Name: 마우스 기본 Motoneurons Transfecting으로 Charcot Marie이 질병에서 체 외에서 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 배우세요 마우스 척수에서 기본 운동신경원을 분리하고 마그네토펙션으로 형질전환하는 방법을. 밀도 구배 원심분리로 세포를 정제하고 신경퇴행성 질환의 병리 기전을 연구할 수 있습니다.

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우리는 "협회 부 르 지속 가능성 드 라 neurogénétique" 박사 Jacquier의 친목 및 AFM-텔 레 톤 MyoNeurAlp 전략적 계획을 통해 그것의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 박사 크리스 헨 더 슨, 박사 윌리엄 Camu, 박사 Brigitte Pettmann, 박사 세 드 릭 라울, 누가 개발 하 고 기술 향상에 참가 하 고 그들의 지식을 전파 하는 박사 게오르그 세 감사 하 고 싶습니다.

동물 관련 된 모든 절차는 기관의 윤리 위원회에 의해 허용 했다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>4% BSA L-15 매체에 dialyzed의 10 mL를 준비 합니다.<ol>
<li>L-15 매체의 10 mL에 4% (w/v)에 소 혈 청 알 부 민 분말을 용 해.</li>
		<li>20 mL 투 카세트 20 kDa 커트 오프로에 솔루션을 추가 합니다. 4 ° c.에 동요에서 3 일 동안 L-15 매체의 500 mL에 대 한 dialyze L-15 매체 매일 변경 합니다.</li>
		<li>0.22 μ m 막 및 15 mL 튜브에 약 수를 통해 해결책을 필터링 합니다. -20 ° c.에 튜브를 저장 참고:이 프로토콜 사용 하 여 다음 참조: 수정 되지 않은 원시 L-15 매체 L-15 매체, 산 성 L-15 매체 = = pH L-15, 및 기본적인 L-15 매체 중 탄산염 L-15 =.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PH L-15 200ml를 준비 합니다.<ol>
<li>L-15 매체의 pH 조정: 첫째, 드라이 아이스의 일부 조각을 세척 병 채우기. 색상 오렌지 변할 때까지 L-15 매체에 가스 (CO2)를 주입 (~ pH 6.4 고 ~ 40 압력). PH는 또한 표준 pH 측정기와 함께 조정할 수 있습니다.</li>
		<li>한 달 동안 0.22 μ m 막 및 4 ° C에서 저장소를 통해 매체를 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mL 중 탄산염 L-15의 준비.<ol>
<li>L-15 매체의 97.5 mL를 7% 나트륨 중 탄산염의 2.5 mL을 추가 하 고 4 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>IPCS (인슐린 Putrescin Conalbumin Selenite) 보충제를 준비 합니다.<ol>
<li>0.1 M HCl. 추가 이중 증 류 물 4.5 mL의 0.5 mL에 인슐린의 2.5 mg을 디졸브.</li>
		<li>8mg putrescine 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 mL에 용 해.</li>
		<li>10 ml PBS의 conalbumin의 100 밀리 그램을 디졸브.</li>
		<li>분해 물 19.3 ml에서 나트륨 selenite의 1 밀리 그램, pH 7.4를 조정 하 고 솔루션을 10 배 희석.</li>
		<li>인슐린 솔루션의 1 mL, putrescine 솔루션의 1 mL, conalbumin의 1 mL 및 IPCS 보충 솔루션의 3.1 mL를 나트륨 selenite 솔루션의 0.1 mL을 결합 합니다. -20 ° c.에 솔루션 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.02 m m 프로 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>80% 에탄올의 1.6 ml에서 황 체 호르몬의 1 마그네슘을 디졸브.</li>
		<li>솔루션 100에 100% 에탄올을 희석 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>완전 한 L-15 매체의 100 mL를 준비 합니다.<ol>
<li>PH 3.5 mg/mL의 최종 농도 포도 당을 얻기 위해 L-15 92 mL를 D-포도 당 솔루션 (200 mg/mL)의 1.8 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>100의 1 mL을 결합 하 여 페니실린 스 x (10000 U/mL), 열 비활성화 말 혈 청의 2 mL, IPCS 믹스의 3.1 mL 및 progesterone 솔루션 (2 x 10-5 M)의 0.1 mL.</li>
