기 나 햇빛에 긴 노출 처리 및 동결 아티팩트가 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>다양 한 지역에서 간 최소 5 3-4 m m 두꺼운 조각을 잘라 고 통 컨테이너 합니다. 관찰 하는 경우에, 정상 및 비정상 영역을 포함 합니다.</li>
	<li>크기에 따라 전체 생식 또는 한 생식 선 따라 여러 통 용기에 놓습니다.</li>
	<li>통 컨테이너에서 전체 기관, 작은, 경우 또는 다른 모든 장기 (비장, 앞쪽 및 후부 신장, 아가미, 심장, 대 장 및 위)의 조각 장소. 비정상적인 조직 관찰 되는 경우 뿐만 아니라 정상 조직에의 한 인접 한 조각을 유지 합니다.</li>
</ol>4. 나이 분석은 Otoliths 제거
참고: 나이 물고기 질병/물고기 건강 연구에 중요 한 변수가 될 수 있습니다. 다양 한 구조, 비늘 등 쪽이, 나이 확인을 위해 사용 되었다, 구조를 비교 하는 대부분 학문을 주고 최상의 결과36,37otoliths를 발견 했다. Teleost 물고기 otoliths-lapillus, sagitta 및 asteriscus의 3 쌍 있다. 일반적으로, 화살 또는 lapillus otoliths는 종에 따라 다를 수 있지만 노화 수집 됩니다. 제거 및 노화 기술 이전 설명된38되었습니다.
<ol><li>길 지협을 통해 고 머리를 뒤로 구 부. 스트립 거리 연결 및 근육 조직 prootic bullae, 제기 뼈 다 귀 영역을 찾을 수 neurocranium의 열 등 한 부분 주위.</li>
	<li>점수 또는 뼈 절단기로 절단 하 고 폭은 otoliths로 균열. 그들은 맨 눈으로 볼 수 있습니다.</li>
	<li>Otoliths 이라는 유리병 또는 동전 봉투와 반지 또는 증가38세 나이 대 한 분석까지 실내 온도에 상점에 배치 합니다. 경우는 유리병에 모자 한 번 실험실에 반환 열고 철저 하 게 수 있도록 저장 하기 전에 건조 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig5.jpg"> 그림 5 : Otoliths의 제거. (A) 지협 잘라 고 결합 조직 및 근육 떨어져 척추와 neurospinal 지역의 폭로. (B)는 뼈는 otoliths를 폭로 부 쉈 다. (C) Lapillar otoliths 제거 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
5. 면역 기능 분석에 대 한 조직을 구하십시오
참고: 이전 신장 주요 조 혈 기관, 세포 및 대 식 세포 기능 분석에 대 한 소스 이며 aseptically 셀 mitogenesis, phagocytic 등 살인 능력의 기능 분석을 위한 교양 것입니다 경우 제거 해야 합니다. 대 식 세포39,40.
<ol><li>70% 에탄올과 물고기의 외부 표면 스프레이. 살 균가 위, 메스와 집게를 사용 하 여 복 부 구멍을 열고 수영 방광 앞쪽에 위치 하는 어두운 빨간색 기관 이다 앞쪽 신장 조직을 제거 하.</li>
	<li>미디어 (예를 들어, Leibovitz L-15) 세포를 살아 있는 유지 하에 앞쪽 신장 샘플을 놓습니다. 단일 셀 정지로 살 균 휴대용 조직 분쇄기 (예를 들어, Tenbroeck 조직 분쇄기) 신장 샘플을 균질. 젖은 얼음 실험실에 반환 될 때까지 만요.</li>
</ol>6. 핵 산 분석에 대 한 조직 유지
참고: 사본 풍부41 또는 정량 PCR42 (연쇄 반응)를 사용 하 여 유전자 발현 등 다운스트림 분자 분석 실시 하는 경우는 적절 한 부식 방지 제 ( 에서에서 평가 될 조직의 조각을 놓으십시오 예를 들어, RNAlater 안정화 솔루션) 가능 한 한 빨리.
