Name: N-glycans Raphanus sativus Cultivars 사용 PNGase H+ 에서 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 Raphanus sativus 품종에서 PNGase H⁺를 사용한 N-글리칸 분석 방법을. 버퍼 교환 없이 효소적 방출 및 유도체화를 수행하여 식물 글리코과학 연구를 간소화합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품은 중국의 자연 과학 재단에 의해 부분적으로 지원 (부여 번호 31471703, A0201300537 및 31671854 J.V. 하 L.L., 번호 31470435 G.Y.에 부여), 그리고 100 외국 재능 계획 (보조금 번호 JSB2014012 J.V.).

1. 샘플 컬렉션
<ol><li>신선한 무 (Raphanus sativus L.)의 다른 cultivars을 구입.</li>
</ol>2입니다. 무에서 단백질의 격리
<ol><li>10 분 동안 부엌 믹서와 신선한 무의 약 100 g을 균질.</li>
	<li>50 mL 원심 분리기 튜브 및 불용 성 물질을 제거 20 분 4 ° C에서 14000 × g 에서 원심 슬러리를 전송 합니다.</li>
	<li>새로운 50 mL 원심 분리기 튜브에는 상쾌한을 신중 하 게 전송 하 고 2m trichloroacetic 산 (TCA) 솔루션의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 참고: TCA를 추가 수용 성 (glyco) 단백질 침전 됩니다.</li>
	<li>30 분 동안 4 ° C에서 14000 × g 에서 centrifuge 고 수송과 (glyco) 단백질에서는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>녹는 oligosaccharides 및 다 당 류를 제거 하 5 분 동안 4 ° C에서 14000 × g 에서 이온된 수와 원심 분리기의 20 mL와 펠 릿을 세척.</li>
	<li>2.5 단계를 반복 합니다. 4 번입니다.</li>
	<li>다시 1 ml의 이온을 제거 된 물과 신선한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
</ol>3. N-Glycans의 준비
<ol><li>2.7 단계에서 단백질 해결책의 믹스 50 µ L. (신선한 무의 5 g와 같음) 10 mM 아세트산에 재조합 PNGase H+ 의 0.2 뮤와 함께.</li>
	<li>12 h 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어. 부 화 후 5 분 여분의 단백질 및 효소 제거 14000 × g 에서 원심.</li>
	<li>신선한 1.5 mL 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송.</li>
</ol>4. NGlycans의 정화
<ol><li>Nglycans 풍부와 Nglycan에 대 한 fluorogenic 2 aminobenzamide (2-AB) 레이블 에이전트의 선택도 증가 하는 반응 혼합물에서 소금 및 기타 불순물을 제거 고체 상 추출 (SPE) 열을 준비 derivatization입니다.<ol>
<li>씻어 열 이온된 물 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>SPE-열 활성 trifluoroacetic 산 (TFA, 0.1 %v / v)을 포함 하는 80% 이기 솔루션의 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>SPE-열 equilibrate 하 이온된 물 3 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3.3 열에 단계에서 샘플을 전송 하 고 흐름을 통해 삭제.</li>
	<li>이온된 물 흐름을 통해 삭제를 열을 씻어 1.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>0.1%를 포함 20% 이기 용액의 1.5 mL를 사용 하 여 열에서 출시 된 Nglycans elute TFA (v/v) 2 mL 원심 분리기 관으로.</li>
	<li>상 온에서 원심 증발에 의해 용 매를 제거 합니다. 이 샘플은 완전히 건조 될 때까지 증발.</li>
</ol>5. 형광 Derivatization NGlycans의
<ol><li>2 AB 솔루션, 디 메 틸 ⁚ / 아세트산 산 성 용액 (7:3, v/v)에 35 m m 2-AB와 0.1 M 나트륨 cyanoborohydride의 구성의 1 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>6 다른 무에서 파생 된 말린 샘플 (4.5 단계.) 2-AB 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다. 와 동 각 샘플까지 완전히 해산.</li>
	<li>2 h 65 ° c.에 대 한 혼합물을 품 어</li>
	<li>5 분 동안 실내 온도 아래로 샘플 식 고 이온된 수의 5 µ L 및 이기의 40 µ L를 추가 합니다. 3 분 14000 x g에서 튜브 원심</li>