		<li>0.22 μ m의 막에 매체를 필터링 및 4 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 당 밀도 그라데이션 솔루션 (최종 농도의 5.5%)의 5 mL을 준비 합니다.<ol>
<li>4524 µ L L-15의 상업 60% 밀도 그라데이션 매체의 476 µ L 추가 (interphase;에서 시각적 대비를 증가 붉은 페 놀 없이 가능 하다 면, 1:10. 5의 희석 비율).</li>
		<li>2 주 동안 4 ° C에서 솔루션을 저장 또는-20 ° c.에 그것을 동결합니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>문화 미디어의 10 mL를 준비 합니다.<ol>
<li>신경 세포 배양 매체의 9.6 mL를 보충 매체의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>글루타민의 25 µ L을 10 µ L 2-mercaptoethanol의 열 활동 되지 않 ㄴ 말 혈 청 (는 glial 세포 선구자 및 확산에 대 한 작품을 차별화 하는 경향이)의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>0.22 μ m 필터를 통해 미디어를 필터링 합니다.</li>
		<li>다음 neurotrophic 요인 추가: 10 ng/mL의 최종 농도에 속눈썹 neurotrophic 요인 (CNTF) 및 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF) 및 glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF) 1 ng/mL의 최종 농도에.</li>
		<li>4 ° c.에 미디어를 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>해 부 미디어의 50 mL를 준비 합니다.<ol>
<li>HBSS의 47.05 mL를 포도 (200 mg/mL)의 2.25 mL를 추가 합니다. Ph 7.4의 1 M HEPES 700 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 미디어를 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 %PFA 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>500 ml PBS의 PFA의 20 g을 분해.</li>
		<li>화학 후드에서 60 ° C에 솔루션을 열 하 고 솔루션 취소 될 때까지 1 M NaOH의 몇 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>필터 종이 통해 해결책을 필터링 하 고 pH 7.2 조정 합니다. -20 ° c.에 그것을 저장합니다 참고: 또는, 다른 상용 PFA 솔루션 사용 고 PBS에서 4%로 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>집게가 위, 및 실리콘 요리 비누 사용 하기 전에, 70% 에탄올과 해 부 도구를 청소 하 고 사용 후 맑은 물.</li>
</ol>2. 폴 리-ornithine/Laminin (포/L) 코팅 접시
참고: 볼륨 코트 24-잘 접시에 적응은.
<ol><li>필요한 경우, 살 균 12 mm coverslip 잘 넣어.</li>
	<li>물에 녹아 10 µ g/mL 폴 리-L-Ornithine 솔루션의 500 µ L로 웰 스 코트.</li>
	<li>실 온에서 1 h 정착 우물을 하자.</li>
	<li>폴 리-L-Ornithine 솔루션을 제거 하 고 30 분 동안 건조.</li>
	<li>탄산염 L-15에서에서 3 µ g/mL laminin의 500 µ L 37 ° C에서 하룻밤 웰 스 코트. 참고: 웰 스 저장할 수 있습니다 37 ° C에 인큐베이터에서 7 일 동안. 긴 외피, 우물 사이 살 균 PBS 추가 중간 증발을 피하기 위해 도울 수 있다.</li>
</ol>3입니다. 해 부
<ol><li>E12.5 배아 단계에서 배아는 임신 마우스를 희생. 70% 에탄올과 배꼽 청소.</li>
	<li>두 oviducts와 질을 절단 하 여 자 궁을 제거 하 고 차가운 PBS (없이 캘리포니아2 + Mg2 +)으로 가득 페 트리 접시에 넣어.</li>
	<li>모든 배아를 수집 하 고 신선한에 그들을 전송 차가운 PBS (없이 캘리포니아2 + Mg2 +) 페 트리 접시에서.</li>