<ol><li>RNA 보존 조직에 방부 제 볼륨의 10:1 비율로 적절 한 방부 제에 2 ~ 3 작은 (2-3 m m) 조각을 놓으십시오. 참고: 샘플 햇빛 또는 과도 한 열 차폐 및 젖은 얼음에 수송 되어야 한다.</li>
	<li>DNA 보존에 대 한 95% 에탄올 (볼륨에 의해 조직에 에탄올 10:1)으로 조직의 2 ~ 3 작은 조각을 놓으십시오. 다음 샘플 젖은 얼음에 누른 후-20 ° c.에 저장</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

물고기 건강의 검 시 기반 평가는 탐정 모두 외부 및 내부 구조의 정상적인 외관에 대 한 이해는 어떤 어 종에 활용할 수 있습니다. 표준화 된 접근을 사용 하 여 계절과 일시적인 변화는 인구에서 뿐만 아니라 사이트와 종 간 비교에 대 한 수 있습니다. 결과 점과 nonpoint 근원 오염 물질의 연관 효과 식별 하 고 관리 작업 정보를 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 개선 관리 작업은 시작 되 면 추적을 사용할 수 있습니다. 방법론은 다양 한 방법으로 시각적 외부 이상의 문서를 증가 시키기 위해 수정할 수 있습니다. 평가, 시각적 관찰에만 기반으로 비-치명적인, 상대적으로 저렴 한 될 수 있으며 개인의 큰 숫자에 대 한 데이터를 신속 하 게 생성 될 수 있습니다. 따라서, 그들은 탐구 또는 초기 평가, 변화를 모니터링 하는 데 유용할 수 있습니다 또는 다른 지표와 함께에서 시간이 지남에. 길이 및 물고기의 무게는 시각적 관찰 하는 동안, 측정 조건 요소 계산 또한 수 있습니다. 평가 기반 시각적 관찰에만 있지만 원인에 관련 된 위험 요인, 특정 피부 이상45 의 긴 기간 동향 정보를 제공 하지 않습니다 및 생체 매개 변수46 일부 지역에서 개선 표명 수 질 개선 관련.
검 시 기반 평가 내부 장기 검사 또한 hepatosomatic 인덱스와 gonadosomatic 인덱스와 같은 다른 조건 요소 산출 될 수 있다 더 많은 정보를 제공 합니다. Goede 및 바튼22 혈액 매개 변수, 생체 인식 요인, 이상, 그리고 특정 이상에 대 한 인덱스 값의 비율을 포함 하는 필드 검 시 방법 개발. 메서드의 상세 포함 몇 가지 변수를 계산 될 수 있는 건강 평가 지 수의 비교 통계23대 한 허용에 대 한 심각도 등급. 이 건강 평가 인덱스 사용 되었습니다 지역 사이트 비교23,,4748 및 조합 미국 지질에 플라즈마 및 histopathological 분석을 포함 한 다른 생물 지표 조사의 Biomonitoring 환경 상태와 동향 프로그램 큰 강 전국49,,5051에서 오염 물질 노출의 잠재적 영향을 평가. 물고기 질병 색인 외부에서 볼 수 질병에 따라 커지고 기생충, 보이는 간 신생 및 기타 histopathologically 간 장애를 개발 하 고 북 해, 발트 해 그리고 아이슬란드에서 광범위 하 게 사용. 이 인덱스는 생태계 건강 지표52중요 한 도구가 될 것 발견 되었다.
물고기에 검 시 기반 평가 실시에 몇 가지 중요 한 요인이 있다. 첫째, 평가 물고기 죽음 후 즉시 실시 해야 합니다. 기관 색깔과 일관성 있는 변화는 죽음 이후 상당히 빠르게 발생할 수 있습니다. 또한, 일부 기생충 죽음 후 곧 호스트를 떠날 수 있습니다. 둘째, 무슨 관심의 종류에 대 한 정상 인지 중요 하다. 예를 들어, 일부 물고기 일반적으로 지방 있고 대부분의 종에 대 한 비정상적인 것 창백한 간 하는 동안 따라서, 간은, 창백. 그것은 또한 자연스럽 게 발생 하는 계절 변화를 인식 하는 것이 중요입니다. 일부 물고기 색상 변경 또는 산란 기 동안 사육 tubercles 개발 됩니다.
