Name: 제자리에 Myelinated 축 삭에 스펙트럼 Reflectometric 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 학습하세요 스펙트럼 반사측정법(SpeRe)을 이용하여 마우스 뇌 조직에서 무표시 나노스케일 수초돌기 축삭 구조를 분석하는 방법을. 이 기술은 복잡한 표지 없이도 생체 내 수초돌기 플라스틱과 탈수초화 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 기초 과학 연구소 (IBS-R015-D1)에 의해 그리고 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 교육부 (2017R1A6A1A03015642)에 의해 자금에 의해 지원 되었다.

모든 수술 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 성균관 대학에 의해 승인 되었다.
1. 샘플 준비
참고: 오토 클레이 브 동물 처리 하기 전에 모든 수술 기구. 수술에 전념 한 방에 모든 수술 성능을 수행 합니다. 수술 실에서 모든 직원에 의해 불 임 수술 가운과 장갑을 항상 착용 되어야 한다.
<ol><li>
조직의 고정
	<ol>
<li>각 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 4 %paraformaldehyde (PFA) PBS에 가득 두 10 mL 주사기를 준비 합니다.</li>
		<li>7 12 주 된 마우스 (C57BL/6J 이나 어느 성별 어떤 마우스 라인) zoletil와 xylazine (1:1, 20 mg/kg 각) 또는 다른 적합 한 마 취 정권 (예를 들어, 80 mg/kg 케 타 민 고 10 mg/kg의 혼합물의 혼합 투여 하 여 anesthetize xylazine)는 복 주사로.</li>
		<li>마우스에는 마 취 (발가락 핀치-응답 방법 사용)의 수술 평면에 도달 했습니다, 일단가 위 피부와 흉 곽을 절단 하 여 마음을 노출 합니다.</li>
		<li>오른쪽 아 트리 움 분출 혈액과 바늘으로 순차적으로 좌 심 실 통해 PBS와 PFA 솔루션 perfuse 작은 위로 싹 둑 (관류 속도 4 mL/min, 볼륨 = = 각 솔루션에 대 한 10 mL). 참고: 마우스 뻣 뻣 한 경우 프로시저가 성공적으로 완료 됩니다. 눈 연 고 또는 살 균의 사용 절차는 터미널로 필요 하지 않습니다. 고정 절차를 건너뛸 수 있습니다. 그러나,이 단계는 구조적 변형 기계적 조직 손상 등 허 혈 성 axonal 붓기를 최소화 하기 위해 권장 됩니다. 에 대 한 자세한 내용은 조직 고정, 게이지, G. J. 그 외 여러분 에 의해 문서를 참조 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
두뇌 슬라이스 준비
	<ol>
<li>복 부 흉부와 복 부를 통해 수술가 위로 마우스를 목을 벨.</li>
		<li>두 피와과 완벽 하 게 노출 된 두개골까지 적당 하 게 작은 위를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>전 뼈를 휴식 하 고 두뇌를 손상 않기로 주의 작은 위를 사용 하 여 후 두 뼈에서 화살 봉합을 따라 두개골을 잘라.</li>
		<li>부드럽게는 두개골 및 dura mater 미세 집게를 사용 하 여 순차적으로 제거 합니다.</li>
		<li>뇌를 조직을 손상 하지 않도록 주의 복용, 부드러운 플라스틱 숟가락을 사용 하 여 압축을 풉니다.</li>
