Name: 만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 배우세요 만능 줄기 세포에서 간세포 유사 세포를 반자동으로 대량 생산하는 방법을. 96웰 플레이트 형식으로 빠르고 재현성 있게 세포를 분화시켜 질병 모델링과 약물 스크리닝에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 주요한 과학자의 사무실 (TCS/16/37)와 MRC 박사 장학금에서 상을 지원 했다.

1. 시드 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에 96 잘 접시에 Hepatocyte 차별화
참고: 시 약 및 장비가이 프로토콜에 사용 된 표 1에 나열 되었습니다. 이 실험에 사용 된 미디어는 살 균과 세포 배양에 대 한 실 온에서 수 있어야 합니다. 프로토콜의이 부분에 설명 된 모든 시 약/솔루션 볼륨 기반으로 96 잘 접시의 단일 잘 명시 하지 않으면 합니다.
<ol><li>
준비 laminin 코팅 96 잘 접시.
	<ol>
<li>재조합 laminin 521 (100 µ g/mL)의 작은 유리병을 녹여 (LN-521) 4 ° c.에서 하룻밤에 2 h에 대 한</li>
		<li>Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) (Ca2 +/Mg와2 +) x 얼음 1에 LN-521를 diluting 하 여 5 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>카세트를 분배 하는 표준 튜브 디스펜서를 처리 하는 자동 액체를 사용 하 여 50 µ L 당 96 잘 접시의 LN-521 솔루션의 추가. 참고: 모든 볼륨 dispenses 표준 튜브를 별도로 지정 하지 않는 한 카세트를 분배는 자동 액체 처리 디스펜서와 함께 수행 됩니다. 프라임 솔루션, 카세트의 분배 끝에 도달할 때까지 다음 진행 하는 걸. 여러 96 잘 접시 필요에 따라 여러 번 절차를 반복 하 여 동일한 실험에서 준비 될 수 있습니다.</li>
		<li>37 °C/5% CO2 2 ~ 4 h LN521 코팅 접시를 품 어. 참고: LN521 코팅 접시 저장 될 수 있다 4 ° c.에 2 주를 격판덮개 증발 및 오염 방지 하기 위해 평평한 표면에 밀봉을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 시간 30 분 동안 37 ° C에 미리 코팅된 접시의 필요한 숫자를 따뜻한.</li>
	<li>8 채널 포부 어댑터를 사용 하 여 코팅된 표면의 나머지 LN-521 솔루션 발음 참고: 그것은 코팅 저하를 방지 하는 코팅 표면 어떤 접촉을 피하기 위해 중요 한입니다.</li>
	<li>즉시 보충 10 µ M로 관련 된 키 (바위) 억제 물 Y27632 mTeSR1 매체의 당 50 µ L을 추가 하 고 셀 37 °C/5% CO2시드까지 인큐베이터에 접시를 유지. 참고: 건조 laminin 코팅 우물을 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>
3 x 105 셀/ml mTeSR1 매체 10 µ M 바위 억제제 Y27632 보충에 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 참고: 각 셀 라인에 대 한 시드 밀도 최적화가 필요 합니다.<ol>
<li>매체를 발음 hPSCs에 약 75% ~ 85%의 undifferentiated 문화 배양 접시에서 LN-521에 경작 하는 confluency 앞12에서 설명한. 참고: hPSCs 교양 LN-521에 mTSER1에 모든 24 h 변경 하 고 정기적으로 셀 앞에서 설명한12confluency의 80%에 도달 되 면 passaged 매체.</li>
		<li>실내 온도 1의 5 mL로 세포 세척 (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) x DPBS 및 aspirate 버퍼.</li>
		<li>셀에 부드러운 세포 분리 시 약 x 1의 5 mL을 추가 하 고 셀 분리에 대 한 6 ~ 8 분 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 반응을 중지, 검사 현미경 행렬에서 셀의 분리. 셀 접시에서 부분적으로 분리 해야 합니다. 그렇지 않은 경우에 추가로 1 ~ 2 분에 대 한 보육을 확장.</li>
		<li>부드러운 세포 분리 시 발음 하 여 반응을 종료 하 고 10 µ M 바위 억제제 Y27632 세포를 보충 하는 신선한 mTeSR1 매체의 5 mL를 추가 합니다. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 매트릭스를 섞어 여러 번 P1000 팁을 사용 하 여 위아래로 피 펫 셀 리프트.</li>
		<li>Trypan 블루 제외 방법 얼룩에 따라 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀 고 필요한 농도와 세포 현 탁 액을 준비.</li>
		<li>살 균 15 mL 또는 50 mL 원심 분리기 튜브로 셀의 원하는 번호를 플라스틱 하 고 실 온에서 5 분 동안 115 x g 에서 centrifuging 의해 셀 아래로 회전. 참고: 한 96 잘 접시 3 x 105 셀/mL를 포함 하는 mTeSR1 매체의 5 mL는 H9 셀 줄 필요 합니다.</li>
		<li>상쾌한 발음 하 고 동종 솔루션 mTeSR1 매체 10 µ M 바위 억제제 Y27632 보충에 37 ° C에서 얻을 때까지 부드럽게 셀 펠 릿을 resuspend. 참고: 바위 억제제의 사용은 권장 세포 생존 게시물 다시 도금 향상 시킵니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 µ M 바위 억제제 Y27632와 mTeSR1의 50 µ L을 포함 하는 96 잘 접시에 세포 현 탁 액의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>시드, 후 37 °C/5% CO2 연결할 셀 수 있도록 24 h에 대 한 셀 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>다음 날 셀을 검토 하 고 설정 된 셀에 셀 접촉 후 록 억제제를 철회. 40 %confluency 차별화 매체 (그림 1B)으로 전환 합니다. 참고: 셀 confluency 40% 보다 높은 경우, 플레이트 사용은 H9 셀 라인 HLC 차별화에 적합 합니다.</li>
</ol>2. 차별화 96 잘 접시에 재조합 Laminins Hepatocyte 같은 셀에 hPSCs
<ol><li>
매체 및 성장 요인 분화를 준비 합니다.