물고기 건강 평가 위한 방법으로 검 시 기반 평가의 한계 1) 일관 되 게 특정 장애의 "원인"를 확인 하 고 2) 식별 효과 육안으로 보이지 않을 수 있습니다를 포함 합니다. Histopathology, 병원 체와 기생충, 유전자 발현의 분자 또는 문화 식별의 추가 함께 이러한 단점을 극복할 수 있습니다. 예를 들어, "종양" 또는 제기 병 변 (붓기) 실제 neoplasia 있을 수 있습니다 또는 기생충, 염증, 부 종이 있을 수 있습니다 또는 증식 (정상 세포의 수 증가), 화학 노출, 전염 성 요원 또는 다른 irritants에 기인. 대표 결과 같이 확실 한 종양 또는 신 생물 진단 현미경 병 리를 병 변의 종류와 심각도 (즉, 양성 또는 악성) 식별 하 필요 합니다. 시각적인 관찰 하 여 종양"흰 빠 외부"의 평가 기준 사이트에서 특히 유행 과대평가. 올려진된 병 변의 많은 신생 하지만 오히려 형성 병 변 되지 않았다. 그것은 현재 알 수 없습니다이 형성 병 변 인지 미리 종양 약. 반대로, 제기 혹 간에서 관찰은 크게 간 신생의 보급을 과소 평가. 따라서, 미세한 병 리에 대 한 조직의 컬렉션 적절 하 게 폐지에 대 한 가능성을 해결 하는 데 필요한 했다.

인간의 활동은 수생 환경에 수많은 불리 한 영향을 미칠. 물고기 인간의 인구에서 재현 하 고 식 수 원본으로 자주 사용 하는 다양 한 물 시체를 살고 있으며 따라서 수생 환경의 건강의 중요 한 지표. 야생 물고기를 라이브 하 고 특정 서식 지에서 재현 병원 체, 기생충, 가난한 수 질 그리고 화학 오염 물질을 포함 한 다양 한 스트레스를 그들의 삶을 통해 노출 됩니다. 화학 물질의 수천 산업 및 인간의 폐수, 교외/도시 stormwater 및 농업 결선을 통해 우리의 수로 입력합니다. 화학 물질의 복잡 한 혼합물이 수 첨가제, 시너지 나 대립 효과에 노출 생물1,2,3. 또한, 다른 환경 스트레스와 같은 높은 영양분, 온도 상승된, 낮은 용 존된 산소 또는 변동 pH 화학 오염 물질4,5의 효과 악화 수 있습니다. 환경 스트레스 또한 영향을 미칠 수 전염병 결과 전염 성 요원6의 수를 증가,7 기회 주의 병원 체 독성을 증가 또는 억제 면역 반응과 질병에 의해 직접 호스트8,,910의 저항. 이러한 이유로11,12,,1314, 물고기 및 식별 하는 다른 수생 생물 모니터링 생물 학적 또는 불리 한 효과에 대 한 관심 증가 인구 그리고 생태계 위험에.
부작용 모니터링 biomarkers subcellular 또는 분자, 인구를 좌우 하 고 나타내는 다양 한 스트레스에 노출 될 수 있습니다 sublethal 효과 식별 하는 organismal에서 조직의 다양 한 수준에서 활용 합니다. 유기 체 수준 표시기 표시 이상 등 조건입니다. 길이 무게에 따라 조건 인덱스 복지 또는 물고기 인구의 적합성을 평가 하기 위해 계산 됩니다. 가장 일반적인 풀턴의 조건을 요인 (K)는 = (무게/길이3) 15. 또 다른 표시기 표시 이상의 존재입니다. 다양 한 방법 평가, 문서, 및 표시 이상 평가 개별 연구와 모니터링 프로그램에 사용 되었습니다. 평가 외부 이상, 즉, 개인 질병, 지 느 러 미 손상, 종양 및 골격 변칙의 비율을 기반으로 지역 사회 건강16평가 생물 무결성 (비)의 색인에 대 한 통계 중 하나입니다. 비슷한 평가 되 나 DELTs (기형, 아픕니다, 병 변, 종양) 또한 물고기 지역 사회17의 상태 평가를 사용 되었습니다. 그러나,이 방법만 외부 시각 이상 및 안 내부 병 변 또는 조기 sublethal 지표 평가.