		<li>린스 및 4 ° c.에 30 분 동안 4 %PFA 솔루션에서 추출한 뇌를 담가</li>
		<li>vibratome을 사용 하 여 100-150 µ m 섹션으로 고정된 두뇌를 슬라이스. 참고:에 대 한 자세한 내용은 조직 준비, 참조 문서 Segev 외. 11. 후속 절차, 조직 해야 될 슬라이스 섹션으로는 스페이서의 두께 보다 얇은.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
뇌 조각의 장착
	<ol>
<li>각 조직 조각 1 유리 슬라이드와 2 평방 커버 안경 (22 × 22 × 0.17 m m)를 준비 합니다.</li>
		<li>반으로 잘라 사각형 커버 안경 중 하나 (2 개의 직사각형 조각) 유리 커터를 사용 하 여.</li>
		<li>슈퍼 접착제를 사용 하 여 슬라이드 유리에 등분된 커버 안경의 두에 연결. 참고: 두 개의 등분된 안경 사이 공간 조직 조각의 크기 보다 약간 더 큰 수 한다.</li>
		<li>브러쉬 또는 한 피 펫을 사용 하 여 뇌 슬라이스를 수확 하 고 슬라이드 유리는 공백 사이 조직 하다. 알아서 하지 조직 접어.</li>
		<li>조직 표면에 PBS의 100 μ 분배.</li>
		<li>조직 위에 다른 평방 덮개 유리를 두십시오. 이 단계 동안 공기 방울의 포함을 하지 마십시오.</li>
		<li>후속 이미징 세션 동안 먼지에 의해 PBS의 증발 및 오염을 방지 하기 위해 매니큐어 (또는 또는 적당 한 접착제)를 사용 하 여 덮개 유리 주위 인감. 참고:는 실험이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 보정
<ol><li>현미경 적어도 1 시간에 전환 하기 전에 레이저의 열 안정화 수 있도록 영상 소스 ( 재료의 표참조). 다음, 소프트웨어 스펙트럼 스캔 ( 재료의 표참조)를 설정 하 고 GUI (그림 3a). 의 정상 취득 버튼을 클릭
</li>
	<li>백색-빛 레이저 (WLL) 및 광 전 증폭 관 관 (PMT) (그림 3a)에 대 한 소프트웨어 셔터를 켭니다.</li>
	<li>획득 모드에서 드롭-다운 목록에 xyΛ 모드 를 선택한 다음 레이저 입력된 모드는 일정 한 힘을 일정 % 에서 자동으로 변경 된다. 자동 SP 움직임의 확인란 선택을 취소 합니다. 다음, 470-670 nm와 4 스펙트럼 스텝 크기 입력된 레이저의 스펙트럼 창 설정 Λ에 nm-여기 람다 스캔 설정 (그림 3b).</li>
	<li>두 번 클릭 하거나 막대를 이동 하면 조정 스펙트럼 범위 (그림 3c) 450-690을 PMT의 스펙트럼 범위를 설정 합니다. 참고:이 스펙트럼 범위 입력 소스의 완전 한 대역폭을 포함 해야 합니다.</li>
	<li>적당 하 게 높은 수 가늠 구멍으로 물 침수 대물 렌즈 선택 (NA > 0.7) AOBS 구성 및 라이브 스캔 버튼을 활성화 하려면 PMT와 레이저 파워에 어떤 가치를 부여 하 고. AOBS 구성 (그림 3)에서 반사를 확인 하 여 광학 경로 전환 합니다.</li>
	<li>참조 미러 마운트 ( 재료의 표참조) 현미경 스테이지. 미러 표면 목표 렌즈에 대 한 직면 한다. 그렇지 않으면 미러 현미경 무대에 넣어 쉽게, 플랫 플레이트 (예: 슬라이드 유리)에 미러 본드.</li>
	<li>거울 표면에 초점 비행기를 정렬할 현미경 단계를 제어 합니다.</li>
	<li>PMT 이득 및 레이저 전력 검출기의 동적 범위를 고려 하 고 조정 하 고 일정 한 힘을 일정 % 에서 레이저 입력된 모드를 변경 합니다. 참고: 일반적으로 PMT 500 (V)의 고 0.1%의 상대 레이저 파워 570에 사용 된다 nm.</li>
