Name: 젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 학습하세요 포유류 세포에서 대량 자가소화 격리 활동을 측정하는 검증된 프로토콜을 LDH 분석을 통해. 이 방법은 인공 프로브 없이 내인성 화물 격리를 정량화하여 다양한 세포 유형과 처리 조건에서 자가소화 연구에 활용됩니다.

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이 작품 연구 위원회 노르웨이, 오슬로의 대학, 앤 더 스 년 재단, 난센 재단, 그리고 헨릭 Homan의 메모리에 유산에 의해 재정적으로 지원 되었다. 우리 박사 벅 미즈시마는 ATG5에 대 한 감사 + + MEFs와 ATG5-/-MEFs, 박사 마사 아키 고마쓰는 ATG7에 대 한 + + MEFs 및 ATG7/MEFs, 및 박사 시즈 아키라는 ATG9A에 대 한 + + MEFs 및 ATG9A/MEFs. 우리는 건설적인 방법 론 적 토론에 대 한 기술 지원과 O. Seglen 당 박사에 대 한 프랭크 Sætre을 감사합니다.

1. 셀 시드 및 치료
<ol><li>
셀에 대 한 선호 문화 매체를 사용 하 여 37 ℃에서 5% CO2 습도 인큐베이터에서 75 cm2 조직 배양 플라스 크에 문화 부착 셀에 입력 합니다. 근처 합칠 셀 계층에 도달할 때까지 성장 하는 세포 수 있습니다. 참고: 사용 하 여 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) LNCaP, HEK293, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), 비제이에 대 한 보충 RPMI 1640 매체 MCF-7 및 RPE-1 셀.<ol>
<li>워시 3 mL 37 ° C 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), pH 7.4와 셀. 3 mL 0.25% (w/v) 트립 신-ethylenediaminetetraacetate (EDTA), PBS를 장착 하 고 세포 분리 (2-5 분) 때까지 37 ° C에서 5% CO2 습도 인큐베이터에 플라스 크를 품 어.</li>
		<li>10%를 포함 하는 7 mL 문화 매체와 분리 된 셀 resuspend FBS. 혼합 10 µ L 셀 서 스 펜 션 약 수 10 µ L 0.4 %Trypan 파랑 microcentrifuge 튜브에서 0.5-20 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여. 동일한 피 펫 팁을 사용 하 여 즉시 계산 챔버 슬라이드를 작성 하 고 자동화 된 셀 카운터에 셀.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
 <ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><ol><li><li><li></li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> </li><li> </li><li></li><li><li></li></ol><ol><li> </li><li><li><ol><li><ol><li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol></li><li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li><li><li><li></li><li><li><li> </li></ol><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg"></li></ol>

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<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exponential+growth+of+autophagy-related+research%3A+from+the+humble+yeast+to+the+Nobel+Prize%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize.</a> FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).</li>
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<li>Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelysosomal+convergence+of+autophagic+and+endocytic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways.</a> Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).</li>
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<li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+j%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li>
<li>Szalai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+bulk+sequestration+of+cytosolic+cargo+is+independent+of+LC3%2C+but+requires+GABARAPs%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs.</a> Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> J Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+human+cells+lacking+ATG8+proteins+uncovers+roles+for+GABARAPs+and+the+CCZ1%2FMON1+regulator+C18orf8%2FRMC1+in+macro+and+selective+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux.</a> Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonselective+autophagy+of+cytosolic+enzymes+by+isolated+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes.</a> J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).</li>
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<li>Luhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Cargo+Sequestration+Assay+for+Quantitative+Measurement+of+Nonselective+Autophagy+in+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells.</a> Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).</li>
<li>Mousavi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibitors+of+the+vacuolar+proton+pump+on+hepatic+heterophagy+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy.</a> Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).</li>
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<li>Kuma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autophagy+during+the+early+neonatal+starvation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of autophagy during the early neonatal starvation period.</a> Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+starvation-induced+and+constitutive+autophagy+in+Atg7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice.</a> J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).</li>
<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg9a+controls+dsDNA-driven+dynamic+translocation+of+STING+and+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).</li>
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<li>An, H., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+ribophagy+in+human+cells+reveals+bystander+flux+during+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy.</a> Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).</li>
<li>Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+support+production+of+starvation-induced+autophagosomes+but+not+their+targeting+and+fusion+with+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).</li>
<li>Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Atg2+proteins+are+essential+for+autophagosome+formation+and+important+for+regulation+of+size+and+distribution+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).</li>
<li>Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+activity+measured+in+whole+rat+hepatocytes+as+the+accumulation+of+a+novel+BHMT+fragment+%28p10%29%2C+generated+in+amphisomes+by+the+asparaginyl+proteinase%2C+legumain%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain.</a> Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).</li>
<li>Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+cytoplasmic+enzymes+in+an+autophagic+vacuole-lysosomal+system+induced+by+injection+of+leupeptin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin.</a> J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
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</ol>