검 시 기반 평가 외부 및 내부 관측을 포함 하 고 추가 상태 지표의 측정에 대 한 허용. Hepatosomatic 색인 (간 무게/총 몸 무게)는 체력의 지표로 서 사용 되었습니다 또는 에너지 보유15 높은 인덱스 값 건강 한 물고기를 나타냅니다. 그러나, 연구의 수 비 대 또는 간 크기 증가 간18,,1920에 의해 물질 대사로 변화 하는 다양 한 오염 물질에 노출으로 인해 발생 합니다 나타났습니다. 이 경우에 더 높은 색인 특정 화학 클래스에 노출의 나타내는 것입니다. Gonadosomatic 인덱스 (생식 선 무게/총 몸 무게)는 생식 건강21으로 지시 하는 다른 조건 인덱스가입니다. 검 시 기반 평가 동안 관측 개별 병 변 종류의 유행 또는 정상적인 개인의 비율 비교를 사용할 수 있습니다. 그러나, 그들은 또한 더 양적 건강 평가22,23에서 사용할 수 있습니다.
여기에 설명 된 표준화 검 시 기반 평가 질문 답변, 전문 및 기타 사용 가능한 리소스에 따라 여러 가지 방법으로 조잡 한 볼 수 평가 증가 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 우리의 일상적인 방식은 (길이, 무게, 간 무게, 생식 선 무게) 생체 인식 데이터를 수집, 혈액 혈장/혈 청 분석, 문서 외부 및 내부 표시 이상, 현미경 분석에 대 한 장기의 보존 및 수집에 대 한 otoliths 나이 분석. 검 시 기반 평가 플러스 나이 분석 및 다양 한 기관의 histopathology 계산 및 다양 한 상태 지표의 비교, 볼 수 이상, 미세한 조직 변경의 보급에 대 한 섹스, 나이, 사이트 및 샘플링 기간입니다. 전자 현미경 검사 법, 세균 학, 바이러스학, 기생충학 및 화학 농도 포함 하 여 다른 많은 분석에 대 한 추가 조직 컬렉션을 만들 수 있습니다. 이 방법은 또한의 일부분일 수 있다 물고기 죽이기24 의 원인을 진단 하는 데 사용 하는 더 깊이 있는 분석 또는 포로의 mortalities 물고기25. 두 개의 추가 분석, 유전자 발현 및 기능 면역 분석에 대 한 조직의 컬렉션에 대 한 방법 설명 됩니다.

<table><tbody><tr><td>접이식 테이블</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>접이식 의자</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 보드</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>측정 보드 (mm)</td> <td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>배터리 구동 저울 (g) 물고기 무게에 대한</td><td>모든</td> 배터리 구동 저울 (mg) 모든 장기 무게에 대한 모든 <td></td><td></td></tr><tr><td>배터리 구동 저울 (mg)</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 겸</td>자, <td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뼈 절단기,</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스 및 칼날</td>, <td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 장갑</td>, <td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>양동이,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>누출 방지 Nalgene 병(250mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-924-5C</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨이 함유된 진공 튜브</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-689-6</td><td>혈액 수집용</td></tr><tr><td>일회용&nbsp; 23 G 바늘이 있는 3 mL 주사기</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-826-11</td><td></td></tr><tr><td>1 &ndash; 2 mL cryovials</td><td>혈</td><td></td><td>장 및 