Name: Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 4-thiouracil 표지를 이용한 신규 합성 mRNA 정량화 방법으로 RNA 중합효소 II 활성을 정확히 측정하는 기술입니다. 이 프로토콜은 전사 동역학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리 그의 지원에 대 한 라 즐로 토 라와 V. 피셔, K. 슈마허와 F. 엘 Saafin 그들의 토론에 대 한 감사합니다. 결핵은 마리 퀴리-ITN 화목 (PITN-가-2013-606806, NR 그물)에 의해 지원 되었다 Fondation 아크. 이 작품은 직원 회 드 라 검색 (ANR-15-CE11-0022 SAGA2)에서 기금에 의해 지원 되었다. 이 연구는 ANR-10-LABX-0030-INRT, 관리 프레임 프로그램 Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 아래 직원 회 드 라 검색 하는 프랑스 국가 기금에 의해 또한 지원 되었다.

1. 세포 배양 Rapamycin의 그리고 소모 사가 소 단위
<ol><li>각 S. cerevisiae 스트레인 및 복제에 대 한 야생-타입을 포함 하 여 또는 컨트롤 긴장 접종 YPD 매체 (2% 펩, 1% 효 모 추출 물, 및 2% 포도 당)의 5 mL에 신선한 접시에서 단일 식민지.</li>
	<li>일정 한 동요 (150 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 S. cerevisiae 세포 성장.</li>
	<li>600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) OD600 YPD 매체의 약 0.1에서 100 mL의 문화를 희석 하 고 OD600 0.8 주위까지 성장 하자.</li>
	<li>동시에 접종 예 매체의 50 mL에 신선한 접시에서 S. pombe 셀의 단일 식민지 (0.5% 효 모 추출 물; 250 mg/L 아데닌, 히스티딘, uracil, 신, 그리고 리; 3% 포도 당) 일정 한 동요 (150와 32 ° C에 하룻밤 세포 성장 rpm을)입니다.</li>
	<li>S. pombe 하룻밤 문화의 OD600 측정 예 매체의 약 0.1에 500 mL의 OD600 문화를 희석 하 고 OD600 는 약까지 성장 하자 0.8.</li>
	<li>각 S. cerevisiae 앵커 멀리 스트레인 및 복제에 대 한 야생-타입을 포함 하 여 또는 컨트롤 긴장 접종 YPD 매체 (2% 펩, 1% 효 모 추출 물, 및 2% 포도 당)의 5 mL에 신선한 접시에서 단일 식민지.</li>
	<li>일정 한 동요 (150 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 세포 성장.</li>
	<li>다음날 아침, OD600, OD600 YPD 매체의 약 0.1에서 100 mL의 문화를 희석 측정과 OD600≈ 0.8까지 성장 하자.</li>
	<li>1 mg/mL (1 µ g/mL의 농도 최종 rapamycin)의 재고 솔루션에서 문화에 rapamycin의 100 µ L을 추가 하 고 셀 조건부 핵 (에서 고갈 될 관심의 단백질에 필요한 시간에 대 한 지속적인 동요와 30 ° C에 품 어 보자 일반적으로, 30 분은 적절 한). 컨트롤에 대 한 비슷한 효 모 문화를 사용 하지만 rapamycin을 추가 하는 대신 해당 볼륨의 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 추가.</li>
</ol>2. 4tU로 서는 스파이크 (계산) S. pombe 와 라벨
<ol><li>
2 M 4-thiouracil의 새로운 솔루션을 준비 합니다. 일단 준비, 실내 온도에 그리고 멀리 빛 그것을 유지.
	<ol>
<li>정확 하 게 그리고 각 S. cerevisiae 문화에 대 한 4-thiouracil의 64.1 mg 무게 dimethylformamide (DMF)의 250 µ L 또는 DMSO의 250 µ L에서 그것을 분해.</li>
		<li>스파이크에 사용 수 S. pombe 문화 320.5 mg 4-thiouracil의 무게와 DMSO의 1250 µ L에 녹.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5mm의 최종 농도 대 한 S. cerevisiae 와 S. pombe 문화 4-thiouracil 솔루션을 추가 하 고 각각 그들을 30 ° C와 32 ° C에서 일정 한 동요와 함께 6 분 동안 품 어.</li>
	<li>6 분 후 셀 계산에 대 한 각 문화의 작은 약 수를 제거 합니다. 자동 셀 카운터 또는 Neubauer 챔버를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 원심 분리 (2500 x g)을 통해 세포를 수집</li>
	<li>상쾌한, 세척 (2500 x g, 4 ° C, 5 분) 얼음 1 x PBS와 원심 분리기 다시 셀.</li>
	<li>S. cerevisiae 와 S. pombe 샘플의 각 셀의 총 수를 계산 합니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 5 mL에 셀 resuspend와 S. cerevisiae S. pombe 셀 3:1 비율로 섞어.</li>
	<li>Centrifuge 셀 (2500 x g, 4 ° C, 5 분), PBS를 제거, 플래시 동결 세포 액체 N2, 고 추가 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장할.</li>
</ol>3. RNA 추출 및 DNase 치료
<ol><li>약 20-30 분 동안 얼음에 셀 동</li>
	<li>RNA 추출 효 모 RNA 추출 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 몇 가지 각 색으로 진행.</li>