	<li>300 µ L 높은 복구 HPLC 유리병에는 상쾌한에서 48 µ L를 전송. 최대 한 달 동안-20 ° C에서 derivatized N-glycan 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>6. HILIC UPLC Nglycans의 프로 파일링
<ol><li>각각 330 nm/420 nm의 여기/방출 파장에서 형광 온라인 detectorset에 연결 된 표준 UPLC 시스템을 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.</li>
	<li>소수 성 상호 작용 액체 크로마토그래피 (HILIC)를 사용 하 여-UPLC glycan 열 분석을 위한 60 ° C의 열 온도에.</li>
	<li>950 mL의 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LCMS)와 재고 솔루션 (1m 암모늄 편대 솔루션, pH 4.5) 50 mL를 희석 하 여 준비 하는 용 매 A-등급 물. 준비 재고 솔루션을 다음과 같습니다.<ol>
<li>LCMS 급 H2o.의 700 mL에 포 름 산의 43 개 mL를 추가</li>
		<li>4.5 pH 수성 암모니아 솔루션 (25 %w / w)의 dropwise 추가 조정.</li>
		<li>측정 실린더 용 매를 전송 하 고 LCMS 급 H2o. 저장소 4-6 ° C에서 최대 3 개월까지 최대 1000 mL 채우기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>솔벤트 B. LCMS 급 이기 사용</li>
	<li>N-glycans 다음 그라데이션 차입 구분:<ol>
<li>44.5 분을 0에서 세트로 용 A. 0.5 mL/min 유량 용 매 B의 95%를 추가 하 여 시작 합니다.</li>
		<li>0 분-6 분에서 점차적으로 용 매 B 선형 그라데이션 to78%의 비율을 감소.</li>
		<li>44.5 분 6 분에서 점차적으로 55.9%를 선형 그라데이션으로 용 매 B의 비율을 감소.</li>
		<li>46.5 분 44.5 분에서 급속 하 게 용 매 B 0 %55.9 %에서 선형 그라데이션으로 비율을 감소 하 고 2 분 동안 0%에서 누른 열 세척을 시작. 55 분 44.5에서 0.25 mL/분 유량을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>50.5 분 48.5 분에서 용 매 B 95% 증가 하 여 추가 열을 세척 하 고 4.5 분 95%에서 개최.</li>
		<li>다시-57 분 50.5에서 95% 용 매 B 0.5 mL/min의 시작 조건에 열을 equilibrate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>UPLC 시스템으로 샘플의 45 µ L를 주사.</li>
	<li>N-glycans UPLC 여 15 그리고 40 분 사이 보존 시간 elute</li>
	<li>2 mL 원심 분리기 튜브를 사용 하 여 각 관찰된 UPLC 피크 분수를 수집 하 고 샘플 원심 증발에 의해 건조.</li>
	<li>2 AB dextran 표준 (2−20 포도 당 단위) 식물-N-glycan 파일링, 보정 하 고 표준화 된 포도 당 단위로 그들의 차입 시간을 할당 하 라는의 약 1 pmol 주사.</li>
</ol>7. MALDI TOF MS 분석
<ol><li>LCMS의 단계 5에서 6.8 µ L에서 샘플을 분해-등급 물. 샘플 솔루션 및 6-아 자-2-thiothymine (ATT) 솔루션 (0.3 w/v %70 %v / v 수성 이기에), 그리고 피 펫 MALDI TOF 샘플 캐리어에 혼합물의 1 µ L의 믹스 1 µ L.</li>
	<li>긍정적인 이온 모드 시작 버튼을 누르면 MALDI TOF 질량 분석기 악기를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.</li>
	<li>동반 MALDI TOF MS 분석 소프트웨어를 사용 하 여 질량 스펙트럼을 분석 합니다.</li>
	<li>오픈 소스 glycan 해석 소프트웨어19를 사용 하 여 스펙트럼을 해석 합니다. 2-AB, [M + 나]+에 대 한 검색 매개 변수를 설정 하 고 2.0 다를 정확도 매개 변수를 설정 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리가 여기 제시 하는 프로토콜 무의 다양 한 재배의 N-glycan 프로 파일의 비교를 허용 한다. 기존 프로토콜에 비해이 방법의 중요 한 장점은 Nglycans의 효소 출시와 2 AB와 derivatization 반응 사이의 버퍼 변경할 필요가 없습니다입니다. 이 절차의 가장 중요 한 단계는 N-glycans SPE 열을 사용 하 여 염 분을 제거 하는 실패의 정화 또는 반응 혼합물에 다른 불순물 형광 derivatization 효율성 저하 될 수 있습니다. 여기 다른 N-glycans;의 상대적인 나타났는데 평가 허가 제시 방법 절대 정량화 단계 2.1에서에서 (예: maltopentose)는 내부 표준의 추가 해야 합니다.
또는, derivatization 에이전트 여기 사용 (2-AB) 2-aminopyridine (2-AP) 또는 다른 derivatization 에이전트를 사용 하 여 쉽게 수정할 수 있습...