	<li>실리콘 코팅 및 (HBSS와 포도 당 4.5 g/L, 7 mM HEPES pH 7.4) 해 부 미디어의 전체 접시에 하나의 배아를 넣어. 참고: 배아 해 부 현미경으로 깨끗 한 고 운 집게와가 위를 사용 하 여 수행 됩니다. 또는 실리콘 없이 일반 배양 접시 해 부에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>머리, 꼬리, 내장가 위 집게를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>집게와 실리콘에 대 한 배와 배아를 유지 합니다.</li>
	<li>집게의 두 번째 쌍 rostral 척수의 중앙 채널에 삽입 팁 중 하나.</li>
	<li>눈물 등 조직 몇 밀리미터에 집게를 닫습니다.</li>
	<li>전체 척수 오픈 될 때까지 꼬리 쪽으로이 작업을 반복 (그림 1B).</li>
	<li>시체에서 척수 (대뇌 간선)의 rostral 부분을 분리 합니다.</li>
	<li>실리콘에 대 한 오픈 척수를 유지 하기 위해 배아를 설정 합니다.</li>
	<li>척수의 rostral 부분을 꼬 집 고 머리 척수를 추출 하 여 태아를 당겨. 참고: Meninges과 지 루트 신경 절 (Drg) 태아에 부착 되어 있어야 합니다. 그렇지 않으면, 조심 스럽게 빼냅니다 멀리 어떤 나머지 meninges과 Drg 여전히 척수에 연결 된. 이 단계에서 Drg 수 또한 민감한 신경 문화에 대 한 수집 될 (내용 참조).</li>
	<li>실리콘에 척수를 평평 하 고 메스를 사용 하 여 각 면의 중앙을 따라 절단 하 여 코드의 등 절반을 제거 합니다. 메스를 사용 하 여 10 조각으로 중간 부분을 잘라내어 새로운 튜브 조각을 전송.</li>
</ol>4. 척수 세포 현 탁 액
<ol><li>6 ~ 8 척수에 대 한이 해 부 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>하자 척수 조각 튜브의 하단에 수집 하 고 햄 F10 매체의 1 mL에는 HBSS 바꿉니다.</li>
	<li>트립 신 (2.5 %w / v, 최종 농도 0.025%)의 10 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에서 10 분 동안 튜브를 품 어</li>
	<li>효소 소화를 중지, 완전 한 L-15 매체, 4% (w/v) BSA 100 µ L DNase (L-15 중간에 1 mg/mL)의 100 µ L의 800 µ L을 포함 하는 새로운 15 mL 튜브에 파편을 전송.</li>
	<li>두번 P1000 피 펫을 사용 하 여 1 mL 발음 하 여 triturate. 조각 2 분 수집 신선한 15 mL 튜브에 상쾌한 정착 하자.</li>
	<li>조각을, 완전 한 L-15 매체의 900 µ L, 4% (w/v) BSA 100 µ L 및 DNase (L-15 중간에 1 mg/mL)의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1 mL P1000 피 펫을 사용 하 여 발음 하 여 6 번 triturate. 조각 2 분 추가 15 mL 튜브에 상쾌한 단계 4.5에서에서 얻은 정착 하자.</li>
	<li>조각을, 완전 한 L-15 매체의 900 µ L, 4% (w/v) BSA 100 µ L 및 DNase (L-15 중간에 1 mg/mL)의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1 mL P1000 피 펫을 사용 하 여 발음 하 여 10 배 triturate. 조각 2 분 추가 15 mL 튜브에 상쾌한 단계 4.5에서에서 얻은 정착 하자. 상쾌한 진행.</li>
	<li>부드럽게 장소 P1000 피펫으로 사용 하 여, 표면에 뜨는 튜브의 아래쪽 2 mL BSA 4% (w/v) 쿠션. 5 분 동안 470 x g에서 원심.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 완전 한 L-15 매체의 2 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>5. 미네소타 농축 그라데이션 밀도
<ol><li>두 개의 15 mL 튜브 (각 1 mL)으로 세포 현 탁 액을 분할. 그런 다음 완전 한 L-15 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 6 배아에서 시작 해 서, 매체의 3 mL에 튜브 당 3 배아의 동등한을 사용 합니다.</li>
	<li>천천히 날카로운 인터페이스를 각 튜브의 하단에 솔루션을 추가 하 여 밀도 그라데이션 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 15 분 동안 830 x g에서 원심. 이 단계 후 작은 셀 MNs 같은 큰 세포 밀도 그라데이션 솔루션/매체 인터페이스에 있어야 하는 반면 튜브의 하단에 있어야 합니다.</li>
