젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

이 방법은 자가포식솜 형성이 어떻게 조절되는지, 다양한 세포 처리 및 조건이 벌크 자가포식에 어떤 영향을 미치는지와 같은 자가포식 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 내인성 화물 격리를 측정한다는 것입니다. 그러므로, 이 방법은 광범위하게 적용 가능하며 인위적인 과발현 또는 화물 프로브의 도입과 무관합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Paula Szalai와 Morten Luhr입니다. 먼저 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크에서 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 세포가 거의 합류하는 세포층에 도달할 때까지 성장하도록 합니다.

그 후, pH 7.4에서 섭씨 37도에서 PBS 3 밀리리터로 세포를 세척합니다. PBS를 제거하고 3ml의 0.25%트립신 EDTA로 교체합니다. 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도의 5% 이산화탄소가 있는 가습 인큐베이터에서 배양합니다.

다음으로, 10%FBS를 함유한 7ml의 배양 배지에 세포를 재현탁시키고 멸균된 50ml 튜브로 옮깁니다. 0.5 - 20 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 10 마이크로리터의 트리판 블루가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 계수 챔버 슬라이드를 즉시 채우고 자동화된 세포 카운터에서 세포를 계수합니다.

그런 다음 10%FBS를 함유한 배양 배지를 사용하여 세포 현탁액의 적절한 희석을 준비합니다. 무균 기술을 사용하여 1ml의 희석 세포 현탁액을 12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 파종합니다. 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소가 있는 가습 인큐베이터에서 배양합니다.

원하는 실험적 처리에서 침전 가능한 LDH의 배경 수준을 정의하기 위해 한 세트의 우물을 처리하지 않고 남겨 둡니다. 수확 3-4시간 전에 각 웰에 포화량의 격리 후 억제제인 Bafilomycin A1을 추가합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소가 함유된 가습 인큐베이터에서 배양합니다.

치료 기간이 끝나면 배지를 흡인하기 위해 흡입합니다. 섭씨 37도로 예열된 200마이크로리터의 세포 분리 용액을 각 웰에 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다.

각 웰에 2%BSA를 함유한 pH 7.4에서 500마이크로리터의 실온 PBS를 추가합니다. 피펫을 사용하여 세포 덩어리가 보이지 않을 때까지 각 웰을 재현탁합니다. 그런 다음 즉시 각 웰의 세포 현탁액을 얼음 위의 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

세포를 침전시키기 위해 400배 g과 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 흡입을 사용하여 상층액을 완전히 흡인하고 세포 펠릿을 가능한 한 건조하게 유지합니다. 그런 다음 초순수에 10% 자당을 함유한 용액 400마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다.

피펫을 사용하여 세포 펠릿을 재현탁시켜 거의 단일 세포 현탁액을 얻었습니다. 이 현탁액을 4mm 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다. 큐벳을 지수 감쇠파 전기포레이터에 놓고 800볼트, 25마이크로패럿 및 400옴에서 단일 전기 펄스를 방전합니다.

새 피펫 팁을 사용하여 세포 파쇄물을 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 자당 용액이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 피펫팅으로 간단히 혼합합니다. 각 샘플에 대해 이 재현탁, 전기 파괴 및 혼합 과정을 반복합니다. 절차를 처음 수행하는 경우 텍스트에 설명된 대로 효율적이고 선택적인 원형질막 전기 파괴를 확인해야 합니다.

침전된 LDH 분획을 얻으려면 각 희석된 세포 파괴 용액에서 550마이크로리터를 제거하고 0.5%BSA 및 0.01%Tween 20을 함유한 900마이크로리터의 얼음-저온 재현탁 완충액이 들어 있는 자체 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 피펫을 간단히 섞습니다. 18, 000 시간 g 및 45 분 동안 섭씨 4도에서 원심 분리기를 사용하여 침전 된 LDH를 함유 한 펠릿을 생산합니다.

흡입을 사용하여 상등액을 철저히 흡입하여 펠릿을 가능한 한 건조하게 유지합니다. 분석이 준비될 때까지 침전된 LDH 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 총 LDH 분획의 경우, 희석된 각 세포 파괴 용액에서 150마이크로리터를 자체의 새 튜브로 이동합니다.

분석할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도의 냉동고에 보관하십시오. 침전된 LDH와 총 LDH 샘플을 모두 얼음 위에서 해동합니다. 해동되면 1.5%Triton X-405를 함유한 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 재현탁액을 총 LDH 샘플에 추가합니다.

샘플을 롤러에 담아 차가운 방에서 30분 동안 회전시킵니다. 다음으로, 1%Triton X-405를 함유한 750마이크로리터의 얼음처럼 차가운 재현탁액을 침전된 LDH 샘플에 추가합니다. 피펫을 사용하여 용액이 균질해질 때까지 펠릿을 재현탁합니다.

18, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에서 5 분 동안 모든 샘플을 원심 분리하여 용해되지 않은 세포 파편을 침전시킵니다. 원심분리가 완료되면 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 상층액의 LDH 수치는 본문에 설명된 고전적인 효소 분석 또는 상업적으로 이용 가능한 다양한 키트 중 하나를 사용하여 측정합니다.

이 연구에서는 여러 다른 포유류 세포주에서 벌크 자가포식 격리 활성을 모니터링합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 기저 및 기아 유발 LDH 격리와 LNCaP 세포는 모두 pan-PI3-kinase 억제제인 3MA에 의해 완전히 폐지됩니다. 선택적 PI3-키나아제 클래스 3 억제제인 SAR-405와 ER 칼슘 펌프 억제제인 Thapsigargin입니다.

HEK293 세포에서 굶주림 상태에서의 LDH 격리는 Thapsigargin과 ULK 억제제인 MRT 67307에 의해 크게 감소합니다. 더욱이, 기아에 의한 LDH 격리는 관찰된 다른 세포주에서 3MA에 의해 일관되게 억제되는 것으로 나타났습니다. 다음으로, 다양한 ATG gene knockout MEF를 사용하여 자가포식솜 형성에 필수적인 것으로 보고된 자가포식 관련 유전자가 LDH 격리에 필요한지 여부를 테스트합니다.

보시다시피, 기아로 인한 LDH 격리는 ATG5 녹아웃 MEFS에서 폐지됩니다. 또한 ATG7 및 ATG9A 녹아웃 MEF에서도 무뎌집니다. 마지막으로, 주요 ATG 유전자 전사체의 RNAi 매개 침묵의 효과를 결정합니다.

siRNA를 표적으로 하는 ATG9A 또는 ULK1 및 ULK2를 결합한 transfection은 LNCaP 세포에서 LDH 격리를 크게 감소시키는 것으로 나타났습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 파이펫팅 단계에서 정확성을 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 수명이 긴 단백질 분해 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 격리 활성에서 관찰된 변화로 인해 자가포식 분해 활성에서 유사한 변화가 관찰되었는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

포유류 세포주에서 이 방법을 확립한 후, 당사는 벌크 자가포식이 LC3 단백질군과 독립적이며 대신 GABARAP을 필요로 한다는 것을 입증하기 위해 이를 사용했습니다. 이는 자가포식 활성을 모니터링하기 위해 LC3 독립적인 방법을 사용하는 것의 중요성을 강조합니다.