	<li>각 샘플 당 키트와 함께 제공 된 나사 모자 1.5 mL 튜브에 얼음 처럼 차가운 지 르 코니 아 구슬의 750 µ L를 붓는 다. 각 관 당 최대 109 세포에서 RNA 추출 될 수 있다 효율적으로 명심에서 하십시오. 따라서, 각 샘플에 필요한 관 수 준비. 예를 들어 100 mL (OD600≈ 0.8)의 S. cerevisiae 문화 2 x 109 3 x 109 셀, 2.7 x 10의 총을 렌더링할 수 있습니다 (후 3 분 S. pombe의 스파이크에 총에서 4 x 109 셀에9 셀). 이 경우에, 각 샘플/조건/돌연변이/복제 당 3-4 반응 튜브까지 필요한 것입니다.</li>
	<li>각 1 x 109 셀 당 키트와 함께 제공 된 세포의 용 해 버퍼의 480 µ L, 10 %sds, 48 µ L 및 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (25:24:1, v/v/v)의 480 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>와 동 믹서를 사용 하 여 셀을 혼합 하 고 얼음 처럼 차가운 지 르 코니 아 구슬 포함 된 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>와 동 믹서 어댑터에 튜브를 수용, 최대 속도로 소용돌이 돌아서 10 분 (한 방에 4 ° c) 효 모 세포를 lyse 이길. 또는, 자동 구슬 때리는 세포 세포의 용 해를 수행 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 16000 x g 에서 튜브 원심 고 신중 하 게 신선한 15 mL 송 골 매 관에 위 단계 (단계 RNA를 포함)를 수집 합니다. 일반적으로, 각 관 당 복구 볼륨 주위는 500-600 µ L.</li>
	<li>부분적으로 순화 된 RNA를 포함 하는 15 mL 튜브 키트 및 혼합 철저 하 게 제공 하는 바인딩 버퍼를 추가 합니다. RNA 솔루션의 각 100 µ L 당 350 µ L 바인딩 버퍼의 추가 (즉, 수성 단계 솔루션 볼륨은 600 µ L, 바인딩 버퍼의 2.1 mL 때 추가 되어야 합니다).</li>
	<li>이전 혼합물을 100% 에탄올을 추가 하 고 철저 하 게 혼합. RNA 솔루션의 각 100 µ L 당 추가 100% 에탄올의 235 µ L (즉때 수성 단계 솔루션 볼륨은 600 µ L, 에탄올의 1.41 mL 추가).</li>
	<li>최대 700 µ L 필터 카트리지를 단계 3.9에서에서 혼합물의 컬렉션 튜브에서 조립 키트와 함께 제공 하는 둘 다 적용 됩니다.</li>
	<li>16000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기. 원심 분리 기간 필터를 통과 하는 전체 볼륨에 대 한 충분 하지 않은, 경우는 원심 분리를 반복 하 여 30 s.</li>
	<li>흐름을 통해 삭제 하 고 동일한 컬렉션 튜브를 다시 사용. 필터 및 분리기 16000 x g 에서 다시 1 분 동안에 RNA 바인딩 버퍼 에탄올 솔루션의 또 다른 700 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>통해 흐름 무시 하 고 RNA 솔루션 끝날 때까지 3.11, 3.12 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>2 필터 세척 세척 솔루션 1의 700 µ L x. 1 분 동안 16000 x g 에서 원심 통해 세척 솔루션을 수집 하 고 수집 튜브를 항상 유지.</li>
	<li>2 필터 세척 세척 솔루션 2 500 µ L x. 1 분 동안 16000 x g 에서 원심 통해 세척 솔루션을 수집 하 고 수집 튜브를 항상 유지.</li>
	<li>16000 x g 필터를 완전히 건조를 1 분 동안에 다시 한 번 튜브 원심</li>
	<li>최종 수집 관 (RNA 적절 한 관)을 필터 카트리지를 전송 및 RNA DEPC 처리, RNase H2O (100 ° C에 미리 데워)의 50 µ L을 elute.</li>
	<li>16000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>데워 DEPC 처리, RNase 무료 H2o. 확인 모든 볼륨 필터;를 통해 통과 했다 50 µ L와 다시 (동일한 관)에 RNA elute 긴 기간에 대 한 원심 하 분리기, 원심</li>
	<li>하나의 단일 샘플에 대 한 여러 개의 튜브를 사용 하는 경우 하나의 튜브에서 그들을 풀.</li>
	<li>계량 하 고 적절 한 장비를 사용 하 여 샘플의 순도 확인 합니다. 참고: 4tU만 새로 합성된 RNA 내에서 통합 됩니다, 하는 동안 DNA와 사소한 오염의 기회가입니다. 그 이유로, 그것은 항상 DNase와 샘플을 치료 하는 것이 좋습니다 난. 그에 대 한 제조업체의 권장 사항에 따라 RNA 추출 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 시 약을 사용 합니다.</li>
</ol>4. thiol 특정 Biotinylation 새로 합성된 RNA의
<ol><li>2 mg/mL를 프로토콜의 섹션 3으로 얻은 RNA의 농도 조정 합니다. Aliquot 200 µ g 총 RNA의 60 ° C에서 10 분 동안가 열 하 고 즉시 2 분 동안 얼음에 그것을 진정.</li>
	<li>
RNA 약 수를 다음과 같은 순서로 아래에 언급 된 시 약 추가: 600 µ L DEPC 처리, RNase H2O, 100 µ L의 biotinylation 버퍼 (100 mM Tris HCl [pH 7.5] 및 10 mM EDTA, DEPC 처리, RNase 무료 H2O), 그리고 200 µ L의 biotin-HPDP 1 mg/mL biotin-HPDP DMF 나 DMSO의 주식에서.
	<ol>
<li>경우에 따라 biotin HPDP 솔루션 침전 하는, 가능성이 물에 그것의 낮은 용 해도 인해 경향이 있다. 이 상황에서 반응 볼륨의 40%까지 DMSO/DMF의 볼륨 증가 (RNA 샘플 추가 DEPC 처리 H2O, biotinylation 버퍼의 100 µ L 및 biotin-HPDP의 400 µ L의 400 µ L에서 0.5 mg/mL 재고).</li>
	</ol>
</li>
	<li>실 온에서 샘플을 품 어와 부드러운 동요와 함께 3 h에 대 한 빛에서 보호.</li>