	<li>인터페이스에서 세포를 수집으로 1 또는 2 mL를 발음 하 고 신선한 15 mL 튜브에 그들을 전송. L-15 pH 매체와 10 mL을 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>튜브 및 실 온에서 5 분 동안 470 x g에서 원심 분리기의 바닥에 4 %BSA 쿠션의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 완전 한 L-15 매체의 3 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>5.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 완전 한 문화 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 휴대폰 번호와 생존 한 hemocytometer와 위상 대비 현미경을 계산 합니다. 참고: 6 척수에 대 한 셀 수 약 1 × 105 MNs 예상입니다.</li>
</ol>6. 미네소타 문화
<ol><li>보통 5000 ~ 10000 셀 24-잘 접시에 잘 당 문화 매체의 500 µ L에 적절 한 밀도를 MNs 희석. 참고: 각각 6-96 잘 접시, 30000 및 1500 셀 주위는 밀도 시드입니다.</li>
	<li>한 P1000 laminin 솔루션을 제거 합니다.</li>
	<li>즉시에 건조 하지 않도록 코팅 판으로 문화 매체에 희석 MNs 전송.</li>
	<li>37 ° c.에 2 일 동안 문화를 품 어</li>
</ol>7입니다. MNs의 Magnetofection
참고: 다음 단계에 사용 하는 수량 24-잘 접시의 한 우물의 transfection에 대 한 의미가 있다. 다른 형식에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 참조 하십시오.
<ol><li>DNA 준비를 위해 resuspend 1 µ g의 DNA 신경 문화 매체와 5 소용돌이의 50 µ L에서 s.</li>
	<li>비드 튜브 준비, 대 한 신경 문화 매체의 50 µ L에서 구슬의 1.5 µ L을 resuspend.</li>
	<li>50 µ L DNA 솔루션을 50 µ L 비드 솔루션을 추가 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어 (전체 용량 = 100 µ L).</li>
	<li>이 부 화 하는 동안 페는 우물에서 문화 매체의 100 µ L를 철회. 참고: 그것을 따뜻하게 37 ° c 배양 기에서 자기 접시를 넣어</li>
	<li>잘, DNA/구슬 믹스 100 µ L를 전송 하 고 접시를 품 어 37 ° c.에 자기 접시에 20-30 분</li>
	<li>CDNA 식의 감지 하기 전에 적어도 24 시간을 기다립니다.</li>
</ol>8. 고정 및 얼룩
<ol><li>PBS로 2 회 문화를 씻어.</li>
	<li>4%에서 실 온에서 20 분에 대 한 문화를 품 어 PFA/PBS.</li>
	<li>PBS로 2 회 문화를 씻어.</li>
	<li>실 온에서 1 h 블로킹 버퍼 (PBS, BSA는 4%, 2% 정상 혈 청, 0.3% 트라이 톤 X-100, 0.1 m M 글리신)의 500 µ L에서 문화를 품 어. 참고: 일반 혈 청 (예: 정상 염소 혈 청) 2 차 항 체로 동일한 종에서 파생 되어야 한다.</li>
	<li>블로킹 버퍼의 250 µ L에 희석 하는 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어. 참고: 예를 들어, TUJ1은 1/1000에 사용 SMI32 1/1000, 사용 되 고 Lc3b는 1/200에서 사용 됩니다.</li>
	<li>3 회 PBS 가진 문화를 씻어.</li>
	<li>Fluorophore 활용 된 이차 항 체 실 온에서 1 시간 동안 블로킹 버퍼의 250 µ L에 희석 된 문화를 품 어.</li>
	<li>3 회 PBS 가진 문화를 씻어.</li>
	<li>설치 매체를 사용 하 여 유리 슬라이드에 탑재 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 중요 한 포인트 중 하나는 마우스 배아는 개발 (E12.5) 끝에 얻은 MNs의 양을 최적화 하는 동안 정확한 시간대에 해 부입니다. 또한, 최적의 생산량에 대 한 해 부 수행 되어야 한다 아침 이나 이른 오후에. E12.5 (예를 들어, E11.5에서), 전에 해 부가 어렵습니다, 특히 meninges의 제거에 관한. E12.5, 후 얻은 MNs의 수는 크게 떨어진다. 개발의 배아 단계 제어, 성인 여성 및 남성 처음 배치 됩니다 함께 하루의 끝에서. 다음날 아침, 성인 구분 됩니다, 그리고 여성 질 플러그의 존재를 확인 합니다. 있으면 플러그, 배아는이 시점에서 개발의 E0.5 일에 것으로 간주 됩니다. 이러한 실험에 대 한 우리는 일반적으로 적극적이 고 생산적인 마우스 선을 사용 합니다. 미주리에서 자란 식민지에서 발생 하는 창시자가이 프로토콜에 사용 되 고 변형 CF1 선정 됐다 (Carworth 농장 스트레인 1). 이 긴장에서 찰스 강 실험실 프랑스에서 1967 년에, 소개 되었다 그리...