	<li>파장 범위에 걸쳐 채도 없음 확인 의사 색상 모드에서 확인 합니다. 채도 관찰 되는 경우 낮은 레이저 파워 (그림 3a).</li>
	<li>람다 검색 인수를 실행 합니다.</li>
	<li>무대에서 미러를 제거 하 고 어두운 참조 (즉, 어두운 오프셋)를 얻기 위하여 샘플 없이 동일한 수집을 반복 합니다.</li>
	<li>Multistacked TIF 형식에 데이터를 저장 합니다.</li>
</ol>3. SpeRe 이미지 수집
<ol><li>탑재 된 조직 현미경 스테이지에 배치 합니다. 대물 렌즈의 초점면에 조직을 맞추려면 대략 눈 조각을 통해 넓은 필드 형광 모드를 사용 합니다.</li>
	<li>라이브 검색 에, 조직에 대 한 관심의 영역에 초점 비행기를 정렬할 현미경 단계 제어할. 커버 슬립에서 배경 잡음을 방지 하려면 유리-조직 인터페이스에서 적어도 15 μ m 깊이의 대상 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>취득 단계 2.1-2.10에서에서 설명한 대로 동일한 절차를 사용 하 여 대상 지역에 대 한 스펙트럼 이미지 스택.</li>
	<li>Multistacked TIF 형식에는 조직 및 어두운 오프셋에 대 한 데이터를 저장 합니다. 참고:는 실험이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 이미지 처리 및 분석
<ol><li>ImageJ에서 참조 거울과 뇌 조직에 대 한 스펙트럼 데이터 (multistacked TIF)를 엽니다.</li>
	<li>열린된 이미지 스택을 ROIs (관심 지역) 선택-참조 거울과 뇌 조직에 대 한 축 삭 섬유의 세그먼트에 대 한 중앙 지역.</li>
	<li>실행 이미지 → 스택 → 선택한 ROIs에 대 한 원시 스펙트럼을 취득 ImageJ 메뉴에서 플롯 z 축 프로필 .</li>
	<li>어두운 오프셋된 데이터, 참조 거울 하 고는 다른 뇌 조직에 대 한에 대 한 하나를 엽니다.</li>
	<li>실행 이미지 → 스택 → 어두운 오프셋에 대 한 스펙트럼을 취득 ImageJ 메뉴에서 플롯 z 축 프로필 .</li>
	<li>복사 및 붙여넣기 옵션을 사용 하 여 모든 인수 스펙트럼을 저장 합니다. 참고: SpeRe 이미징, 꺼짐-축 광학 착오를 최소화 하기 위해 중앙 이미지 필드의 사용은 권장 됩니다. 축 삭 섬유는 구조적으로 그들의 길이 따라 다른 유형의 수 있습니다. 따라서, 작은 축 삭 세그먼트에 ROI를 선택 하면, 일반적으로 부분 볼륨 유물을 최소화 하기 위해 < 5 µ m 것이 좋습니다.</li>
</ol>5. 기준선 보정 및 SpeRe 신호 분석
<ol><li>뇌 조직과 참조 거울의 스펙트럼에서 오프셋된 스펙트럼을 뺍니다.</li>
	<li>스펙트럼의 최대 강도 분할 하 여 각 스펙트럼을 정상화.</li>
	<li>참조 거울의 정규화 된 스펙트럼에 의해 축 삭의 정규화 된 스펙트럼을 분할 하 고 정규화 된 스펙트럼에서 DC 오프셋을 뺍니다.</li>
	<li>피팅 한 정현파를 인수 스펙트럼 wavenumber 주파수 측정 곡선 ( 재료의 표참조), 그리고 다음 복용 상호 여 주기 인수 wavenumber를 변환할.</li>
	<li>그림 4c에서 방정식을 사용 하 여 축 삭 직경 wavenumber 주기를 변환 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