	<li>부 화, 후 관에 클로 프롬의 대략 동일한 볼륨을 추가 하 고 적극적으로 혼합.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 13000 x g 에서 샘플을 회전 이 단계는 biotinylate RNA 하지 않았다 과잉 biotin의 제거 수 있습니다. 또는, (무거운) 위상 동기 튜브를 사용 하 여이 단계를 수행 합니다. 그, 13000 x g에서 1 분에 대 한 위상 동기 튜브 아래로 회전, RNA 혼합물과 같은 양의 클로 프롬, 그들을 적극적으로, 혼합 및 4 ° c.에서 5 분 13000 x g 에서 원심 추가</li>
	<li>신중 하 게 새로운 2 mL 튜브에 위 단계를 전송 합니다.</li>
	<li>5 M NaCl의 볼륨의 1/10을 추가 하 고 샘플을 혼합.</li>
	<li>소 프로 파 놀의 동일한 볼륨을 추가 샘플을 철저 하 게 혼합 하 고 적어도 30 분, 4 ° c.에 13000 x g 에서 회전</li>
	<li>신중 하 게 제거는 상쾌한 고 차가운 75% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 13000 x g 에서 회전</li>
	<li>신중 하 게 상쾌한, 빠른 회전, 튜브를 제거 하 고 나머지 에탄올 솔루션을 제거. RNA 펠 릿 건조 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>DEPC 처리, RNase H2o.의 100 µ L에서 RNA를 일시 중단</li>
</ol>5. 정화 Streptavidin 입히는 자석 비즈를 사용 하 여 총 및 레이블이 RNA에서 새로 합성된 분수의
<ol><li>65 ° C에서 10 분 동안 biotinylated RNA를 열 고 5 분 동안 얼음에 샘플을 진정 합니다.</li>
	<li>(200 µ L의 최종 볼륨)에서 biotinylated RNA streptavidin 입히는 자석 구슬의 100 µ L를 추가 합니다. 특히, 더 일관 되 고 신뢰할 수 있는 것이 듯된 다른 연구소와 대화 후, 재료의 테이블에에서 표시 하는 비즈를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>실 온에서 90 분에 대 한 약간의 동요와 함께 샘플을 품 어.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 열을 배치 합니다.</li>
	<li>실 온 세척 버퍼의 900 µ L 추가 (100 mM Tris HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1 %DEPC 처리에 트윈 20, RNase 무료 H2O) 열 (미리 실행 하 고 equilibrate).</li>
	<li>구슬/RNA 혼합물 (200 µ L) 열에 적용 됩니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에서 흐름 통해 수집을 다시 동일한 자석 열에 적용 됩니다. 필요한 경우 레이블 없는 RNA 분수 나타냅니다 통해이 흐름 유지.</li>
	<li>5 열 세척 세척 버퍼의 볼륨을 증가 함께 x (600, 700, 800, 900, 및 1000 µ L).</li>
	<li>0.1 M DTT의 200 µ L로 새로 합성된 RNA elute</li>
	<li>0.1 M DTT의 동일한 볼륨을 두 번째 차입, 3 분 후, 수행 합니다.</li>
	<li>RNA를 eluting 후 3 M NaOAc (pH 5.2), 얼음 100% 에탄올의 3 볼륨 및 20 mg/mL glycogen (RNA-학년)의 2 µ L의 0.1 볼륨을 추가 하 고 RNA 촉진 하룻밤,-20 ° c.에 게</li>
	<li>원심 (13000 x g 4 ° C에서 10 분) 하 여 RNA를 복구 하 고 DEPC 처리, RNase H20 15 µ L에서 resuspend. 표시 된 총 RNA의 비율이 약 2%-4% (보통 더 낮은 끝으로), 새로 합성된 RNA의 약 2.0 µ g 렌더링 될 예정 이다. 이 뿐만 아니라 microarray/시퀀싱 분석에 대 한 몇 가지 정량 실험을 할 정도입니다.</li>
</ol>6. 실시간 정량 다른 분수의 유효성 검사
<ol><li>제조업체의 지침 (자료 테이블)에 따라 총 RNA의 2 µ g 또는 임의의 hexamers와 선택, 역전사를 사용 하 여 레이블이 지정 된 RNA의 10 µ L에서 cDNA를 음성 합성.</li>
	<li>실시간 정량 Pcr 표준 프로토콜 (테이블의 재료)를 사용 하 여 여는 cDNA를 증폭. 참고: 모든 샘플 실행 되어야 합니다 3 중에서 최소 두 개의 생물 복제에서. S. pombe tubulin의 표현에 대 한 모든 원시 값을 수정 합니다.</li>
</ol>7. Microarray 교 잡
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 선호 microarray 칩에 RNA 샘플을 교배 (이 특정 프로토콜에 대 한 재료의 표를참조 하십시오). 간단히, 준비 biotinylated 150에서 cRNA 대상 제조업체의 지침에 따라 최고의 RNA 증폭 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 RNA의 ng. 16 h 45 ° C와 60 rpm microarray 칩에 대 한 조각난된 cRNAs의 4 mg 교배</li>
	<li>세척 하 고 얼룩, 표시 된 역 및 스캐너 (테이블의 재료)를 사용 하 여 칩을 스캔. 명령 콘솔 (AGCC, 버전 4.1.2)를 사용 하 여 스캔 한 이미지에서 원시 데이터 (CEL 강도 파일)를 추출 합니다.</li>
	<li>더 식 콘솔 소프트웨어 버전 1.4.1 프로브 설정 기본 설정 및 정규화 방법으로 확장 하는 글로벌 매스 5.0 통계 기반 알고리즘을 사용 하 여 신호 강도 계산 하는 CEL 파일 처리 합니다. 참고: 각 칩의 트림된 의미 대상 강도 임의로 100으로 설정 됩니다. 적어도 2 개의 독립적인 생물 복제를 사용 하 여 모든 실험을 수행 합니다. S. pombe 신호를 원시 데이터를 표준화 하 고 총과 새로 합성 RNA 수준에서 배 변화 계산.</li>
</ol>8. 데이터 분석 기존 R 파이프라인을 사용 하 여
<ol><li>합성을 계산 하 고 부패 속도 파이프라인 및 공개, R/Bioconductor 패키지를 사용 하 여 앞에서 설명한8,10.</li>
</ol>