RNAlater 샘플에 사용</td></tr><tr><td>Invitrogen RNAlater 안정화 솔루션</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Z-Fix 포름알데히드 Zinc fixative</td><td>Anatech LTD</td><td>SKU-174</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td><td>Syndel USA</td><td></td><td>물고기 마취</td></tr>제 <tr><td>동전 봉투</td><td></td> 이<td>석,</td>연필 및 펜용 모든 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 알코올</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>데이터 시트</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

검 시 기반 야생 물고기 건강 평가

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

서식 변경 및 기후 변화, 증가 영양소와 화학 오염 물질, anthropogenic 영향 물고기 인구에 상당한 영향을 가질 수 있습니다. 부작용 모니터링, 물고기 및 다른 유기 체에 누적 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다 분자 수준에 있는 organismal에서 바이오 마커를 활용 하 여. 물고기 건강은 수생 생태계 건강의 지표로 서 세계적으로 사용 되었습니다. 검 시 기반 물고기 건강 평가 표시 이상 및 병 변, 기생충, 상태 및 organosomatic 인덱스에 데이터를 제공합니다. 이러한 사이트, 계절과 섹스, 뿐만 아니라 일시적으로, 시간이 지남에 문서 변화를 비교할 수 있습니다. 심각도 등급 더 양적 평가 대 한 물고기 건강 인덱스를 계산 하기 위해 다양 한 관측에 할당할 수 있습니다. 검 시 기반 평가의 단점은 시각적 관찰과 조직 및 sublethal 효과 대 한 subcellular 생체로 구분 되지 않은 상태 요인에 기반. 또한, 그것은 거의 원인 또는 관찰 된 이상와 관련 된 위험 요소를 식별 수 있습니다. 그래서, 예를 들어 올려진된 병 변 또는 "종양" 지 느 러 미, 입술 또는 신체 표면에 있을 수 있습니다는 신 생물. 그러나, 그것은 또한 기생충, 만성 염증 또는 자극에 대 한 응답에 정상 세포의 증식에 대 한 응답 수 있습니다. 반대로, 신생, 특정 기생충, 기타 전염 성 요원 및 많은 조직 변화 표시 되지 않습니다 고 너무 과소 평가 될 수 있습니다. 그러나, 검 시 기반 평가, 혈액 (플라즈마), histopathology (현미경 병 리)에 대 한 조직, 유전체학 및 다른 분자 분석 및 노화에 대 한 otoliths 수집할 수 있습니다. 지리 공간 분석, 서식 지 평가, 함께이 다운스트림 분석, 수 질 및 오염 물질 분석 모두 수 포괄적인 생태계 평가에 중요 한.

오대호 지역은 우려 (AOC)의 다양 한 도움이 사용의 장애 때문에 지정 된 지역 이다. 많은 AOC에서 유익한 사용 장애 (뷔이) 중 하나입니다 물고기 종양 또는 다른 기형. 수백만 달러의는 다양 한 뷔이 고 궁극적으로 AOC43이번이 하려면 이러한 각 분야의 복원 및 업데이트 관리에 대 한 지출 되었습니다. 부이 다른 주 (epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf 및 dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf 참조); 물고기 종양 폐지에 대 한 기준 그러나, delisting 문서에서 설명 했 듯이, 일부 경우 피부 종양 및 간 종양의 발병 률을 결정 하는 필요는. 많은 경우에, 유행 아닌 AOC 참조 사이트에 비교 됩니다.
물고기 종양 부이 호수 슈페리어와 미시간, 흰 빠 (Catostomus 야가 라의 검 시 기반 평가 활용 하 여 3 개의 AOCs (세인트 루이스 강, 밀워키 강 기선 강)와 비 AOC 참조 사이트 (Kewaunee 강)에 평가 되었다 ), 뒤에 피부와 간 조직의 미세한 병 리. 물고기 2012 및 201344 밀워키, 기선 및 Kewaunee 강에서 2015 (되지 않은 데이터)에서 세인트 루이스 강에서 수집 했다. 2 백 화이트 풋 내기, 밀워키, 세인트 루이스, Kewaunee와 기선에서 193 평가 됐다.