	<ol>
<li>살 균 0.2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 있는 인간 Activin A 분말을 용 해 하 여 인간의 Activin A 재고 솔루션 (100 µ g/mL)를 준비 합니다. 약 주식 수와-20 ° c.에 게 1:1, 000에서 사용 합니다.</li>
		<li>살 균 0.2 %BSA 마우스 Wnt3a 분말을 용 해 하 여 마우스 Wnt3a 재고 솔루션 (10 µ g/mL)를 준비 합니다. 약 주식 수와-20 ° c.에 게 1: 200에서 사용 합니다.</li>
		<li>살 균 0.2 %BSA 인간 HGF 분말을 용 해 하 여 인간의 hepatocyte 성장 인자 (HGF) 재고 솔루션 (10 µ g/mL)를 준비 합니다. 약 주식 수와-20 ° c.에 게 1:1000에서 사용 합니다.</li>
		<li>살 균 0.2 %BSA 분말을 용 해 하 여 Oncostatin M (OSM) 재고 솔루션 (20 µ g/mL)를 준비 합니다. 약 주식 수와-20 ° c.에 게 1:1, 000에서 사용 합니다.</li>
		<li>확실 한 endoderm: endoderm 차별화 매체, 1% 페니실린/스 2 %B27 보충 (50 x, 인슐린 없이), 구성 된 준비 (최종 농도: 100 IU/mL와 100 µ g/mL, 각각) 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (추가 RPMI 1640) 기저 매체. 4 ° C에서 저장 하 고 2 주 이내에 사용. 각 중간 변경 시 보충 필요한 볼륨 Activin A와 Wnt3a 100 ng/mL 및 50 ng/mL의 최종 농도에서 각각.</li>
		<li>Hepatoblast 차별화: 20% 녹아웃 혈 청 교체 (KSR), 0.5% 대체 보충 L-글루타민, 1% 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 0.1 m m 베타-mercaptoethanol, 1 %DMSO, 및 1%로 구성 된 hepatoblast 차별화 매체 준비 페니실린/스 (최종 농도 100 IU/mL와 100 µ g/mL, 각각) 녹아웃 DMEM (코-DMEM)에 추가. 진공에서 필터 및 4 ° c.에 저장 2 주 이내에 사용 합니다.</li>
		<li>Hepatocyte 차별화: hepatocyte 차별화 매체, 대안 1% 페니실린/스 10 µ M 날린 21 hemisuccinate 나트륨 소금 (HCC), L-글루타민을 보충 하는 1%로 구성 된 준비 (100 IU/mL에서 최종 농도 및 100 µ g/mL, 각각) HepatoZYME 매체에 추가. 4 ° C에서 주식을 저장 하 고 2 주 이내에 사용. 각 매체 변화에 대 한 보충 HGF와 OSM 필요한 볼륨 (최종 농도 10 ng/mL와 20 ng/mL, 각각).</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 시간 게시물 시드, 신중 하 게 자동 휴대용 전자 채널 피 펫 시스템을 사용 하 여 매체를 제거 하 고 신선한 endoderm 못쓰게 매체 100 ng/mL Activin A와 50 ng/mL Wnt3a 보충의 100 µ L를 추가. 참고: 차별화 과정 개시 최종 endoderm 매체 추가 되었습니다. 일단 셀 시드 최적화 된 세포 분화는 일반적으로 24 시간 이내 시작 됩니다. 하지 않는 한 변경 자동 휴대용 전자 채널 피 펫 시스템과 매체를 제거 하 고 신선한 매체는 자동 액체 처리 디스펜서를 사용 하 여 표준의 100 µ L를 분배 하 여 수행 하는 모든 매체 분배 카세트 관 달리 지정합니다. 자동 휴대용 전자 채널 피 펫 시스템 96 300 µ L 팁을 사용 하 여 잘 머리와 함께 사용 되었다. 간단 하 게, 잘 피하는 세포로, 어떤 접촉 든 지에서 90 µ L 발음 했다 그리고 세포 스트레스를 줄이기 위해 중간 변경 하는 동안 셀을 건조 하지 하는 것이 중요 하다.</li>
	<li>인간 배아 줄기 세포 (hESCs), 3 일 동안 매일 endoderm 차별화 매체 변경. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에 대 한 차별화를 수행 하는 경우만 Activin A를 사용 하 여 2 추가 일에 대 한 확실 한 endoderm 무대를 확장 합니다.</li>