식물에서 N-glycans 그린 관심 증가 최근 몇 년 동안, 이전 연구로 알레르기 성 응답1,2 유도할 수 있는 면역 cross-reactions의 N-glycans을 강조 표시 . 그것은 입증 되었습니다 이전 촉매 활동3,4, 내열성 및 접는5,6 또는 subcellular 지 방화 N-glycans 공장 glycoproteins에 영향을 미칠 수 있는 고 분 비7. Glycan 구조 그들의 각각 기능 연관, 위하여 N-glycans 먼저 해제 되어야 합니다 glycoproteins에서 화학적 또는 효소. N-및 O-glycans 방출에 대 한 고전적인 화학 방법은 β-제거, 알칼리 샘플 치료 borohydride alditol8를 가진 감소에 의해 동반입니다. 그러나,이 절차는 fluorophore로 하는 걸로 하 고 glycan 구조의 줄이는 끝에서 단 당 류 단위의 상당한 감퇴의 원인. 수산화 암모늄/탄산 치료에 따라 화학 deglycosylation는 또한 일반적으로 사용 되는 대체 방법9. 이러한 화학 릴리스 방법의 그대로 단백질 같은 대량 범위에 레이블이 없는 glycan 풀 펩 티 드 파편의 간섭 없이 대량 spectrometric 분석을 수 있는 성능이 저하 됩니다. 그러나, 이러한 방법의 한 가지 단점이 일반적인 탄수화물 구조 발견 식물10에서 α1, glycans-3-fucosylated N의 증가 저하 속도입니다. 또는, 펩 티 드를 사용 하 여 효소 분리 방법:N-glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) 또한 광범위 하 게 적용 됩니다. 재조합 PNGase F ( Flavobacterium meningosepticum)에서 가장 일반적인 선택 하 고 N-glycans, 코어 α1, fucose 311,12베어링 구조를 제외 하 고 모든 종류의 릴리스 합니다. 따라서, PNGase A (아몬드 씨에서 분리)으로 식물 N-glycans13의 분석을 위해 사용 됩니다. 그러나,이 효소 deglycosylates만 proteolytically-파생 된 glycopeptides, deglycosylate 기본 glycoproteins14수입니다. 따라서, 다단계 샘플 검사 결과 추가 분석, glycans, 특히 낮은 풍부15의 그의 광범위 한 손실이 발생 하기 전에 필요 합니다. N-glycan 릴리스 및 형광 간단 하 고 강력한 방식으로 라벨에 대 한 최적화 된 워크플로우를 제시 하는 방법의 전반적인 목표가입니다. 기본 근거 PNGase H+는 Terriglobus roseus 에서 최근에 발견 되었다 recombinantly 대장균에 표현 될 수 있다, N-glycans 산 성에서 단백질 비 계에서 직접은 수은 조건16. PNGase H+ 를 사용 하 여 대체 방법의 주요 장점은입니다 형광 라벨 반응 반응 버퍼17,18를 변경 하지 않고 동일한 반응 관에서 수행할 수 있습니다. 간단한 준비 조건 및 낮은 풍부 oligosaccharides의 높은 복구 확인이 방법은 유용한 도구 Nglycans의 분석에. 이 프로토콜은 다양 한 식물 종에서 N-glycans의 분석에 적합 합니다.