정의 함으로써, 종양 수 붓기 또는 제기 영역, 비록 그것은 일반적으로 조직의 비정상적인 세포의 비정상적인 성장으로 인 한 붓기 중 양성 또는 악성 신 생물은 간주 됩니다. 모든 사이트에서 수집 하는 흰색 빠 병 변의 외부 제기 작은, 이산 흰 반점, 더 큰 흰색 영역, 약간 제기 mucoid 변과 몸 표면 및 입술 (그림 6)에서 multilobed 제기 영역을 포함 하 여 다양 한 전시. 물고기 했다 무게 조건 요소를 측정, 외부 및 내부 이상 문서화 되었다, 그리고 피부와 간 조직 histopathology 수집 했다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig6.jpg"> 그림 6 : 제기 피부 병 변 관찰 오대호에서 흰색 빠에. (몸 표면에 A)는 개별 화이트 명소입니다. 눈금 막대 = 5 mm. (B) 약간 mucoid (화살표) 및 multilobed 병 변 (a) 후부 몸 표면에. 눈금 막대 = 1 cm. (C) A 큰, multilobed 병 변 신체 표면에. 눈금 막대 = 1 cm. (D) 입술에 수많은 멀티 lobed 병 변. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
외부 종양 물고기의 백분율 또는 제기 변색 영역 58.0% 밀워키 AOC에서 세인트 루이스 AOC에서 15.5%에서 ranged. 일반적으로, 개별 흰 반점 multilobed 입술과 몸 표면 병 변은 가장 일반적인 최소 공통 시각 병 변 이었다. 관찰 간 혹와 물고기의 수 낮은, 밀워키 (표 1)에서 2.5 %Kewaunee 세인트 루이스에서 1.5%에서 배열 했다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="4">샘플링 해 강</td>
		</tr>
<tr>
<td>보이는 병 변</td>
			<td>Kewaunee 2013</td>
			<td>세인트 루이스 2015</td>
			<td>기선 2012</td>
			<td>밀워키 2013</td>
		</tr>
<tr>
<td>개별 흰 반점</td>
			<td>16</td>
			<td>3</td>
			<td>3.1</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mucoid</td>
			<td>20</td>
			<td>9.5</td>
			<td>9.8</td>
			<td>30.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multilobed</td>
			<td>22.5</td>
			<td>3</td>
			<td>29.5</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 발생 피부 이상이는
</td>
			<td>46</td>
			<td>15.5</td>
			<td>38.3</td>
			<td>58</td>
		</tr>
<tr>
<td>보이는 간 혹</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.6</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
는 올려진된 병 변으로 물고기의 총 수입니다. 일부 물고기는 여러 유형의 이상 했다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 흰색 빠의 검 시 기반 관측 비율으로 관심사 및 참조 사이트 (Kewaunee 강), 오대호 지역에서 수집. 시각적인 검사는 다양 한 이상으로 물고기의 %를 사용할 수 있습니다. 그러나, 결정적으로 진단 하려면 존재 및 신 생물의 종류, 조직 시험 되어야 한다 현미경 (histopathology). 현미경 검사, 시 제기 변의 모든 종양 약 했다 발견 했다. 많은 개별 흰 반점과 Kewaunee에서 특히 mucoid 병 변 형성 병 변 보다는 신 생물 (표 2) 했다. 또한, Kewaunee와 세인트 루이스, 관찰 하는 피부 종양의 모든 양성 갑 했다. 기선와 밀워키 갑와 편평 세포 carcinomas, 악성 피부 종양, (표 2) 관찰 되었다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="4">샘플 강의</td>
		</tr>
<tr>
<td>신 생물 유형</td>
			<td>Kewaunee 2013</td>
			<td>세인트 루이스 2015</td>
			<td>기선 2012</td>
			<td>밀워키 2013</td>
		</tr>
<tr>
<td>유 두 종</td>
			<td>21</td>
			<td>5.2</td>
			<td>30.5</td>
			<td>37.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>편평 세포 암 종</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2.1</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 스킨 신생</td>
			<td>21</td>
			<td>5.2</td>
			<td>32.6</td>
			<td>48</td>
		</tr>
<tr>
<td>담 즙 덕트 신생은한
</td>
			<td>2.5</td>
			<td>4</td>
			<td>6.2</td>
			<td>9.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>간 세포 신생b
</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>2.1</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 간 신생</td>
			<td>3.5</td>
			<td>4</td>
			<td>8.3</td>
			<td>15.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
는 Cholangioma 및 cholangiocarcinoma 포함</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
b 간 세포 adenoma 및 간 세포 암</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
c 일부 물고기가 했다 담 관 그리고 간 신생</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 현미경 비율으로 관심사 및 참조 사이트 (Kewaunee 강), 오대호 지역에서 수집 된 흰색 빠의 종양 약 병 변 확인. Histopathological 분석은 또한 시각적 관찰에 의해 식별 되지 했다 간 종양을 확인. 동안 Kewaunee와 세인트 루이스에서 수집한 물고기의 1.5%만 보이는 간 혹 (표 1), 3.5%와 4.0%, 각각, 현미경으로 발견 했다 신생 (표 2). 큰 차이 기선 (보이는 미세한 8.3% 대 1.6%), 밀워키 (15.0% 미세한 대 표시 2.5%)에서 보였다. 또한 간장 세포 기원 (표 2) 대 담 즙 덕트의 신생의 감 별 법을 제공 하는 현미경 검사와 악성 종양 대 양성.