저자 선언 경쟁 금융 관심사: 제이 권 및 M. 최는 특허 출원 중인 기술이이 문서에서 설명의 발명가.

SpeRe는 새로운 라벨 무료 이미징 형식 스펙트럼 간섭계는 처음으로 라이브 myelinated 축 삭에서 나노 정보 제공에 따라 이다. 현재 수집 프로토콜에서 축 삭 직경에 대 한 공간적 해상도 10의 순서의 이다 nm. 또한, SpeRe 크기 순서 낮은 빛 복용량 다른 슈퍼 해상도 microscopies;에 비해 활용 따라서, phototoxicity 및 photobleaching에서 무료입니다. SpeRe myelinated 축 삭의 나노 역학 공부에 대 한 새로운 길을 제공할 것 이다.
여기에 설명 된 프로토콜 acousto-광학 및 포인트 검출기 (즉, PMT)에 의해 중재 스펙트럼 검색 기반으로 합니다. 이 방식은 스펙트럼 이미지 보기의 전체 필드의 획득에 유리 합니다. 그러나, 시간 해상도 일반적으로 우리의 현재 구성 > 15 s 스펙트럼 검사에 의해 제한 됩니다. 대 안으로 서, 작은 보기 필드9의 실시간 ...

포유류 신 경계에서 수 초 다층된 막 덮개와 축 삭 섬유 enwrapping 여 빠른 신경 전도 및 axonal 무결성 제공 합니다. 그것의 다층된 구조 번갈아 나노 박막-필름 플라즈마 세포 막의 구성의 구성 (~ 5 nm), cytosol (~ 3 nm), 및 세포 외 공간 (~ 7 nm)1,2. 광학 현미경 검사 법, 최근 슈퍼 해상도 현미경을 포함 하 여 광학 회절3,,45로 인해 부족 한 해상도 인해 나노 myelin 역학을 관찰을 위한 적합 하지 않습니다. 전자 현미경은 myelin nanostructure의 좋은 정보를 제공할 수 있습니다, 그것은 화학 고정 및 ultrasectioning6,7 매우 침략 샘플 준비 인 생활 생물 학적 시스템와 호환 . 최근까지, 거기 되었습니다 아무 기술 나노 역학 myelinated 축 삭 제자리의 관찰에 적용.
Schain 외. 이전 myelinated 축 삭 다채로운 빛 반사율8전시 보고. 채택 하 여 반사 된 빛의 분 광 분석, 우리는 새로운 이미징 형식 스펙트럼 셋 (SpeRe)9라는 myelinated 축 삭의 나노 이미징에 대 한 고안 했다. SpeRe 박막 간섭 myelin 칼 집 (그림 1)의 다층된 구조에서 발생을 기반으로 합니다. 다양 한 축 삭에 광학 시뮬레이션에 의해 우리는 밝혀 그 반사율 스펙트럼 wavenumber 및 그것의 주기 주기 기능 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">)은 축 삭 직경 (d)에 반비례 한다. 이 간단한 관계 (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) SpeRe 데이터에서 축 삭 직경의 손쉬운 정량화를 제공 합니다. 이 활용 하 여, 우리가 우리의 이전 보고서에서 온화한 외상 성 뇌 손상에서 불 룩 유행 축 삭을 밝혔다.
SpeRe 시스템 confocal 현미경 검사 법에 따라 특수 레이저 소스 구성 되어 있으며 필터 (그림 2). 입력된 소스 화이트 라이트 레이저, 광대역 스펙트럼 출력 적외선 영역 표시를 제공 하는. 스펙트럼 검사에 대 한 시스템은 갖추고 두 acousto 광학 장치: 반영 선택한 지도 대 한 입력된 광대역 소스와 acousto 파이버 빔 스플리터 (AOBS)에서 선택 된 파장을 제공 하는 acousto 광학 가변 필터 (AOTF) 검출기의 파장 Hyperspectral confocal 현미경 검사 법에 대 한 소프트웨어 ( 재료의 표참조) 순차적으로 다양 한 입력된 파장에서 반사율 이미지를 수집 하는 사용자 정의 스펙트럼 스캔 옵션을 제공 합니다. 또한, 색수차 수 있습니다 비판적으로 간섭 스펙트럼 측정; 따라서,는 apochromat 렌즈의 사용을 권장 합니다.
메모의 화이트 라이트 레이저 고르지 스펙트럼 출력을 생성 하 고 광학 구성 요소 스펙트럼 프로필에도 영향을 줍니다. 따라서, 인수 스펙트럼 후속 정량 분석에 대 한 보정 필요. 보호은 거울은 일반적으로 전체 표시 영역 위로 거의 일정 한 반사율 (&gt; 97%)을 제공 하는 참조로 사용 됩니다. 인수 스펙트럼 다음 미러에서 참조 스펙트럼으로 나누어집니다.
스펙트럼 검사에 대 한 스펙트럼 스텝 크기 결정 수집 속도; 따라서, 그것은 최적화가 필요 합니다. 더 큰 축 삭은 더 높은 스펙트럼 기간, 그것은 스펙트럼 샘플링을 세밀 하 게 필요 합니다. 예를 들어 가장 큰 생리 축 삭 중 10 µ m의 직경을 가진 축 삭 스펙트럼의 기간이 ~ 8 nm. 나이 키스 트 샘플링 조건을 적용 하 여 우리 고용 스펙트럼 샘플링 간격 4 nm 마우스 신경 조직에서 모든 생리 축 삭을 커버. 이 방법은 일반적으로 전체 스펙트럼 검사에 대 한 몇 초 동안 걸리며 따라서 적합 하지 않습니다 vivo에서 응용 프로그램 (예: 호흡 및 심장 박동) 생리 모션 안정적 스펙트럼 수집을 방해. 우리는 이전 배열 분석기 (수집 속도 ≈ 픽셀 당 30 밀리초)를 사용 하 여 각 지점에 대 한 전체 스펙트럼을 확보 하도록 설계 된 사용자 지정된 수직 현미경 계측 하 여이 문제를 해결.
이 보고서에서 우리는 상업 hyperspectral 현미경에서 실행 될 수 있는 고정된 뇌 조각에 SpeRe 이미징에 상세한 프로토콜을 설명 ( 재료의 표참조). 따라서, 프로토콜 광 계측에 전문성 없이 경험 하 여 완료할 수 있습니다. 우리는 또한 잠재적인 문제 및 수집 및 SpeRe 데이터의 분석에 대 한 문제 해결을 커버.