저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.

요약, 여기에 설명 된 프로토콜 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 모니터링 하는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 메서드를 나타냅니다. 원래 방법12,16에 비해, 우리 몇 가지 불필요 한 단계를 제거, 몇몇 나머지 단계를 단순화 하 고 상당한 상세화 도입. 결과적으로, 프로토콜은 크게 관련 비용 및 시간-효율성, 향상 하 고 같은 양의 샘플 이제 원래 프로토콜에 비해 절반 이하로 시간에 처리 될 수 있습니다. 24 샘플에 대 한 2-3 단계 (주 1) 필요 더하기 준비의 약 ½ h 효율적인 작업의 3 h ~ 2 h에서 4 (주 2) 단계를 수행할 수 있습니다 반면 (시간 견적을 모든 필요한 버퍼 미리 준비). 1 일반적으로 앞에 세포 치료, Baf 가진 3-4 h 외피 또는 autolysosomal LDH 저하의 다른 억제제를 포함 하 여 하루에 분석 결과 이후 이틀 연속에 분석 결과 분할 편리 하다. 그...

Autophagy ("먹는 자"에 대 한 그리스어) 세포내 물질의 vacuolar lysosomal 저하에 대 한 진화 보존된 과정 이다. 효 모와 인간 autophagy 중요 autophagy 관련 ("ATG") 유전자의 발견 즉시 실현 그 autophagy 인류 건강 및 질병 (의학 또는 생리학에 있는 노벨상 2016에 의해 인정에 중요 한 역할을 담당 요시노 리 Ohsumi) autophagy 빠르게 되고있다 세포 생물학1,2에서 가장 심각 하 게 공부 과정 중 하나.
Macroautophagy ("autophagy" 라 함)은와 효과적으로 격리 하는, 이중 또는 다중 membrane 구조 ("autophagosomes")에 세포내 막 cisternae ("phagophores")의 접는 확장 특징은 휩 싸이 세포질의 나머지에서 자료. Autophagosomes와 리소좀의 융합에 내부 autophagosomal 막과 분리 된 화물은 저하 고 재활용. Autophagosomes 무작위 (비 선택적 autophagy)와 선택적 (선별 autophagy) 매너 세포질 물질을 격리 수 있습니다. 대량 autophagy 대부분 비 선택적이 고 선택적 autophagy의 혼합을 나타냅니다.
1960 년대와 70 년대 ("형태"의 시대 autophagy 연구)에서 autophagic 격리 주로 ultrastructural 분석을 통해 평가 했다. 1980 년대에서 1990 년대 ("생 화 확 적인 시대") 당 Seglen와 동료의 시작-누가 주 쥐 hepatocytes에서 autophagy 공부-양적 autophagic 격리 활동3를 측정 하는 첫 번째 방법을 개발. 이 분석 실험을 사용 하 여, Seglen 정의 autophagic lysosomal 통로가4,5의 다른 단계를 특징, 발견 만들어낸 amphisome6 (endosome autophagosome 퓨전의 제품), 그리고 처음 autophagy 조절7인 산화 단백질의 역할을 설명 합니다. 그러나, 1990 년대에서 ATGs ("분자 시대")의 발견과 포유류 ATG8 단백질의 첫 번째 특성, 후 microtubule 관련 단백질 1A/1B-라이트 체인 3 (LC3) 20008, ATG 단백질에 대 한 표식으로의 사용에에서는 autophagic 과정 신속 하 게 얻은 인기, 그리고 더 오래 되 고 더 힘 드는 생 화 확 적인 방법 뒤에 남았다. 사실, 지난 18 년 동안, 서쪽 오 점 및 LC3의 형광 현미경 분석 되었다 지금까지 가장 인기 있는 (그리고 많은 경우에) 공부 하는 포유류 세포에서 autophagy의 의미. 장점은 상대적으로 완화는 이러한 방법을 밖으로 실행 될 수 있다입니다. 단점은 저거 카트 구성 요소 (LC3)을 공부 하 고 실제 autophagic 화물 보다는. 이 상태 또는 격리 대 통로 통해 LC3의 유량과 화물의 유량의 관계를 매우 명확 하지 때문에 오히려 심각한 단점입니다. 사실, 우리는 대량 화물 유동 조건에서 높은 수준에서 유지 될 수 있다 나타났습니다 셀9에 활용 된 LC3의 존재에도 불구 하 고 아무 LC3 플럭스입니다. 또한, 우리는 대량 autophagy 효율적인 LC3 고갈에 의해 영향을 받지 않습니다 이며 따라서 가능성이 LC3 독립적인9시연. 이 찾는 나중 LC3 노크 아웃 연구10,11, 또한 나타낼 Parkin 종속 mitophagy (미토 콘 드리 아의 선택적 autophagy) LC310,11의 독립에 의해 확인 됐다 .
요약 하자면, 분명 있다 autophagic 활동을 모니터링 하 화물 기반 분석에 대 한 필요. 최적으로 적용, 정의 그리고 수행 하기 쉬운 이러한 분석 광범위 하 게 되어야 합니다. 지난 몇 년 동안 우리는 198012, 당 Seglen에 의해 개발 되었다 sedimentable, autophagic 공포 포함 된 셀을 cytosolic LDH의 전송 측정 기반 LDH 격리 분석 결과에 특별 한 관심을가지고 분수입니다. LDH는 안정, 수용 성 cytosolic 단백질 phagophores enwrap 세포질 화물 때에 압수 쉽게 공동. LDH의 격리 따라서 autophagic 격리의 일반적인 척도 이다. LDH는 autophagic lysosomal 통로가12에 의해 독점적으로 저하 됩니다. 따라서, lysosomal 저하 억제제, 예를 들어, bafilomycin A1 존재 (Baf)13, 실험적인 치료 효과 직접 autophagic 격리 활동에 변경 반영. 저하 억제제의 부재, LDH 격리와 저하에 변경의 그물 효과 측정할 수 있습니다.