수생 생태계 건강의 지표로 서 야생 물고기의 건강을 사용할 수 있습니다. 검 시 기반 물고기 건강 평가 제공 보이는 병 변 또는 이상, 조직 현미경 평가, 유전자 발현 및 다른 더 깊이 수집 하는 기회 뿐만 아니라 상태 지표를 계산 하는 데 사용 하는 데이터 분석입니다.

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

부검 기반 어류 건강 평가는 일상적인 모니터링, 현장을 비교하는 특정 연구 및 보다 심층적인 분석을 위한 조직 수집의 기초를 위해 야생 어류의 건강을 평가하는 데 사용됩니다. 물고기는 화학 물질, 병원균 및 기생충의 복잡한 혼합물과 같은 스트레스 요인의 조합에 지속적으로 노출됩니다. 이러한 스트레스 요인의 조합은 질병 저항성 감소, 암 및 생식 기능 부전과 같은 부작용으로 이어질 수 있습니다.시연된 기술을 통해 눈에 보이는 이상에 대한 표준화된 평가와 조직 병리학을 위한 혈액 및 조직, 연령에 대한 이석 및 기타 다운스트림 분석을 위한 조직 수집을 수행할 수 있습니다. 먼저 우리는 한 마리의 물고기를 사용하여 조직 병리학을 위한 혈액, 이석 및 조직 수집을 통한 일상적인 부검 기반 평가를 시연할 것입니다. 면역 기능 분석을 위한 전방 신장 수집 및 유전자 발현을 위한 간 또는 기타 조직을 이 방법에 추가하는 것도 이 방법에 추가되는 것으로, 이 또한 시연할 것입니다.사후 변화를 피하기 위해 가능한 한 빨리 조직을 수집하는 것이 중요합니다. 따라서 우리는 일반적으로 2-3명이 조직을 수집하고 다른 사람이 데이터를 기록하는 조립 라인 공정을 가지고 있습니다. 웨스트 버지니아 대학교의 박사 과정 학생인 헤더 월시(Heather Walsh)와 샤이엔 스미스(Cheyenne Smith)와 최근 박사 학위를 취득한 라이언 브래햄(Ryan Braham)이 프로세스의 다양한 단계를 시연할 예정입니다.제도적 지침에 따라 물고기를 채취하여 안락사시킨 후, 물고기의 무게를 측정하고 혈액 샘플을 채취합니다. 다음으로 끝에서 꼬리 끝까지 물고기의 총 길이를 측정합니다. 이전에 헤파린으로 코팅된 22 또는 23 게이지 바늘이 있는 3개의 CC 주사기를 측선 아래의 꼬리 영역 앞쪽에 삽입합니다.척추에 닿을 때까지 필요를 위쪽으로 기울이고 약간 빼서 혈액 샘플을 얻습니다. 혈액 샘플을 수집 튜브로 옮기기 전에 바늘을 제거하고 날카로운 물건 통에 넣으십시오. 당일 여행의 경우 실험실로 돌아올 때까지 젖은 얼음에 혈액을 보관할 수 있습니다.그런 다음 분석 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관 된 플라즈마를 제거하기 위해 원심 분리됩니다. 매일 실험실로 돌아가지 않는 경우 원심분리기와 드라이아이스 보관이 필요합니다. 다음으로, 물고기의 몸, 지느러미, 눈 및 아가미에 있는 외부 이상이나 병변을 문서화합니다.물고기에 거머리, 유충, trematode, metacercarial cysts 및 gill 기생충과 같은 외부 기생충이 있는지 검사합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 항문 부위에서 수술실까지 복강을 엽니다. 근육의 플랩을 제거하여 내부 장기를 노출시킵니다.내부 장기를 검사하고 일반적인 및 국소 변색, 융기 부위의 존재, 낭종, 기생충 및 크기 이상을 문서화합니다. 다음으로 간을 제거하려면 간동맥과 앞쪽 끝의 결합 조직을 절단합니다. 담낭에서 간을 부드럽게 들어 올리고 담낭에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 장과 지방 지방에 대한 유착 및 연결을 다듬습니다.