<table><tbody><tr><td>유리 절단기</td> <td>-</td><td></td> <td>지역 편의점이나 온라인 상점에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>매니큐어</td> <td>--</td><td></td> <td>지역 편의점이나 온라인 상점에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>아포크로맷 대물렌즈 40&, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>침수형</td></tr><tr><td>Fluoromyelin Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>또는 Fluoromyelin Red(F34652)를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>자세한 내용은 소개 섹션의 "현미경 구성"을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X-Matlab</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>보호된 은으로 코팅됨.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>-</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>두께: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td></tr><tr><td>슬라이드 유리</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>두께: ~1 mm</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>디스펜싱 장비를 사용하여 피부나 눈의 접촉을 피하십시오.</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000</td><td></td></tr> <tr><td>DUAL-Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td></td> <td>VT1200S-White-light</td></tr> <tr><td>laser</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6이 단종되어 EXU-6로 대체되었습니다.</td></tr></tbody></table>

제자리에 myelinated 축 삭에 스펙트럼 reflectometric 현미경

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

포유류 신 경계에서 수 초 다층된 소용돌이에 축 삭 섬유 enwrapping 여 전기 절연을 제공 합니다. 그것의 높은 조직 subcellular 아키텍처에 의해 영감을, 우리 최근 전례 없는 레이블 없는 나노 이미징 라이브 myelinated 축 삭 제자리의 가능 하 게 스펙트럼 셋 (SpeRe) 라는 새로운 이미징 적임 개발. 기본 원리는 다층된 subcellular 구조의 반사율 스펙트럼을 분석 하 여 nanostructural 정보를 얻을 것입니다. 이 문서에서는, 우리는 화이트 라이트 레이저와 가변 필터 상업 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 신경 조직의 기본 SpeRe 이미징 수행 하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 샘플 준비, 스펙트럼 데이터 및 nanostructural 정보를 얻기 위해 처리 하는 이미지의 취득의 절차 설명 합니다.