	<li>결정적인 endoderm 유도 후 전환 hepatoblast 사양, KSR/DMSO 매체 하 고 매체를 5 일 동안 매 2 일 변경. 참고: 연결 되지 않은 셀에는 잘 수 있다면 다음 중간 변경 하기 전에 한 번 세포를 씻어 비 보충 코 DMEM을 사용 합니다. 프로토콜 (5 일)의 2 단계 기간 때문 hepatoblast 규격의 마지막 날에 마지막 하나 3 중간 변경 될 것입니다.</li>
	<li>Hepatoblast 차별화에 따라 hepatocyte 성숙에 대 한 HepatoZYME 매체를 전환 합니다. KSR/DMSO 매체를 제거한 후 보충 없이 HepatoZYME 한번 셀을 세척 하 고 100 µ L HepatoZYME 성숙 매체 10 ng/mL HGF와 20 ng/mL OSM 보충의 추가.</li>
	<li>7 ~ 10 일 동안 모든 48 h 매체를 변경 합니다. 차별화의 하루 18, 유전자 발현 및 CYP P450 대사 활동을 분석 하 여 HLCs 특징.</li>
</ol>3. 특성화 Hepatocyte의 세포 분화에 재조합 Laminins
<ol><li>Hepatocyte 특정 마커 및 분극 마커 immunostaining를 사용 하 여 식을 검색.</li>
	<li>Hepatocyte 대사 기능12전에 설명한 대로 P450 CYP 분석 실험을 사용 하 여 테스트 합니다.</li>
	<li>접시 당 잘 당 세포의 총 수를 세 접시 변화를 확인 합니다.</li>
</ol>4. 높은 처리량 Immunocytochemistry 및 이미지 수집
<ol><li>차별화의 18 일에 세 번 1 x DPBS와 함께 우물을 세척 하 고는 HLCs 4 %paraformaldehyde (PFA)의 분배 50 µ L에 의해 수정 15 ~ 30 분 동안 실 온에서 품 어. 고정, 후 PBST로 세 번 세척 (0.1% 트윈) (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) 자동 접시 세탁기를 사용 하 여. 참고:이 섹션에서 모든 세척 별도로 지정 하지 않는 한 자동 접시 세탁기를 사용 하 여 수행 됩니다. 모든 세척 같은 프로토콜에 따라 수행 됩니다.</li>
	<li>(없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) PBST의 분배 100 µ L에 의해 막 permeabilize 고 실 온에서 20 분 동안 품 어. 다음, PBST에서 10 %BSA 분배 100 µ L에 의해 차단 하는 단백질을 수행 하 고 판 통을 사용 하 여 부드러운 떨고에 1 시간에 대 한 품 어. 단백질 차단 후 1 차 항 체를 포함 하는 PBST에서 1 %BSA 50 µ L를 추가, 판 통을 사용 하 여 부드러운 떨고와 하룻밤 4 ° C에서 품 어. 참고: 단백질 및 항 체 또한 사이 씻지 않는.</li>
	<li>24 시간 후 (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) 1 x DPBS로 세 번 세척 하 고 PBST에 1 %BSA 분배 50 µ L에 의해 이차 항 체를 추가 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 1 h를 품 어.</li>
	<li>이차 항 체 부 화 후 1 x DPBS 3 번 씻어. DAPI와 DPBS의 50 µ L 추가 (10 µ g/mL)와 어둠 속에서 실 온에서 5-10 분 동안 품 어.</li>
	<li>마지막으로, DPBS로 3 번 세척 하 고 잘에서 1 x DPBS의 100 µ L를 떠나. 플레이트는 이미징에 대 한 준비가 되었습니다. 참고: 접시 저장 되어야 한다 어둠 속에서 4 ° C에서 영상까지.</li>
	<li>이 콘텐츠 이미징 시스템을 사용 하 여 접시를 이미지 하 고 우물의 좋은 표시를 잘 걸쳐 여러 필드를 확보. 콜럼버스 소프트웨어 (이 콘텐츠 이미징 분석 시스템 소프트웨어)를 사용 하 여 다른 표식은 HLCs에의 식을 계량. 참고: 콜럼버스는 세포 형질에 대 한 셀 세분화 분석을 제공 하는 높은 콘텐츠 분석 소프트웨어. CellProfiler, 생물학 이미지22의 정량 분석을 위한 오픈-소스 소프트웨어를 사용 하 여 비슷한 결과 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

교수 데이비드 C. 건초 공동 설립자 및 Stemnovate 제한의 감독 이다.