LDH는 매우 고 편 모든 세포 유형에 표현 때문에 효소 분석 결과14,15LDH 수준을 정확 하 게 정해질 수 LDH 격리 분석 결과 광범위 하 게 적용 됩니다. 그러나, 원래12 프로토콜-기본 쥐 hepatocytes에 설립-오히려 소모 되었고 시작 물자로 만든 전기 방전 커패시터의 높은 금액을 요구. 단계별 방식으로, 우리는 점차적으로 변형 분석 결과 쉽고 다양 한 방법으로. 첫째, 원래 프로토콜 포유류 세포 라인16에 사용 하기 위해 적응 시켰다. 둘째, 방법은 실질적으로 downscaled3,9이었다. 셋째, 프로토콜의 여러 단계에서 탈락 했다,17단계 힘 드는 밀도 쿠션을 포함 하 여. 이 동시에 샘플 (즉, 적은 약 15 시작 당 12-잘 접시에서 한 우물을 사용 하 여 샘플16 당 10 cm 접시를 사용 하 여 원래 시작 지점에서 메서드의 더욱 상세화를 사용 소재)17. 넷째, 우리는 주문 품 전기 방전 커패시터17를 대체할 수 있는 상업 electroporation 기구 발견.
여기 우리의 최신 프로토콜의 LDH 격리 분석 결과, 이전에 게시17 비교 방법의 몇 가지 더 단순화를 포함 하는 제공 됩니다. 또한, 다른 세포 유형의 수에서 얻은 전형적인 결과 집합이 표시 되 고 중요 한 것은, 유전자 뿐 아니라 약리 최저 및 녹아웃 접근을 사용 하 여 메서드의 실험적인 검증의 여러 줄 제공 됩니다. 전체 프로토콜의 전체 흐름 체계를 위해 그림 1을 참조 하십시오.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 및 2 mL 마이크로 원심분리 튜브&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>211-2130 및 211-2120</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Accumax&nbsp; 세포 분리 솔루션</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>A7089</td><td>-20 &deg; C 몇 년 동안, 그리고 몇 달 동안 냉장고에서</td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>엔조</td><td>BML-CM110-0100</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>BJ 세포</td>에 용해 <td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td>통로에서 사용 < 30</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>VWR</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>버커 계수 챔버</td><td>Fisher Scientific</td><td>139-658585</td><td></td></tr><tr><td>백작 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>백작 II 자동 세포 계수기</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>버커 계수 챔버</td> <td>용 커버 유리Fisher Scientific</td><td>139-658586</td><td></td></tr><tr><td>Criterion Tris-HCl 젤, 4&ndash; 20 %, 26 웰, 15 &마이크로; L, 13.3cm x 8.7cm (W x L)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>3450034</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt solution (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td>conatains 0.1% glucose</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvette (4 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td>Exponential decay wave electroporator</td><td>BTX Harvard 장치</td><td>&nbsp; EMC 630</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F7524</td><td>RPMI 1640 매체</td></tr><tr><td>HEK293 세포</td>의 10 % 최종 농도 <td>: ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td>65 mM 용액을 고압 멸균하고 몇 달 동안 냉장고에 보관</td></tr><tr><td>인큐베이터; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td><td>NuAire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>LNCaP cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td> use at passage <td>< 30</td></tr><tr><td>3-메틸 아데닌 (3MA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>M9281</td><td>재고 100 mM in RPMI in -20 &deg;C.