프로토콜에 따라 고정된 뇌 조각 exogenous 얼룩, myelin 타겟팅 fluorophore과 준비 ( 재료의 표참조). SpeRe 이미징 confocal 형광 이미징 (그림 4a)와 함께에서 상업 hyperspectral confocal 현미경을 사용 하 여 두뇌 조각에서 수행 되었다. SpeRe, 5 µW / µ m2 ~ 1 µs의 픽셀 드웰 타임을 입력된 광 강도 설정 되었습니다. 이 빛 복용량은 순서의 크기는 기존의 형광 confocal 현미경 검사 법12보다 낮은. 그것은 걸립니다 ~ 17 이상의 스펙트럼 스캔 s 4의 간격으로 470-670 nm nm (51 이미지).
SpeRe 신호는 광 반사의 형상에...

여기, 우리는 레이블 없는 나노 이미징 기술 스펙트럼 셋에 기반을 사용 하 여 고정된 뇌 조각에 myelinated 축 삭 이미징을 위한 단계별 프로토콜 제시.

제자리에 Myelinated 축 삭에 스펙트럼 Reflectometric 현미경

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

이 기술은 미엘린 가소성 및 탈수초화와 같은 미엘린 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복잡한 라벨링이나 샘플 준비 없이 온전한 뇌 조직에서 수초화된 축삭돌기의 나노 구조를 연구할 수 있다는 것입니다. 여기에서는 뇌 절편에 적용하는 방법을 시연하겠지만 이 기술은 살아있는 동물로 확장될 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 마우스 뇌 조직을 고정하고 절단한 후 각 조직 절편에 대해 하나의 유리 슬라이드와 두 개의 커버 유리를 준비합니다. 유리 커터를 사용하여 사각 커버 안경 중 하나를 반으로 자릅니다. 그런 다음 초강력 접착제를 사용하여 두 조각을 유리 슬라이드에 부착하여 스페이서를 만듭니다.브러시나 피펫을 사용하여 뇌 절편을 채취하고 조직을 접히지 않도록 주의하면서 스페이서 사이의 유리 슬라이드에 조직을 놓습니다. 조직 표면에 100마이크로리터의 PBS를 분배합니다. 그런 다음 기포가 유입되지 않도록 티슈 위에 두 번째 사각형 커버 유리를 놓습니다.매니큐어를 사용하여 커버 유리 주위를 밀봉하여 PBS의 증발과 후속 이미징 세션 동안 먼지에 의한 오염을 방지합니다. 이미징하기 최소 1시간 전에 현미경을 켜서 레이저 소스의 열 안정화를 허용합니다. 그런 다음 스펙트럼 스캔을 위해 소프트웨어를 켜고 GUI 상단의 획득 버튼을 클릭합니다.백색광 레이저 및 광전자 증배관의 소프트웨어 셔터를 켭니다. 획득 모드의 드롭다운 목록에서 XY 람다 모드를 선택합니다. 그런 다음 레이저 입력 모드가 일정한 퍼센트에서 일정한 전력으로 자동으로 변경됩니다.lambda excitation, lambda scan settings(람다 여기, lambda scan settings)에서 automatic SP movement(자동 SP 이동) 상자를 선택 취소하고 입력 레이저의 스펙트럼 창을 470-670나노미터로, 스펙트럼 단계 크기를 4나노미터로 설정합니다. 스펙트럼 범위에 대한 조정 막대를 두 번 클릭하거나 이동하여 PMT의 스펙트럼 범위를 450 - 690 나노미터로 설정합니다. 높은 개구수를 가진 water-immersion 대물 렌즈를 적절하게 선택하십시오.PMT 및 레이저 출력에 값을 부여하여 AOBS 구성 및 라이브 스캔 버튼을 활성화합니다. AOBS 구성에서 반사를 확인하여 광학 경로로 전환합니다. 다음으로, 표면이 대물 렌즈를 향하도록 현미경 스테이지에 참조 거울을 장착합니다.현미경 스테이지에 거울을 놓는 것이 쉽지 않다면 평판에 거울을 부착하십시오. 현미경의 스테이지를 조정하여 초점면을 거울 표면에 정렬합니다. 그런 다음 검출기의 동적 범위를 고려하여 PMT 게인과 레이저 출력을 조정합니다.pseudocolor 아래에서 파장 범위 전체에 채도가 없는지 확인합니다. 채도가 관찰되면 레이저 출력을 낮추십시오. 