신경 근육 학 질병 근육 및 신경 시스템의 변경에 의해 특징은 임상 및 유전으로 명료한 pathologies의 다양 한을 포함 됩니다. 시퀀싱 기술 발전, 때문에 유전자가 희귀 질환에 대 한 책임의 수백 지난 10 년 동안 확인 되었습니다 (Neuromuscular 질병 센터에서 사용할 수 있는 목록 http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). 확인 된 돌연변이의 다양 한 다른 고기 및 질병1,,23 다른 돌연변이 단일 유전자에서 발생할 수 있습니다 나타내고 다른 유전자에 돌연변이 비슷한 고기를 생산할 수 있는 4 , 5. 이러한 맥락에서 돌연변이 결과 및 병 적인 메커니즘을 분석 하기 위한 강력한 도구가 될 수 있는 휴대 전화 모델을 개발 하는 노력 있다.
척추 MNs는 척수의 복 부 뿔 형태 긴 축 삭 골격 근육 섬유를 타겟으로하 고 신경 근육 접합부에서 아 세 틸 콜린의 출시를 통해 자발적인 움직임에 대 한 허용에 있는 큰 somas는. MNs는 루 경화 증, Charcot Marie이 질병 (CMT), 신경 근육 학 질병에 의해 영향을 때문에 척추 근육 위축, 닥터 헨 더 슨과 동료 의 재배에 대 한 허용 된 첫 번째 프로토콜6 개발 생체 외에서 척추 MNs 및 科의 발견 요소 GDNF7 (glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인). 그 이후 기술 상세 척추 MNs 및 FACS8를 사용 하 여 그들의 하위의 더 정확한 정화에 대 한 허용 하지만 밀도 그라데이션에 의해 농축 남아 기본 척추 MNs 작업은 현재 실험실에서 강력 하 고 널리 사용 되 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 그 후, 그것은 또한 표면 마커 p75(NTR)15,,1617의 활용 하 여 immunopanning 통해 높은 미네소타 정화 등급을 얻을 수.
척수 포함 dorso 복 부 축에 전방 경적에서 그들의 위치 사이에서 다른 중간과 측면 모터 열으로 자 궁 경부, 흉부, 요 추 MNs의 다른 하위 및 표적 중 그들은 자극8, 18. 주 미네소타 문화 생리 적인 비율에 이러한 미네소타의 모든를 복구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 한계는 프로시저;의 끝에 얻은 MNs의 낮은 수 사실, 그것은 현미경 검사 법 그러나 생화학 실험에 대 한 제한에 대 한 적당 한 6 개의 배아에서 약 105 MNs를 얻을 것으로 예상 수 있습니다. 더 표준화 된 하위와 풍부한 MNs 실험을 수행 하기 위해 (> 106 셀), 배아 줄기 세포 유래 MNs18고려 되어야 한다.
기본 MNs로 야생-타입/돌연변이 transgenes 또는 최저의 내 생 유전자의 transfection는 특히 마우스 모델 사용할 수 없을 때 physiopathological 경로 해독에 대 한 신속 하 고 유용한 도구입니다. Magnetofection은 transfecting 기본 신경, 관련된 neurotoxicity 없이 lipofection와 비슷한 하나의 기술입니다. 또한, 몇 일 후 체 외에서electroporation9에 따라 기술 달리 성숙한 뉴런에 transfection은 수행할 수 있습니다. 그러나, 한이 기술의 단점은 구슬 DAPI 라벨에 잡음을 일으키는 문화에서 핵 산 바인딩입니다. 바이러스 감염 가능성이 transfecting MNs;에 대 한 가장 효율적인 기술 이다 그러나, magnetofection는 바이러스 생산 및 세포 감염에 필요한 특정 안전 절차를 필요 하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone dissection dish</td><td>Living systems instrumentation</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td>Sylgard</td></tr><tr><td>round coverslip</td><td>NeuVitro, Knittel glass</td><td>GG-12-Pre</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Slide a Lyzer cassettes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66030</td><td>20,000 MWCO ; 30 mL</td></tr><tr><td>필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>GP 멸균 주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4 웰 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>167063</td><td>Nunclon Delta 처리 플레이트</td></tr><tr><td>겸자</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td> <td># 5 겸자</td></tr><tr><td>가위</td><td>FST Dumont</td><td>14060-10</td><td>미세 가위</td></tr><tr><td>메스</td><td>FST Dumont</td><td>10035-20</td><td>곡선 칼날</td></tr><tr><td>메스</td><td>FST by Dumont</td><td>10316-14</td><td>마이크로 나이프 메스</td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>Greiner</td><td>663102</td><td>&oslash; x h = 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>15 mL 폴리프로필렌 튜브</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>필터 종이</td><td>Watman</td><td>1001125</td><td>원형, 125 mm 지름</td></tr><tr><td>유리 챔버 슬라이드</td><td>Lab-Tek</td><td>154526</td><td>4 챔버</td></tr><tr><td>플라스미드 pCAGEN</td><td>Addgene</td><td>#11160</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions and mediums</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-15 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415056</td><td></td></tr><tr><td>L-15 매체, 적색 페놀이 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Conalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>아셀렌산나트륨</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>S5261</td><td></td></tr>, <tr><td>프로게스테론</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>P8783</td><td></td></tr>, <tr><td>폴리-DL-오르니틴</td><td>, 시그마-알드리치,</td><td>P8638</td><td></td></tr>, <tr><td>라미닌</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>L2020</td><td></td></tr>, <tr><td>트립신 2.5%, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse,</td><td>시그마-알드리치</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PBS(Ca Mg 제외</td>) <td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>뉴런 세포 배양 배지</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Neurobasal Plus 배지</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼 1 M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>밀도 gradiant 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep</td></tr><tr><td>보충제 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582801</td><td>B-27 Plus</td></tr><tr><td>말 혈청 열 비활성화</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immuno 형광</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS,</td><td>Mg</td><td></td><td>2+ Ca2+</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td> <td>없이 Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>콜린 아세틸 전이효소 (CHAT)</td><td>Chemicon</td><td>Ab144P</td><td></td></tr><tr><td>뉴로필라멘트 H 비인산화(SMI32)</td><td>Biolegends</td><td>SMI-32P</td><td>IF at 1/1000</td></tr><tr><td>Islet-1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td></td></tr><tr><td>Islet-2</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td></td></tr><tr><td>Hb9</td><td>DSHB</td><td>81.5C10</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 장착 매체</td><td>Vector Lab</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td><td>Biolegends</td><td>801201</td><td>IF at 1/1000</td></tr><tr><td>Lc3b</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#2775</td><td>IF at 1/200</td></tr></tbody></table>