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<li>Darzacq, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).</li>
<li>Fuchs, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+genome-wide+transcription+elongation+speeds+and+rates+of+RNA+polymerase+II+transition+into+active+elongation+with+4sUDRB-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq.</a> Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).</li>
<li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

전사에 대 한 변경 내용을 분석 하는 게놈 넓은 도구는 여전히, 개선 하는 동안 정상 수준의 RNA의 정량화를 통해 transcriptome의 유일한 분석 수 있습니다 정확 하 게 반영 하지 변경 RNA 중 합 효소 II 활동에. 실제로, mRNA 수준 RNA 합성에 의해 뿐만 아니라 그들의 성숙과 저하에 의해 통제 된다. 측정 하려면 mRNA 합성 mRNA 저하에서 연결, 고유 프로토콜 효 모와 포유류에 초기 전사의 분석에 대 한 최근 몇 년 동안 개발 되었습니다.
초기 전사의 정량화에 대 한 가장 널리 사용 되는 프로토콜 중 하나 촉진제-seq1입니다. 촉진제-seq의 주요 장점은 높은 해상도 낮은 배경에서 transcriptionally 약혼 하 고 활성 중 합 효소를 공개로 그것의 수 용량, 그것은 그것의 매력을 감소 하는 두 가지 포인트: (i) 그것은 기술적으로 도전 하며는 핵과, (ii) 핵 조작의 절연 시스템<sup cla...