그런 다음 lambda scan acquisition을 실행합니다.스테이지에서 미러를 제거하고 어두운 참조를 얻기 위해 샘플 없이 동일한 수집을 반복합니다. 그런 다음 데이터를 다중 스택 TIF 형식으로 저장합니다. SpeRe 이미지 획득을 수행하려면 장착된 조직을 현미경의 스테이지에 놓습니다.조직을 대물 렌즈의 초점면에 대략적으로 정렬하려면 접안렌즈를 통해 광시야 형광 모드를 사용하십시오. 라이브 스캔을 켠 상태에서 현미경의 스테이지를 제어하여 초점면을 조직의 관심 영역에 정렬합니다. 커버슬립의 배경 소음을 방지하려면 유리 조직 인터페이스에서 최소 15마이크로미터 깊이의 대상 영역을 선택하십시오.이 비디오의 앞부분에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하여 타겟 영역에 대한 스펙트럼 이미지 스택을 획득합니다. 그런 다음 조직 및 어두운 오프셋에 대한 데이터를 다중 스택 TIF 형식으로 저장합니다. ImageJ에서 이미지를 처리하려면 참조 미러와 뇌 조직에 대한 스펙트럼 데이터를 엽니다.열린 영상 스택에 대한 ROI를 선택하고, 참조 미러에 대한 중앙 영역을, 뇌 조직에 대한 축삭 섬유의 세그먼트를 선택합니다. 그런 다음 이미지, 스택, 플롯 Z축 프로파일을 실행하여 선택한 ROI에 대한 원시 스펙트럼을 획득합니다. 축삭 섬유는 길이를 따라 구조적으로 이질적일 수 있으므로 일반적으로 5마이크로미터 미만의 작은 축삭 분절에서 ROI를 선택하여 부분 부피 아티팩트를 최소화하는 것이 좋습니다.하나는 참조 미러에 대해 측정하고 다른 하나는 뇌 조직에 대해 가져온 어두운 오프셋 데이터를 열고 방금 설명한 대로 Z축 프로파일을 플로팅합니다. 그런 다음 복사 및 붙여넣기 옵션을 사용하여 획득한 모든 옵션을 저장합니다. baseline correction 및 SpeRe 신호 분석을 수행하려면 reference mirror와 뇌 조직의 스펙트럼에서 offset 스펙트럼을 빼십시오.스펙트럼의 최대 강도를 나누어 각 스펙트럼을 정규화합니다. 실험에 사용된 파장의 역수를 취하여 파수를 입력하고, reference mirror의 스펙트럼을 나누어 축삭의 스펙트럼을 정규화하고, 정규화된 스펙트럼에서 DC 오프셋을 뺍니다. 그런 다음 획득한 스펙트럼을 정현파에 피팅하여 파수 주파수를 얻습니다.역수를 취하여 획득된 파수 주파수를 주기성으로 변환하고 여기에 표시된 방정식을 사용하여 파수 주기성을 축삭 직경으로 변환합니다. 이 실험에서는 고정된 뇌 절편을 미엘린에 대해 형광 염색하고 SpeRe 이미징을 기존 형광 컨포칼 현미경 검사보다 한 단계 낮은 광량으로 수행했습니다. SpeRe 신호는 광학 반사의 기하학에 의해 예상되는 대로 수초화된 축삭의 중심을 따라 국한되었습니다.축삭돌기 분절의 반사 스펙트럼에서 파수 주기성을 얻었고, 이는 이후에 축삭 직경으로 변환되었습니다. 이 그래프는 여기에서 박스형 영역에서의 형광 강도의 횡단 프로파일을 보여주며, SpeRe로 측정한 직경은 형광 기반 측정과 양호한 것으로 나타났습니다. SpeRe 이미징은 광학 반사를 기반으로 합니다.따라서 실리카 기반 커버슬립은 상당한 배경 소음을 유발할 수 있습니다. 광학 설정에서 커버슬립의 이미징 깊이가 5마이크로미터 미만일 때 배경 노이즈가 상당했지만 이미징 깊이가 15마이크로미터보다 클 때 피할 수 있었습니다. 보정 단계가 모든 실험에 필요한 것은 아니지만 적어도 일주일에 한 번 권장됩니다.보정이 완료되면 이미징 절차는 일반적으로 각 시야에 대해 20초 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 전체 스펙트럼 스캔을 위해 검출기의 동적 대기 시간을 고려해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 반사율 이미지를 사용하여 수초화된 축삭에서 나노 구조를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