마우스 기본 motoneurons transfecting으로 charcot marie이 질병에서 체 외에서 모델링

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

척추 motoneurons (MNs)의 Neurodegeneration 등 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, 척추 근육 위축, 근육 위축과 모두 관련 된 신경 성 질환의 큰 스펙트럼에 연루 이다. 척추 MNs의 기본 문화 같은 질병에 특정 한 유전자의 관련을 설명 하 고 그들의 변이의 세포 결과 특성화에 널리 사용 되어 왔습니다. 이 프로토콜 모델 기본 미네소타 문화 파생 헨 더 슨과 동료의 정액 일에서 20 년 이상 전에. 첫째, 우리는 마우스 배아에서 척수의 앞쪽 뿔을 해 부하 고 밀도 그라디언트를 사용 하 여 셀을 이웃에서 MNs를 분리 하는 방법 선발. 다음, 우리는 효율적으로 magnetofection를 사용 하 여 식 플라스 미드와 MNs를 transfecting의 새로운 방법을 제시. 마지막으로, 우리는 수정 하는 방법과 immunostain MNs. Charcot Marie이 질병 유형 2 원인 neurofilament 변이 사용 하 여,이 프로토콜 하 관심사의 단백질을 표현 하 고 있는 그들의 관련을 공부 질적 방법을 보여 주 설명 미네소타, 유지 보수, 성장과 생존입니다.

24 시간 후 문화에서, motoneurons (MNs) 이미 상당한 axonal 성장 (적어도 6 시간 이상 소마 크기)을 표시 합니다. 다음 일에 축 삭 성장 분기 (그림 2)를 표시 하 고 계속 해야 합니다. 하위 특이성으로 인해 다른 형태학을 있을 것입니다. 예를 들어 중간 열 MNs 축 근육을 자극 하는 자극 다리 근육18측면 모터 열 MNs 보다 짧고 더 분기 축 삭을 있다.
이러한 격리 및 위에서 설명한 자란 기술을 최근 neurofilament 유전자 CMT13의 상 염색체 지배적인 axonal 형태를 NEFH에에서 새로운 돌연변이 특성화 하기 위해 사용 되었습니다. 이 경우에, 도금, 후에 2 일 순화 된 MN...

이 기법의 목표는 murine 척수에서 기본 motoneurons (MNs)의 매우 풍부한 문화를 준비. 설명만 질병을 일으키는 돌연변이의 결과 평가 하려면 여기 이러한 격리 절연 MNs 및 그들의 transfection magnetofection에 의해.