세포는 유전자 식 프로그램의 동적 변경 통해 내 인 성 및 외 인 신호에 응답. 최근 몇 년 동안, 게놈 넓은 방법론의 엄청난 개발 다른 조건 transcriptome 변화의 정확 하 고 포괄적인 설명 수 있습니다. 대부분 transcriptomic 연구, microarray 교 잡 또는 높은 처리량 시퀀싱 총 정상 RNA 분수에서 RNA 수준을 측정 하는 데 사용 됩니다. 특정 섭 동 아래 transcriptional 변경 가능한 결과, 특정 유전자 표현 변경 또는 업 또는 downregulated 되 고 유전자의 큰 스펙트럼의 넓은 범위를 표시할 수 있습니다. 유전자 발현은 미세 조정된 균형의 결과 이다-또는 정상-RNA polymerases에 의해 RNA 합성 및 RNA 수준에 영향을 미치는 다른 프로세스 사이. Rna 중 합 효소 II 전사, mRNA 처리와 세포질 수출, 번역, 저하 고 복잡 하 게 연결 됩니다 (개시, 신장, 그리고 종료), 그것의 세 가지 단계를 포함 하 여.
여러 최근 연구 mRNAs 합성 및 부패는 결합된 메커니즘을 설명 하 고 총 정상 RNA를 측정 하는 때 돌연변이 또는 자극 아래 transcriptional 효과 간과 될 수 보였다. 첫째, 항상 정상 수준의 mRNA의 분석을 통해 transcriptional 변화의 감지는 mRNAs 반감기에 따라 달라 집니다. 섭 동을 도입 되 면 긴 반감기를 가진 mRNAs의 정상 수준 것입니다 훨씬 덜 영향을 보다 짧은 반감기를 가진 mRNAs의. 따라서, 단기 성적에 찬성 하 여 RNA 합성에 변경의 검출 바이어스 강하게 동안 최소로 mRNA 종 분석 전사 율에서 동적인 변화를 공개를 실패할 수 있습니다. 둘째, 여러 개의 보고서, 모두 효 모와 포유류에서 전사에 글로벌 변화 수 있습니다 간과 mRNA의 정상 수준을 분석할 때 나타났습니다. 이것은 mRNA 합성 및 mRNA 버퍼링 결과 저하를 연결 하는 메커니즘으로 인해입니다. 이 mRNA 합성 저하, 새로 베 껴 진된 mRNA의 분석을 통해에서 상태로 계량 하 새로운 프로토콜의 개발을 자극. 최근 몇 년 동안, 여러 가지 대안 되었습니다 제시, 글로벌 실행 시퀀싱 (GRO-seq)1및 네이티브 신장 시퀀싱 (NET-seq)2,3를 포함 하 여. 여기, 우리는 포유류 세포4,,56 에서 처음 개발 하 고 다음 효 모7,,89,10에 적용 하는 프로토콜을 제시 11, thiolated nucleoside 또는 기본 아날로그로 RNA 기반 4-thiouridine (4sU) 또는 4-thiouracil (4tU), 각각.
이 메서드는 특별히 새로 베 껴 진된 RNA는 RNA의 세포에서 정화 펄스 장애 요소가 없으면 세포 항상성에서 4sU로 표시 됩니다. 따라서, 일단 셀 4sU에 노출은, 분자는 빠르게 uptaken, 4sU 3 인산 염에 phosphorylated 및 RNAs 변하게 되 고에 통합. 일단 수정 펄스-분류, 추출 총 세포질 RNA (RNA의 정상 수준에 해당), 수 이며, 그 후, 4sU 라는 RNA 분수 thiol 특히 biotin 사이 이황화 결합의 형성으로 이어지는 고 새로 베 껴 진된 RNA4,5. 그러나, 4sU는 인간의 equilibrative nucleoside 운송업 자 (hENT1), 신진 또는 분열 효 모에의 즉시 사용을 방지 같은 nucleoside 전송기를 표현 하는 세포에 의해 uptaken를 하실 수 있습니다. 하나는 S. pombe 또는 S. cerevisiae에서 hENT1을 표현할 수 있는, 하는 동안 쉽게 접근 달성 될 수 있다 효 모 세포 nucleoside 전송10, 의 식의 필요 없이 4tU 최대 걸릴 수 있습니다 이후 수정 된 기본 4tU를 사용 하 여 11 , 12 , 13. 4tU의 대사 효소 uracil phosphoribosyltransferase (UPRT)의 활동을 필요로 하는 사실. 효 모만 아니라 포유류를 포함 한 여러 유기 체에서 UPRT uridine monophosphate uracil 재활용 pyrimidine 회수 경로 대 한 필수적입니다.
동시에 분석 하는 다른 견본 사이의 정규화 transcriptomic 연구에 중요 한 바이어스를 도입 수 있습니다. 실제로, 많은 일탈 요인 돌연변이 및 야생-타입 긴장의 transcriptome의 비교 분석을 영향을 미칠 수: 세포 세포의 용 해 효율 추출 및 RNA, 및 분산 microarray 분석에 대 한 스캐너 교정에서의 복구에 차이 다른 사람의 사이에서. 위에서 설명 했 듯이, RNA 중 합 효소 II 전사에 글로벌 효과 예상 되는 등 유사 특히 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 정확 하 게 다른 견본 사이의 mRNA 합성 레이트를 비교 하는 우아한 의미 내부 표준으로 먼 관련된 분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 를 사용 하 여 설계 되었다. 고정 된 수의 표시 S. pombe 셀 S. cerevisiae 샘플, 야생-타입 또는 돌연변이 세포, 세포 세포의 용 해 및 RNA 추출10이전에 추가 됩니다. 그 후, S. pombe 와 S. cerevisiae 에서 정상 상태와 새로 합성 RNAs 실시간 정량 또는 통해 microarray 칩 또는 높 처리량 연속10의 사용에 의해 정량은. 이러한 데이터를 결합 하 여 운동 모델링, mRNA 합성 및 싹 트는 효 모에는 감퇴의 절대 속도 측정할 수 있습니다.
이 원고 틀에서 새로 베 껴 진된 RNA 분석 신진에 RNA 중 합 효소 II 전사에서 coactivator 단지 사가 TFIID14,15, 효 모에 대 한 글로벌 역할을 허용 하는 방법을 살펴보겠습니다. 16. 중요 한 것은, 과거의 연구 S. cerevisiae 에서 정상 mRNA 레벨을 계량 및 제안 사가 사가 돌연변이 의해 강하게 영향을 하지만 상대적으로 TFIID를 저항 하는 효 모 유전자의 제한 된 집합에 주된 기능을 담당 변이17,,1819. 놀랍게도, 사가 효소 활동 전체 베낀된 게놈 RNA 중 합 효소 II 전사에이 공동 활성이 제에 대 한 광범위 한 역할을 제안에 따라 행동을 표시 했다. 가장 표현된 유전자에서 감소 RNA 중 합 효소 II 모집 사가 또는 이러한 coactivators 대부분 유전자에서 함께 일 하는 것을 건의 하는 TFIID의 비활성화에 관찰 되었다. 따라서, 새로 베 껴 진된 mRNA의 정량화 사가 TFIID RNA 중 합 효소 II14,,1516에 의해 거의 모든 유전자의 전사에 대 한 요구는 밝혔다. 보상 메커니즘의 구현 mRNA 저하에서 동시 글로벌 감소에 의해 버퍼링 되는 mRNA 합성의 글로벌 감소에 대처 하기 위해 셀에 대 한 방법으로 나온다. 사가 녹음 방송 요인 TFIIH21,22에 RNA 중 합 효소 II 전사, RNA Pol II subunits10등 글로벌 효과, 중재자 coactivator 복잡 한20, 일반 요인의 목록에 추가 , 그리고 간접적으로, mRNA 저하 기계9,,1023의 요소. 이러한 보상 이벤트 사가 돌연변이, 정상 mRNA 수준의 mRNA 합성14글로벌 하 고 심각한 감소에도 불구 하 고 겸손 하 고 제한 된 변화에 대 한 회계에서 보편적으로 관찰 되었다. 비슷한 분석 또한 히스톤 H2B ubiquitination의 완전 한 손실을 BRE1 삭제 스트레인에서 수행 했다. 흥미롭게도, 많은 온화한 그러나 일관 된 글로벌에 대 한 효력이 RNA 중 합 효소 II 전사는 감지 하 고 다양 한 mRNA에 변화를 계량 수 있습니다. 효에서 새로 베 껴 진된 RNA의 대사 라벨을 나타내는 Bre1의 부재에서 검출 될 수 있습니다. 합성 비율입니다.