<table><tbody><tr><td><강>화학물질:</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리클로로아세트산&nbsp;</td><td>SCR, 상하이</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 빙하</td><td>Huada, 광저우</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>아세토 니트릴</td><td>일반 시약</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>트리 플루오로 아세트산</td><td>에너지 화학 W810031</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2- 아미노 벤즈 아미드</td><td>Heowns, 천진</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 시아 노보로 하이드 라이드</td><td>J & K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-thiothymine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>도구/재료:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kitchen blender</td><td>Bear, Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>원심 증발기</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE 컬럼</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE 컬럼</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF 질량 분석기</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 분석: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>고회수율 HPLC 바이알</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 시스템</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>형광 검출기 HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>컬럼 오븐</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 컬럼</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC BEH 글라이칸 컬럼</td><td>2.1 &times; 150 mm, 1.7 & m 입자 크기</td></tr><tr><td>LCMS 등급 물</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS 등급 아세토니트릴</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>알라딘</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>암모니아 용액</td><td>알라딘</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

n-glycans raphanus sativus cultivars 사용 pngase h+ 에서 분석

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

최근 몇 년 동안, 식물의 탄수화물 moieties 받은 관심, 그들은 cross-reactive, 알레르기 자극 면역 반응의. 또한, 탄수화물 구조 또한 식물 물질 대사에 중요 한 역할을 담당할. 여기, 우리가 준비 하 고 사용 하는 N-glycanase 특정 식물에서 파생 된 탄수화물 구조의 릴리스에 대 한 무 (Raphanus sativus)의 다른 재배 품 정에서 N-glycans를 분석 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시. 이 위해 무 homogenates의 원유 trichloroacetic 산 침전 PNGase H+로 치료 되었고 형광 태그 2-aminobenzamide를 사용 하 여 표시. 레이블이 지정 된 N-glycan 샘플 이후 울트라 성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 분리 및 세부 구조에 대 한 비행 (TOF MALDI) 질량 분석의 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 시간으로 분석 되었다 평가 및 무 파생 N-glycan 구조 상대 abundancies 척도를. 이 프로토콜 사용할 수 있습니다 또한 다양 한 다른 식물 종에서 N-glycans의 분석 그리고 함수 추가 조사 및 인간의 건강에 N-glycans의 효과 대 한 유용할 수 있습니다.

그림 1 (glyco-) 무, N-glycans의 준비, UPLC 분석 및 이러한 구성 요소의 MALDI TOF MS 분석에서 단백질의 격리를 포함 하 여 설명된 프로토콜의 구조 개요를 보여 줍니다. 그림 2 분석된 무 재배의 derivatized Nglycans의 대표 UPLC chromatograms를 보여 줍니다. 그림 3 2AB derivatized N-glycan 구조 MALDI TOF 질량 분석을 사용 하 여 얻은 결과 보여 줍니다. 그림 4 는 각 무 품종에서 N-glycans의 양적 구성.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

우리는 준비 및 N-glycans 무 (Raphanus sativus)의 다른 재배에서의 분석을 위한 간단 하 고 빠른 방법을 설명합니다.

N-glycans Raphanus sativus Cultivars 사용 PNGase H+ 에서 분석

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

이 방법은 식물 유래 N-글리칸을 어떻게 신속하게 분석하고 특성을 규명할 수 있는지와 같은 식물 당과학 분야의 의문점을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 N-글리칸의 효소적 분리와 2-aminobenzamide를 이용한 유도체화 반응 사이에 완충액 교체가 필요하지 않다는 점입니다. 실험 절차의 시연은 난징 농업대학교 당체학 및 글리칸 생명공학 연구 센터의 대학원생인 Ya-Min Du 양과 Shen-Li Zhen 양이 맡았습니다.단백질 분리를 시작하기 위해, 주방용 믹서를 사용하여 신선한 무 약 100 g을 10분 동안 균질화합니다. 결과물로 얻은 슬러리를 50 mL 원심분리관에 옮깁니다. 불용성 물질을 제거하기 위해 4 °C에서 14,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다.그 후, 상층액을 새 50 milliliter 원심 분리관으로 조심스럽게 옮깁니다. 동일한 양의 2 molar trichloroacetic acid 용액을 첨가합니다. 4 °C에서 14,000 ×g로 30분 동안 원심 분리합니다.그 다음 상층액을 제거합니다. 펠렛을 20 milliliters의 탈이온수로 세척합니다. 수용성 올리고당과 다당류를 제거하기 위해 4 °C에서 14,000 ×g로 5분 동안 다시 원심분리합니다.그런 다음, 펠렛을 1 mL의 탈이온수로 다시 현탁합니다. 그리고 단백질 용액을 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. N-글리칸 준비를 시작하려면, 10 mM 아세트산에 녹인 0.2 mU의 recombinant PNGase H+와 단백질 용액 50 µL를 혼합합니다.37 °C에서 12시간 동안 배양합니다. 그 후, 14,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 과잉 단백질과 효소를 제거합니다. N-글리칸을 정제할 준비가 될 때까지 상층액을 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.N-글리칸 정제를 시작하기 위해, 고상 추출 컬럼을 3 mL의 물로 세척하십시오. 트리플루오로아세트산이 포함된 80% 아세토니트릴 용액 3 mL를 첨가하여 컬럼을 활성화하십시오. 그다음, 컬럼을 평형화하기 위해 3 mL의 탈이온수를 첨가하십시오.시료를 컬럼에 옮기고 통과액은 버립니다. 탈이온수 1.5 milliliters를 첨가하여 컬럼을 세척합니다. 시료 혼합물 내의 염을 제거하지 않거나 불순물이 포함될 경우, 형광 유도체화 반응의 효율성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.그 다음, 0.1% TFA가 포함된 2