마우스 기본 Motoneurons Transfecting으로 Charcot Marie이 질병에서 체 외에서 모델링

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

이 방법은 운동 신경 극성, 축축기 지도, 축축한 인신 매매 및 신경 퇴행성 메커니즘과 같은 신경 생물학의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 분 애정으로 우리의 녹다운 단백질을 표현하는 동안 고도로 농축 된 운동 신경 문화를 얻는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 실리콘으로 코딩 된 해부 미디어 접시에 하나의 배아를 놓습니다.현미경의 밑에, 집게로 실리콘에 대하여 복부로 태아를 붙들기. 두 번째 집게를 사용하여 로스트라드 척수의 중앙 운하에 팁 중 하나를 삽입합니다. 그런 다음 집게를 닫아 등조직을 약간 찢습니다.전체 척수가 열릴 때까지 코넬 측으로 이 수술을 반복합니다. 다음으로, 열린 척수가 실리콘에 대항할 수 있도록 배아를 배치합니다. 그 후, 몸에서 척수의 로스트라드 부분을 분리.척수의 로스트라드 부분을 꼬집어 머리에 배아를 당겨 척수를 추출합니다. 척수에 부착된 남은 수막과 DRG를 조심스럽게 꺼냅니다. 실리콘에 척수를 평평하게하고 메스를 사용하여 각 면의 중간을 따라 절단하여 코드의 등쪽 절반을 제거합니다.중간 부분을 10개로 자르고 새로운 튜브로 옮습니다. 척수 세포 현탁액을 준비하려면 튜브 바닥에 있는 척수 조각을 수집하십시오. HBSS를 Ham F-10 배지 의 1밀리리터로 대체하고 트립신 10마이크로리터를 추가합니다.37도에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 효소 소화를 막기 위해 조각을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고, 전체 L-15 배지 800마이크로리터, 4%BSA의 100마이크로리터, DNA 및 티타테산 100마이크로리터를 2회 나타낸다. 신선한 15 밀리리터 튜브에서 상체를 수집하기 전에 파편이 2 분 동안 정착하게하십시오.상체 튜브 의 바닥에 4 %BSA의 2 밀리리터를 부드럽게 추가합니다. 센트로는 470 x 중력으로 5분간 융합합니다. 5 분 후, 상체를 제거하고 완전한 L-15 배지의 2 밀리리터로 셀 팔레트를 다시 중단하십시오.모토뉴런 농축을 위해 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브 2개로 나눕힙시다. 그런 다음 각 튜브에 L-15 PH 배지 의 2 밀리리터를 추가합니다. 6개의 태아로 시작하는 경우에, 관 당 3개의 태아및 매체의 3개의 밀리리터의 동등한를 이용합니다.밀도 그라데이션 용액 2 밀리리터를 각 튜브의 바닥에 천천히 추가하여 선명한 인터페이스를 얻습니다. 다음으로, 센트로는 실온에서 15 분 동안 830 x 중력으로 융합합니다. 이 단계 후, 작은 세포는 튜브의 바닥에 있어야하는 반면, 모토뉴런과 같은 큰 세포는 밀도 그라데이션 용액/중간 인터페이스에 있어야 한다.아스페라에 1 ~ 2 인터페이스에서 세포의 밀리리터와 신선한 15 밀리 리터 튜브로 전송. L-15 PH 배지로 10밀리리터로 볼륨을 조정합니다. 그 후, 두 개의 튜브의 바닥에 4 %BSA 쿠션의 두 밀리리터를 추가합니다.그리고 센트로는 실온에서 5 분 동안 470 x 중력에서 융합됩니다. 5분 후, 상류체를 제거하고 팔레트와 완전한 L-15 배지 3밀리리터를 다시 중단합니다. 원심분리기를 470 x 중력에서 실온에서 5분간 반복합니다.그런 다음, 상체를 제거하고 셀 팔레트와 완전한 배양 배지의 2 밀리리터를 다시 중단한다. 운동 뉴런을 배양하기 위해, 24웰 플레이트에서 잘 배양 배지의 500 마이크로리터에 5, 000-10, 000 세포로 희석한다. 그런 다음 P-1, 000 파이펫 팁으로 라미네 솔루션을 제거합니다.배양 배지에서 희석된 모터 뉴런을 즉시 이송합니다. 건조를 피하기 위해 코딩 플레이트에. DNA를 준비하기 위하여는, 신경 배양 배지의 50의 마이크로리터에 있는 DNA의 1 마이크로그램을 다시 중단합니다.그리고 5 초 동안 소용돌이. B 튜브를 준비하려면, 뉴런 배양 배지의 50 마이크로 리터에서 구슬의 1.5 마이크로 리터를 다시 중단합니다. 50 마이크로리터의 비드 용액을 DNA 용액 50마이크로리터에 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.이 잠복기 동안, 전형될 우물에서 배양 배지의 100 마이크로리터를 철회한다. 그 후, DNA 비드 믹스의 100 마이크로리터를 각각 양으로 전달한다. 그리고 24 웰 플레이트, 37섭씨에서 자기 판에 20-30 분을 배양합니다.여기에 표시된 모뎀 뉴런 형태는 4 일간의 배양 후 내인성 비 인성 신경 필라멘트 무거운 사슬의 서서에 의해 밝혀지는 모뎀 뉴런 형태입니다. 이러한 이미지에서, 체외에서 4일 후 모뎀 뉴런 형태를 보여주고 둘째 날에 자기에 의해 EGFP 트랜스 유전자에 대한 형질전환. 모토 뉴런은 마커 SMI-32 또는 범신경 마커 TUJ-1로 반염색되었고 화살표는 뉴런의 소마를 나타낸다.이들은 자기 감염 모터 뉴런의 그들의 공초점 심상입니다, 야생 모형 또는 돌연변이 EGFP NEFH 구조물을 표현하고 그들의 자기 변색 마커 LC-3B를 위해 염색됩니다. 화살표는 또한 LC-3B 양성 돌연변이 EGFP NEFH 단백질 골재가 이 절차에 따라, 몬톨다 큐차는 축슨 인신 매매를 시각화하고 몇 가지 지침을 추가하기 위해 비디오 현미경 검사법에 의해 분석 될 수있다. 신경 생물학에 있는 근본적인 질문을 해결하기 위하여 그것의 초기 발달 후에, 이 기술은 또한 독성 충격 증후군 질병, 새뮤얼 트로피측 경화증, 또는 척추 근육 위축과 같은 motoneuron 무질서의 스펙트럼을 연루하는 물리 병리학 적인 기계장치를 탐구하는 강력한 공구인 것을 증명합니다.