<table><tbody><tr><td>4-Thiouracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 440736</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 자동 세포 계수기</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RiboPure RNA 정제 키트, 효모</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 분광 광도계</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA 프리 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>Thiolutin</td><td>Abcam</td><td>ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&micro; MACS Streptavidin kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>전사자 역전사효소</td><td>Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 효모 게놈 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 유체 역학 스테이션 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 스캐너 3000 7G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mrna로 rna 중 합 효소 ii 활동에 대 한 프록시

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

RNA 중 합 효소 II 전사 글로벌 결함 transcriptomic 연구 분석 정상 RNA에 의해 간과 수 있습니다. 실제로, mRNA 합성의 글로벌 감소 정상 정상 수준 복원 mRNA 저하에서 동시 감소에 의해 보상을 보여줘 왔다. 따라서, mRNA 감퇴에서 독립적으로 mRNA 합성의 게놈 넓은 정량화 RNA 중 합 효소 II transcriptional 활동의 가장 직접적인 반영 이다. 여기, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)에서 초기 RNAs의 대사 라벨 비 perturbing를 사용 하는 방법을 다루겠습니다. 특히, 셀 thiouracil-uracil 아날로그, 4와 6 분에 대 한 교양 및 레이블이 새로 베낀된 RNAs는 정화 모든 개별 mRNA의 합성 레이트를 결정 하기 위해 계량. 또한, 사용 하 여 표시 된 Schizosaccharomyces pombe 셀 내부 표준 허용 다른 S. cerevisiae 에 mRNA 합성 비교 긴장. 이 프로토콜을 사용 하는 동적 운동 모델 데이터를 피팅, 대응 mRNA 감퇴 속도 확인할 수 있습니다.