&nbsp; 재고를 65°C로 가열하십시오. C 10분 동안, 최종 농도 10mM에서 사용</td></tr><tr><td>Refridgerated Microcentrifuge</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>소프트 모드 기능이 있는 Refridgerated Microcentrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>에펜도르프 5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MRT67307 염산염(ULKi)</td><td>시그마-알드리치(Sigma-Aldrich</td>)<td>SML0702</td><td>ULK 키나아제 활성을 억제합니다. DMSO에서 디졸브합니다.</td></tr><tr><td>MaxMat 다중 분석기 기기</td><td>Erba Diagnostics</td><td>PL-II</td><td></td></tr><tr><td>MCF7 셀</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.24644.001</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axis-Shield</td><td>1002424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 3 (0.5-20 &마이크로; L)</td><td>VWR</td><td>732-2223</td><td>Thermo Fischer ART 배리어 팁</td></tr><tr><td>피펫 팁(1-200 &마이크로; L)</td><td>VWR</td><td>732-2207&nbsp;</td><td>Thermo Fischer ART 배리어 팁</td></tr><tr><td>피펫 팁(100-1,000 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>732-2355&nbsp;</td><td>Thermo Fischer ART 배리어 팁</td></tr><tr><td>피펫</td><td>ThermoFisher</td><td>4701070</td><td>Finnpipette F2 GLP Kit</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-10X5MG</td><td>멸균 H2O에서 1 mg/mL 원액을 제조합니다. 이 솔루션은 -20 &deg에서 안정적입니다. C 최소 1년 동안.</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Merck-Millipore</td><td>1066190050</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1 세포 (hTERT RPE-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-037</td><td></td></tr><tr><td>SAR-405</td><td>ApexBio&nbsp;</td><td>A8883</td><td>은 포스포이노시티드 3-키나아제 클래스 III(PIK3C3)을 억제합니다. DMSO에서 디졸브합니다.</td></tr><tr><td>소음기 네거티브 컨트롤 #1 선택 (siCtrl)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>4390843</td><td></td></tr><tr><td>소음기 ATG9 표적 siRNA (siATG9A) 선택</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s35504</td><td></td></tr><tr><td>소음기 FIP200 표적 siRNA (siFIP200) 선택ThermoFisher</td><td>/Ambion</td><td>s18995</td><td></td></tr><tr><td>소음기 ULK1 표적 siRNA (siULK1) 선택</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s15964</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18705</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22362</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s24333</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22387</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 이수화물(NaH2PO4 &bull; 2H2O)&nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 이수화물(Na2HPO4 &bull; 2H2O)&nbsp;</td><td>Prolabo</td><td>28014.291</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>VWR</td><td>443816T</td><td>물 중 10% 최종 농도; 0.45 &마이크로를 통해 필터링; m 필터를 걸러서 몇 달 동안 냉장고에 보관하십시오</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>은 SERCA ER Ca2+ 펌프를 억제합니다. DMSO에서 디졸브합니다.</td></tr><tr><td>트리톤 X-405&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X405</td><td>1% final</td></tr><tr><td>Trypan Blue stain 0.4%</td><td>Molecular Probes</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>0.01% final</td></tr></tbody></table>