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 포유 동물 세포에서 생합성 후 glycoproteins의 초기 생활을 통해 N - 연결 glycans의 변조 분석을위한 방법을 설명합니다. 이것은 metabolically 표시 glycans, glycoproteins와 HPLC에 의해 시험에서 효소 릴리스의 펄스 체이스 분석에 의해 이루어진다.

포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

빠른 방법은 세포외 기질에서 다당류의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 설명되어 있습니다. 방법은 glycosylhydrolases의 특이성과 물질의 미세한을 분석 수 있도록 질량 분석계의 감도 활용합니다. 이 기술은 조직 자체에서 직접 사용할 수 적용할 수 있습니다.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

SDS - PAGE에 의해 다음 glycoproteins에서 설탕을 제거하는 구체적인 glycosidases를 사용하면 단백질 시료에 glycan 변경을 탐지하는 유용한 방법이며 초기 glycobiology 연구를위한 좋은 선택입니다. deglycosylation 다음과 같은 변경 사항은 겔 이동성의 교대 ​​또는 glycan 민감한 시약과 염색법에 의해 감지 수 있습니다.

특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

고처리량 프로토콜은 단백질체학 및 글리코믹스 정제와 혈장에서 LC-MS/MS 정량화를 결합하기 위해 개발되었습니다. N-linked glycosylation motifs의 탈아미드화 분석은 탈glycosylated 부위에 특이적이었습니다. N-글리칸의 정확한 정량화는 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 필터 지원 N-글라이칸 분리를 개별성 정규화에 결합함으로써 달성되었습니다.

양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략

이 기사는 GC-MS에 의한 검출을 위해 글리칸을 구성 연결 특이적 단당류로 화학적으로 분해하여 분획되지 않은 생체 유체에서 글리칸의 통합 조성 프로파일을 분석하도록 설계된 새로운 상향식 글리코믹스 기술의 향상된 형태를 제시합니다. 잠재적인 응용 분야에는 암 및 기타 글리칸 정동 장애의 조기 발견이 포함됩니다.

글리 칸 노드 분석 : 글리코 믹스에 대한 상향식 접근

다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도), 예를 들어, mannan를 사용 하 여 구조 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

면역글로불린 G(IgG) N-글리칸은 친수성 상호작용 UPLC를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다.  여기에 제시된 이 실험 방법에 대한 소개는 연구 환경에서 널리 사용될 수 있도록 한다.

초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석

마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)은 생물학적 샘플에서 글라이칸의 조성 분석을 위한 고처리량 기술입니다.

고처리량 글라이칸 분석을 위한 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)

여기에서는 뮤신에서 O-글리칸을 방출하고 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용한 후속 탈염, 과메틸화 및 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Profiling of Permethylated Mucin O-glycans Using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight 질량 분석기

학습하세요 Raphanus sativus 품종에서 PNGase H⁺를 사용한 N-글리칸 분석 방법을. 버퍼 교환 없이 효소적 방출 및 유도체화를 수행하여 식물 글리코과학 연구를 간소화합니다.

N-glycans Raphanus sativus Cultivars 사용 PNGase H⁺ 에서 분석

더 많은 동영상 탐색