spectral-reflectometric-microscopy-on-myelinated-axons-in-situ

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

출처: Kwon, J., et al., Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ.  J. Vis. Exp. (2018) 이 비디오는 초분광 컨포칼 현미경과 함께 분광 반사 측정을 사용하여 간섭 패턴을 분석하고 고정된 뇌 조직 절편에서 수초화된 축삭 직경을 결정하는 방법을 보여줍니다.

Using Spectral Reflectometry to Determine Myelinated Axon Diameters in a Fixed Mouse Brain Slice

출처: McCullagh, E. A., et al. 뇌 절편의 수초화 이미징을 위한 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 적용. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 설치류 뇌 조직의 신경 구조를 시각화하기 위한 형광 및 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 이미징을 보여줍니다. Nissl 염색은 리보솜 RNA에 결합하여 세포체를 표지하는 반면, CARS 이미징은 레이저 유도 신호를 통해 지질이 풍부한 미엘린을 표적으로 삼습니다. 형광 및 CARS 이미지를 오버레이하면 세포체와 수초가 있는 축삭에 대한 자세한 보기를 제공합니다.

마우스 뇌 조직에서 수초 뉴런을 시각화하기 위한 Coherent Anti-Stokes Raman 분광법

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

우리는 축삭돌기 및 미엘린 손상의 역학을 실시간으로 동시에 시각화하기 위해 이광자 여기 타임 랩스 현미경을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 제안된 프로토콜은 손상 후 중심 수초화된 축삭돌기의 운명에 영향을 미치고 영구적인 임상적 장애에 기여할 수 있는 내적 및 외적 요인에 대한 연구를 가능하게 합니다.

전의 VIVO 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

수초화를 시각화하는 것은 신경계를 연구하는 많은 연구자들에게 중요한 목표입니다. CAS는 미엘린과 같은 특수 구조를 조명하는 뇌와 같은 조직 내에서 지질을 기본적으로 이미지화할 수 있는 면역형광법과 호환되는 기술입니다.

뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증의 동물 모델 역할을 합니다. 이 기사에서는 EAE에서 척수 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 채점하는 접근 방식을 설명합니다. 또한, 생쥐 혈청에서 용해성 신경 필라멘트 광 수준을 정량화하는 방법이 제시되어 살아있는 생쥐의 축삭 손상 평가를 용이하게 합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

학습하세요 스펙트럼 반사측정법(SpeRe)을 이용하여 마우스 뇌 조직에서 무표시 나노스케일 수초돌기 축삭 구조를 분석하는 방법을. 이 기술은 복잡한 표지 없이도 생체 내 수초돌기 플라스틱과 탈수초화 연구에 활용됩니다.

제자리에 Myelinated 축 삭에 스펙트럼 Reflectometric 현미경

더 많은 동영상 탐색