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

대량 autophagy 더블/멀티 membrane 구조에 autophagosomes 되 나 큰 부분의 세포질의 격리에 의해 특징입니다. 여기이 프로세스를 모니터링 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 일반적인 결과 및 경작된 한 포유류 세포의 다양 한 종류에서 autophagy 유도 조건 방법의 실험적인 검증 제공 됩니다. 대량 autophagy, 동안 autophagosomes cytosol, 그리고 그로 인하여 또한 다른 autophagic 화물 함께 녹는 cytosolic 단백질 격리. LDH는 안정적이 고 높은 비 선택적으로 autophagosomes에 분리 된 풍부 하 고, 녹는 cytosolic 효소 이다. LDH 격리의 양에 따라서 대량 autophagic 격리의 양을 반영합니다. 우리 cytosolic LDH, sedimentable의 효소 활동의 측정에 의해 뒤에서 sedimentable를 효과적으로 분리 하는 분류 electrodisruption-기반 프로토콜을 사용 하는 효율적이 고 정확 하 게 확인 하려면 LDH 격리 셀에, 전체 셀 샘플 대의 분수 Autophagic 격리 sedimentable 그에서 치료 세포 치료 셀에 LDH의 비율을 빼서 결정 됩니다. LDH 격리 분석 결과의 장점은 그것은 다른 방법에 반대 생 화물의 autophagic 격리의 양적 측정 하거나 격리 프로브 또는 반 양적 protease의 소성 식 포함 제공 autophagy 마커 또는 수용 체의 보호 분석입니다.

프로토콜을 사용 하 여 여기에 설명 된, LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, 헬러, VCaP, H3122, Hec1A를 포함 하 여 다른 포유류 세포 선의 수에 대량 autophagic 격리 활동 MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ, 및 LNCaP 세포 측정 했다. 격리 (에 완전 한, 영양분이 풍부한 매체), 기저 조건 평가 또는 셀에 심하게 굶 어 혈 청 및 아미노산 (한 보 나 fide autophagy 유도 조건22). 결과 표시 LDH 격리 활동 기아 상태에서 다른 셀 라인, LAPC4, DU145, Huh7에서 거의 감지 수준에서 배열에 걸쳐 광범위 하 게 다릅니다 PNT2 LNCaP 셀 (그림 2에에서 ~1.6%/h를 (데이터 표시 되지 않음) 세포 </st...

여기 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 측정 하기 위한 간단 하 고 잘 검증 된 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 전체 셀룰러 LDH 수준에 비해 sedimentable 셀 분수에 젖 산 효소 (LDH)의 비율을 측정에 기반.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