여러 측면을 통제 될 필요가 새로 베 껴 진된 RNA의 대사 라벨을 수행할 때: 시간과 효율 라벨, 스파이크에 비례하여, 추출 프로토콜 및 biotinylation 효능 (포함 한 신호 대 잡음 비율) 중에서 다른 사람. 이러한 조건이 광범위 하 고 조직적으로 표시 되었습니다 다른 사람에 의해7,,1011. 여기 우리는 주로 해석 일단 샘플 처리, 실시간 정량, microarray, 또는 연속 하 여 수행할 수 있는 즉각적인 분석에 초점. 다른 돌연변이 체 긴장의 분석 사가 돌연변이 S. cerevisiae 의 경우 mRNA 합성 뿐만 아니라 극적인 글로벌 감소를 감지 하는 방법의 힘을 보여 긴장, 아니라 RNA 중 합 효소 II 활동 시의 매우 가벼운 감소 히스톤 H2B monoubiqu...

여기에 설명 된 프로토콜 4-thiouracil으로 표시 하는 효 모 세포에서 정화 하는 새로 합성된 mRNA의 게놈 넓은 정량화를 기반으로 합니다. 이 방법은 mRNA 합성 mRNA 감퇴에서 연결을 측정할 수 있게 그리고, 따라서, RNA 중 합 효소 II 전사의 정확한 측정을 제공 합니다.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

이 기술의 주요 장점은 RNA 분해에 의해 영향을 받지 않는 새로 합성된 mRNA를 측정하여 RNA 폴리머라제 II 활성을 반영한다는 것이다. 이 프로토콜은 원래 마이크로어레이 혼성화를 사용하여 설명되었지만 새로 전사된 mRNA의 고온 시퀀싱에 쉽게 채택될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 티아고 침례교, 우리의 실험실에서 전 졸업생이 될 것입니다.S.cerevisiae 세포를 접종 한 후, 150 RPM에서 지속적인 동요와 섭씨 30도에서 하룻밤 을 성장. 다음 날, 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. YPD 배지의 100 밀리리터에서 약 0.1의 OD600으로 배양을 희석시.OD600이 약 0.8이 될 때까지 세포를 성장시다. 그 후, S.pombe 하룻밤 문화의 OD600을 측정합니다. 이 배양을 YAS 배지의 500밀리리터에서 약 0.1의 OD600으로 희석하고 OD600이 약 0.8이 될 때까지 자랄 수 있도록 한다.먼저, 두 개의 어금니 4-티오라실의 신선한 솔루션을 준비한다. 준비된 솔루션을 실온에서 유지하고 빛으로부터 보호하십시오. 최종 농도가 5 밀리머인 S.cerevisiae 및 S.pombe 문화에 4-티오라실 용액을 추가합니다.S.cerevisiae와 S.pombe 문화를 각각 섭씨 30도, 섭씨 32도에서 배양하고 6분 동안 지속적인 동요를 합니다. 그 후, 각 배양의 작은 알리쿼트를 제거하고 자동 세포 카운터 또는 노이바우어 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 원심분리기는 세포를 수집하는 데 5분 동안 2, 500배, 섭씨 4도에서 분리됩니다.상체를 버리고 얼음 차가운 한 번 PBS로 세포를 씻으십시오. 원심분리기는 다시 2, 500배, 섭씨 4도에서 5분간 다시 원심분리기를 사용한다. 다음으로, 얼음 의 5 밀리리터에 세포를 다시 일시 중단 한 번 PBS.S.cerevisiae 및 S.pombe 세포를 3 대 1의 비율로 혼합합니다. 혼합 샘플을 2, 500배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 액체 질소로 세포를 동결 플래시.사용 준비가 될 때까지 샘플을 음수 섭씨 80도에 저장합니다. 진행 준비를 마쳤을 때, 약 20~30분 동안 얼음 에 세포를 해동하십시오. 적응된 효모 RNA 추출 키트를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RNA를 추출합니다.이 후 필터 카트리지를 최종 수집 튜브로 옮기습니다. 100섭씨까지 예열된 DEPC 처리 RNase 프리 워터 50 마이크로리터로 RNA를 엘테. 16, 000배 에서 1분간 원심분리기.그런 다음 예열된 DEPC 처리 RNase 프리 워터 50 마이크로리터를 사용하여 RNA를 동일한 튜브로 다시 엘로트합니다. 원심분리기는 16, 000배 g에서 1분 동안 전체 샘플 볼륨이 필터를 통과했는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 원심분리기는 더 오랜 시간 동안 다시 원심분리기를 다시 합니다.완료되면 적절한 장비를 사용하여 샘플의 순도를 정량화하고 확인하십시오. DEPC 처리 된 뉴클레아제없는 물을 사용하여 이전에 획득 한 RNA의 농도를 밀리리터 당 2 밀리그램으로 조정하십시오. Aliquot 200 마이크로그램의 총 RNA를 10분 동안 섭씨 60도에서 가열합니다.즉시 2 분 동안 얼음에 차가운. DEPC 처리 RNase 가 없는 물 600마이크로리터를 추가합니다. 바이오타이니션 버퍼 100마이크로리터를 추가한 다음 200마이크로리터의 비오틴 HPDP를 추가합니다.비오틴 HPDP 솔루션이 용액에서 침전되는 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응 량의 최대 40%까지 DMSO 또는 DMF의 볼륨을 증가시합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 3시간 동안 부드러운 교반으로 실온에서 배양합니다. 그 후, 튜브에 약 동일한 부피의 클로로폼을 추가하고 적극적으로 섞는다.원심분리기는 13, 000배, 섭씨 4도에서 5분간. 다음으로 상층을 새로운 2밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮기십시오. 시료 부피의 약 1/10에 해당하는 5개의 어금다 나트륨을 추가합니다.그런 다음 샘플을 혼합합니다. 먼저 생체화 RNA를 섭씨 65도에서 10분간 가열합니다. 그런 다음 얼음에 샘플을 5 분 동안 식힙니다.생체 화 RNA에 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 구슬 100 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 90분 동안 약간의 흔들림으로 배양하세요. 키트와 함께 제공된 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓습니다.다음으로, 열에 실온 세척 버퍼의 900 마이크로 리터를 추가합니다. 200 마이크로리터 비드 및 RNA 혼합물을 컬럼에 적용합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 흐름을 수집한 다음 동일한 자기 컬럼에 다시 적용합니다.라벨이 없는 RNA 분획을 나타내기 때문에 필요한 경우 이 흐름을 유지합니다. 다른 분획의 RT-qPCR 유효성 검사를 시작하려면 먼저 텍스트에 설명된 대로 cDNA를 합성합니다. 그런 다음 표준 프로토콜을 사용하여 실시간 qPCR으로 cDNA를 증폭시합니다.4-티우라실의 유무에 관계없이 배양된 야생형 세포로부터 정제된 분획에서 측정된 성적증명서 수준은 이 절차가 특별히 표지된 RNA를 정화하는 것을 확인하였다. spt20 델타 균주의 분석은 총 정상 상태 RNA의 양이 크게 변하지 않거나 테스트 된 유전자에 대해서만 약간 감소한다는 것을 보여줍니다. bre1에 대해 삭제된 균주에 대해도 유사한 결과가 나오게 됩니다.그러나, spt20 델타 균주에서 새로 전사된 RNA의 분석은 모든 시험된 유전자를 위한 mRNA 합성에 있는 3 5 배 감소를 제시합니다. 한편, bre1의 손실은 더 신중하지만 여전히 눈에 띄는 감소로 이어집니다. spt7의 유도 가능한 고갈시, 사가 복합체의 구조적 서브유닛, 새로 전사된 mRNA 수준은 삭제 균주와 유사한 정도로 감소된다.총 RNA 수준이 게놈 전체 분석에 의해 측정될 때, 단지 몇몇 유전자는 spt20의 삭제 시 그들의 발현 수준이 위로 조절또는 아래로 조절에 의해 변경되는 것을 보입니다. 그러나, 새로 전사된 RNA의 분석은 4, 000 이상의 유전자의 수준이 신진 효모에서 RNA 폴리머라제 II 전사에 사가의 글로벌 긍정적 인 효과를 시사 하는 spt20의 삭제시 적어도 두 배 이상 감소되는 것으로 나타났습니다. 이 방법은 Saccharomyces cerevisiae에 있는 전사에 있는 통찰력을 제공할 수 있더라도, 이 프로토콜을 사용하여에 약간 변이로만 적용되었습니다, 우리는 mRNA 분해에 있는 글로벌 감소에 의해 보상된 mRNA 합성에 있는 글로벌 감소를 검출할 수 있었습니다.