modeling-charcot-marie-tooth-disease-vitro-transfecting-mouse-primary

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

교양 근육 세포 innervated 근육을 요점을 되풀이하는 불충 분한...

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다.

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하...

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

신경 유도의 측정 neurodegeneration의 마우스 모델을 평가 하는 유용한 도구 이지만 그것은 자주 hindlimbs에 좌 골 신경을 자극에 적용 됩니다. 여기, 복합 근육 활동 전위 (CMAP) vivo에서 상 완 신경 총에 의해 innervated 마우스 forelimb 근육에서 측정 하는 기술을 설명 합니다.

Vivo에서 모터 신경 퇴보의 마우스 모델에서 앞 발에서 복합 근육 활동 전위의 electrophysiological 측정

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 유도성 piggyBac 벡터에서 전사 인자의 발현에 의해 척추 또는 두개골 정체성을 가진 모터 뉴런으로 신속 하 고 효율적으로 전환 할 수 있습니다.

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

이 작품은 1 차적인 oculomotor, trochlear 및 척추 운동 뉴런의 동종 세포 배양을 산출하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 배양은 안구 및 척추 운동 뉴런의 형태학적, 세포적, 분자 적 및 전기 생리학적 특성의 비교 분석에 사용될 수 있다.

태아 기 이슬mn에서 Oculomotor, Trochlear 및 척추 모터 뉴런의 격리 및 문화 :GFP 형질전환 마우스

여기서 우리는 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 시험관 내 NMJs를 생성하는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 단일 우물에서 1 개월에 성숙한 형태와 기능을 가진 NMJs를 유도할 수 있다. 결과 NMJs 잠재적으로 관련 질병을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다., 병리학 메커니즘을 공부 하거나 치료에 대 한 약물 화합물을 검사.

인체 유발 만능 줄기 세포에서 유도 된 체외 신경 근육 정션

당사는 인간 원발성 메소포스트 유래 근투와 인간 유도만능 줄기 세포 유래 모터 뉴런을 공동 배양하여 상업적으로 이용 가능한 미세유체 장치에서 인간 모터 유닛을 생성하는 방법을 설명하며, 이로 인해 기능적으로 활성 신경 근육 접합이 형성된다.

미세 유체 장치에서 기능성 신경 근육 접합을 갖춘 인간 모터 유닛 생성

우리는 인간 공학 골격근 조직과 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 신경근 접합 기능을 특성화하기 위한 재현 가능하고 자동화되고 편향되지 않은 이미징 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결성의 기능적 정량화를 허용하고 신경 독소 및 중증 근무력증 환자 혈청으로 인한 감소 된 신경 근육 기능을 감지합니다.

인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화

전임상 테스트를 위해 일반적인 환자 돌연변이에 의해 유도되는 면역 능력이 있는 자가종양 모델을 활용하는 것은 면역 치료 테스트에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 일반적인 환자 돌연변이를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용하여 뇌종양 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명하므로 정확하고 재현 가능하며 일관된 마우스 모델을 제공합니다.

Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures(환자 돌연변이 시그니처를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용한 생체 내 뇌종양 모델링)

배우세요 마우스 척수에서 기본 운동신경원을 분리하고 마그네토펙션으로 형질전환하는 방법을. 밀도 구배 원심분리로 세포를 정제하고 신경퇴행성 질환의 병리 기전을 연구할 수 있습니다.

마우스 기본 Motoneurons Transfecting으로 Charcot Marie이 질병에서 체 외에서 모델링

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