이 방법은 자가포식솜 형성이 어떻게 조절되는지, 다양한 세포 처리 및 조건이 벌크 자가포식에 어떤 영향을 미치는지와 같은 자가포식 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 내인성 화물 격리를 측정한다는 것입니다. 그러므로, 이 방법은 광범위하게 적용 가능하며 인위적인 과발현 또는 화물 프로브의 도입과 무관합니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Paula Szalai와 Morten Luhr입니다. 먼저 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크에서 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 세포가 거의 합류하는 세포층에 도달할 때까지 성장하도록 합니다.그 후, pH 7.4에서 섭씨 37도에서 PBS 3 밀리리터로 세포를 세척합니다. PBS를 제거하고 3ml의 0.25%트립신 EDTA로 교체합니다. 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도의 5% 이산화탄소가 있는 가습 인큐베이터에서 배양합니다.다음으로, 10%FBS를 함유한 7ml의 배양 배지에 세포를 재현탁시키고 멸균된 50ml 튜브로 옮깁니다. 0.5 - 20 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 10 마이크로리터의 트리판 블루가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 계수 챔버 슬라이드를 즉시 채우고 자동화된 세포 카운터에서 세포를 계수합니다.그런 다음 10%FBS를 함유한 배양 배지를 사용하여 세포 현탁액의 적절한 희석을 준비합니다. 무균 기술을 사용하여 1ml의 희석 세포 현탁액을 12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 파종합니다. 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소가 있는 가습 인큐베이터에서 배양합니다.원하는 실험적 처리에서 침전 가능한 LDH의 배경 수준을 정의하기 위해 한 세트의 우물을 처리하지 않고 남겨 둡니다. 수확 3-4시간 전에 각 웰에 포화량의 격리 후 억제제인 Bafilomycin A1을 추가합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소가 함유된 가습 인큐베이터에서 배양합니다.치료 기간이 끝나면 배지를 흡인하기 위해 흡입합니다. 섭씨 37도로 예열된 200마이크로리터의 세포 분리 용액을 각 웰에 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다.각 웰에 2%BSA를 함유한 pH 7.4에서 500마이크로리터의 실온 PBS를 추가합니다. 피펫을 사용하여 세포 덩어리가 보이지 않을 때까지 각 웰을 재현탁합니다. 그런 다음 즉시 각 웰의 세포 현탁액을 얼음 위의 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.세포를 침전시키기 위해 400배 g과 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 흡입을 사용하여 상층액을 완전히 흡인하고 세포 펠릿을 가능한 한 건조하게 유지합니다. 그런 다음 초순수에 10% 자당을 함유한 용액 400마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다.피펫을 사용하여 세포 펠릿을 재현탁시켜 거의 단일 세포 현탁액을 얻었습니다. 이 현탁액을 4mm 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다. 큐벳을 지수 감쇠파 전기포레이터에 놓고 800볼트, 25마이크로패럿 및 400옴에서 단일 전기 펄스를 방전합니다.새 피펫 팁을 사용하여 세포 파쇄물을 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 자당 용액이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 피펫팅으로 간단히 혼합합니다. 각 샘플에 대해 이 재현탁, 전기 파괴 및 혼합 과정을 반복합니다. 절차를 처음 수행하는 경우 텍스트에 설명된 대로 효율적이고 선택적인 원형질막 전기 파괴를 확인해야 합니다.침전된 LDH 분획을 얻으려면 각 희석된 세포 파괴 용액에서 550마이크로리터를 제거하고 0.5%BSA 및 0.01%Tween 20을 함유한 900마이크로리터의 얼음-저온 재현탁 완충액이 들어 있는 자체 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 피펫을 간단히 섞습니다. 18, 000 시간 g 및 45 분 동안 섭씨 4도에서 원심 분리기를 사용하여 침전 된 LDH를 함유 한 펠릿을 생산합니다.흡입을 사용하여 상등액을 철저히 흡입하여 펠릿을 가능한 한 건조하게 유지합니다. 분석이 준비될 때까지 침전된 LDH 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 총 LDH 분획의 경우, 희석된 각 세포 파괴 용액에서 150마이크로리터를 자체의 새 튜브로 이동합니다.분석할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도의 냉동고에 보관하십시오. 침전된 LDH와 총 LDH 샘플을 모두 얼음 위에서 해동합니다. 해동되면 1.5%Triton X-405를 함유한 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 재현탁액을 총 LDH 샘플에 추가합니다.샘플을 롤러에 담아 차가운 방에서 30분 동안 회전시킵니다. 다음으로, 1%Triton X-405를 함유한 750마이크로리터의 얼음처럼 차가운 재현탁액을 침전된 LDH 샘플에 추가합니다. 피펫을 사용하여 용액이 균질해질 때까지 펠릿을 재현탁합니다.18, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에서 5 분 동안 모든 샘플을 원심 분리하여 용해되지 않은 세포 파편을 침전시킵니다. 원심분리가 완료되면 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 상층액의 LDH 수치는 본문에 설명된 고전적인 효소 분석 또는 상업적으로 이용 가능한 다양한 키트 중 하나를 사용하여 측정합니다.이 연구에서는 여러 다른 포유류 세포주에서 벌크 자가포식 격리 활성을 모니터링합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 기저 및 기아 유발 LDH 격리와 LNCaP 세포는 모두 pan-PI3-kinase 억제제인 3MA에 의해 완전히 폐지됩니다. 선택적 PI3-키나아제 클래스 3 억제제인 SAR-405와 ER 칼슘 펌프 억제제인 Thapsigargin입니다.HEK293 세포에서 굶주림 상태에서의 LDH 격리는 Thapsigargin과 ULK 억제제인 MRT 67307에 의해 크게 감소합니다. 더욱이, 기아에 의한 LDH 격리는 관찰된 다른 세포주에서 3MA에 의해 일관되게 억제되는 것으로 나타났습니다. 다음으로, 다양한 ATG gene knockout MEF를 사용하여 자가포식솜 형성에 필수적인 것으로 보고된 자가포식 관련 유전자가 LDH 격리에 필요한지 여부를 테스트합니다.보시다시피, 기아로 인한 LDH 격리는 ATG5 녹아웃 MEFS에서 폐지됩니다. 또한 ATG7 및 ATG9A 녹아웃 MEF에서도 무뎌집니다. 마지막으로, 주요 ATG 유전자 전사체의 RNAi 매개 침묵의 효과를 결정합니다.siRNA를 표적으로 하는 ATG9A 또는 ULK1 및 ULK2를 결합한 transfection은 LNCaP 세포에서 LDH 격리를 크게 감소시키는 것으로 나타났습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 파이펫팅 단계에서 정확성을 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 수명이 긴 단백질 분해 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 격리 활성에서 관찰된 변화로 인해 자가포식 분해 활성에서 유사한 변화가 관찰되었는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.포유류 세포주에서 이 방법을 확립한 후, 당사는 벌크 자가포식이 LC3 단백질군과 독립적이며 대신 GABARAP을 필요로 한다는 것을 입증하기 위해 이를 사용했습니다. 이는 자가포식 활성을 모니터링하기 위해 LC3 독립적인 방법을 사용하는 것의 중요성을 강조합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 젖산 탈수소효소를 사용하여 세포 용해물에서 젖산을 측정하기 위한 비색 분석에 대해 설명합니다. 이 효소는 젖산을 피루브산으로 변환하고, NAD를 테트라졸륨 염료와 반응하는 NADH로 변환하여 젖산을 정량화하기 위해 분광 광도계로 측정할 수 있는 착색 제품을 제공합니다.