saccharomyces-cerevisiae-metabolic-labeling-with-4-thiouracil

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

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형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

이 문서에서는 조사 반딧불 루시 페라 제 - GFP 융합 단백질의 사용을...

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특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

효모 사카로미세세스 세레비시아에서새로 전사된 RNA를 민감하게 그리고 구체적으로 정화하기 위해 티오레이드 우라실을 사용한다.

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

여기서, 중성 지질의 분리를 위한 얇은 층 크로마토그래피와 결합된 14C-아세트산을 가진 효모의 대사 라벨링을 위한 프로토콜이 제시된다.

대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

우리는 생체 내에 통합되고 현미경 및 유세포 분석에 의한 Click 화학을 사용하여 검출되는 티미딘 유사체인 EdU를 사용하여 S. cerevisiae에서 S상 지속 시간을 정확하게 결정하기 위한 두 가지 보완 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 DNA 복제 기간을 쉽게 특성화하고 돌연변이의 복제 결함을 간과할 수 있습니다.

사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정

RNA 2차 구조는 주로 구조 탐사 방법을 통해 성숙한 RNA에서 관찰되었습니다. 공동전사구조추적시퀀싱(CoSTseq)은 핵 런온을 구조 탐지와 결합하여 신생 RNA의 중합효소 위치를 연구하는 데 사용되었습니다. CoSTseq는 활성 전사 상태에서 RNA 내 RNA 2차 구조를 관찰할 수 있게 합니다.

Saccharomyces cerevisiae에서 신생 및 성숙 전사체의 RNA 구조 비교 분석

배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 4-thiouracil 표지를 이용한 신규 합성 mRNA 정량화 방법으로 RNA 중합효소 II 활성을 정확히 측정하는 기술입니다. 이 프로토콜은 전사 동역학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

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