간의 무게를 잰다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 간체 지수를 얻습니다. 다음으로 생식선을 제거하고 무게를 잰다.당기지 않고 조심스럽게 작은 조직 샘플을 잘라냅니다. 한 물고기의 조직 샘플을 같은 용기에 넣습니다. 다음으로, 간의 다양한 영역에서 최소 5, 3-4mm 두께의 조각을 잘라 고정 용기에 넣습니다.크기에 따라 고정 용기에 생식선 전체 또는 생식선 조각을 넣으십시오. 그런 다음 더 작은 전체 장기와 다른 큰 장기 조각을 고정 용기에 넣습니다. 비정상적인 조직이 관찰되면 정상 조직의 인접한 추가 조각을 보존합니다.비늘, 지느러미 광선 및 이석과 같은 수많은 구조를 사용하여 물고기를 노화시킬 수 있습니다. 여기서 우리는 가장 정확한 이석을 사용하고 있습니다. 먼저 아가미 지협을 자르고 머리를 뒤로 구부립니다.그런 다음 prootic bulla를 찾기 위해 신경두개골의 하부 부분 주위의 결합 및 근육 조직을 제거합니다. 뼈 절단기를 사용하여 뿌리 수포를 부수고 이석을 노출시킵니다. 이석은 육안으로 볼 수 있어야 합니다.이석을 라벨이 부착되고 뚜껑이 없는 바이알에 넣고 연령 분석을 수행할 수 있을 때까지 실온에서 보관합니다. 수많은 화학 물질 및 기타 환경 스트레스 요인에 노출되면 면역 억제가 발생할 수 있습니다. 림프구, 대식세포 및 과립구는 이 조직에서 분리할 수 있으며 실험실에서 병원체를 죽이고, 항체를 생성하고, 종양 세포에 반응하고, 다른 기능을 수행하는 능력을 측정할 수 있습니다.멸균 가위를 사용하여 메스와 집게를 사용하여 신장 앞쪽 조직을 제거합니다. 세포가 살아 있도록 전방 신장 샘플을 적절한 매체에 놓습니다. 멸균 휴대용 조직 분쇄기를 사용하여 샘플을 단일 세포 현탁액으로 균질화합니다.그리고 샘플을 젖은 얼음 위에 올려 놓습니다. RNA 보존을 위해 2-3개의 작은 간 조각을 적절한 방부제에 10:1 비율로 방부제와 조직 간의 비율로 놓습니다. 이 연구에서는 3개의 오대호 우려 지역(AOC)과 참조 사이트인 Kewanee River에서 흰 빨판을 수집했습니다.외부 종양이 있는 물고기의 비율은 세인트루이스 AOC의 15.5%에서 밀워키 AOC의 58%까지 다양했습니다. 눈에 띄지 않는 흰 반점, 약간 융기된 점액성 병변, 큰 유두종 병변을 포함한 여러 유형의 외부 병변이 관찰되었습니다. 이 연구에서 관찰된 많은 불연속적인 흰 반점과 점액성 병변, 특히 Kewanee 참조 부위는 신생물과 반대되는 과형성 병변이었습니다.조직병리학적 분석은 또한 육안 관찰로 식별할 수 없는 간 종양을 확인했다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되면 물고기 한 마리당 15-20분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 특정 종에 대해 무엇이 정상인지 알고 이상을 설명할 때 가능한 한 일관되고 정확하게 설명하는 것이 중요합니다.크기, 색상, 질감 및 위치를 포함합니다. 사진 설명서가 유용합니다. 이 기술은 모든 어종에 사용할 수 있으며 환경적 스트레스 요인의 부작용을 더 잘 이해하고 침입성 질병을 식별하기 위해 공간적 및 시간적으로 물고기 건강을 문서화하는 데 유용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

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검 시 기반 야생 물고기 건강 평가

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