테스트 샘플에서 젖산의 정량화를 위한 비색 분석

이 비디오는 포유류 세포에서 벌크 자가포식 격리 활성을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 전기천공법을 활용하여 젖산 탈수소효소(LDH)를 포함한 세포질 단백질을 방출합니다. 격리된 LDH 및 총 세포 LDH 분획은 LDH 격리를 평가하기 위해 결정되어 전체 벌크 격리 활성에 대한 통찰력을 제공합니다.

포유류 세포에서 벌크 자가포식 격리 활성(Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells) 정량화

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

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우리 nicotinatmide 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NAD(P)H) + H + 조직 샘플에서 직접 생성 하는 효소 효소 활동의 공간적 분포를 매핑하기 위한 프로토콜 설명.

매핑 대사: 조직에서 직접 젖 산 효소 활동 모니터링

우리는 autophagy및 마우스 간에서 proteasome를 통해 단백질 이화 작용에 있는 생물학 리듬을 측정하기 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다.

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.

LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

여기에서는 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 루시페라아제 기반 리포터 분석을 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

자가포식 관련 4B 시스테인 펩티다아제 억제제에 대한 세포 기반 약물 스크리닝

여기에서는 면역블로팅을 통해 세포외 소포체(EV)에서 자가포식 마커 LC3-II 수준을 간결하게 평가하는 방법론을 제시합니다. EV에서 LC3-II 수준, 자가리소좀 형성 및 오메가솜 형성에 대한 분석은 자가포좀-리소좀 융합이 억제될 때 LC3-II 양성 EV의 방출에서 STX6의 새로운 역할을 시사합니다.

세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

학습하세요 포유류 세포에서 대량 자가소화 격리 활동을 측정하는 검증된 프로토콜을 LDH 분석을 통해. 이 방법은 인공 프로브 없이 내인성 화물 격리를 정량화하여 다양한 세포 유형과 처리 조건에서 자가소화 연구에 활용됩니다.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

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