교수 데이비드 C. 건초 HigherSteaks 제한의 지도자 이다.

우리의 반자동된 절차는, 신뢰할 수 있는 효율적이 고 경제적인 규모 (그림 1)에서 HLCs의 생산을 허용 합니다. 하이 플랫폼 세포 기반 스크리닝 (그림 2)에 대 한 적절 한 접근 격판덮개 우물 사이 셀 수 상당한 차이 없었다. 또한, 반 자동화 워크플로우는 수동 프로세스5,12를 사용 하기 전에 가능 하지 않았다 많은 접시 한 번에 생산 사용자 수 있습니다.
중요 한 것은, 자동화 프로세스 HNF4α을 표현 하는 세포의 대다수와 차별화 수익률에 영향 하지 않았다 (89.2% ± 2) 및 ALB (92.8% ± 6) (그림 3). 또한 HLCs CYP P450 효소 CYP2D6 그리고 CYP3A4 표현 하 고 CYP1A2, CYP3A 신진 대사 활동 이전 보고 실험 (그림 3)5에 비해 표시. 프로토콜의 표준화에도 불구 하 고 분화 하기 전에 셀 confluency은 순수 HLC 차별화 중요 합니다. 따라서, 중요 한 고려 사항 (그림 1)은 잘 걸쳐 좋은 셀 배포를 보장. 이 종속 셀 라인 것을 입증 했다, 따라서 셀 시드 및 밀도 최적화 각 셀 라인 이전 확장에 대 한 필요 합니다.
그것의 현재 모양에서이 플랫폼은 임상 응용 프로그램에 대 한 HLCs의 대량 생산에 적합 하지 않습니다 그리고이 대부분 셀 공장 및 생물 반응 기의 사용을 통해 달성 될 것입니다. 그러나, 개발 방법론에서는 질병 모델링, 마약 검사 및 약물 연구를 재사용에 대 한 인간의 간 세포의 급속 한 세대 수 있습니다. 또한, 분석 결과 멀티플렉싱, 의무가 기계 분석에 대 한 multiparametric 데이터 집합 생성을 허용. 앞으로 고, 우리 또한이 기술을 좀 더 복잡 한 생체 외에서 시스템에 3D 차별화 또는 HLC 형에서 생체 외에서개선 하기 위해 플랫폼으로 적용 될 수 믿습니다.
결론적으로, 우리는 믿습니다 우리의 간단 하 고 반자동 시스템 실험 처리량을 증가 하 고 실험 편차를 줄이기 위해 생물 학적 데이터 세트와 인간의 생리 쪽으로 그들의 추정의 품질 향상.

기본 인간 hepatocytes (PHHs) 간 생물 의학 연구에 대 한 현재 표준을 나타냅니다. 그들의 장점에도 불구 하 고 PHHs는 불안정 형1성숙 hepatocytes의 제한 된 소스를 나타냅니다. 인간 배아 줄기 세포 (ESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 제안 되었습니다 강력한 자원으로 서 생물 의학 연구, 약속의 간2,3,4 포함 하 여, 인간의 조직 재생 소스에 대 한 . 현재 hepatocyte 차별화 프로시저 생성 hepatocyte 마커, 유전자 및 PHHs3,,45,6,7, 유사한 기능을 표현 하는 셀 8,9,,1011. 더 최근에, 정의 된 재료 및 재조합 laminins 같은 행렬을 사용 하 여 향상 된 세포 표현 형 및 재현성 실험5,12,,1314있다.
전통적인 셀 문화 기술 의존 무 겁 게 수동 pipetting에 시간이 소모 및 오류가 발생 하기 쉬우며. 이 분석 결과 하나 작업할 수 있는 플레이트 포맷의 처리량을 제한 합니다. 날짜 하려면, 대부분 연구 HLCs의 생성을 설명 하는 노동 집약적인 자연과 크기15,,1617에 따라서 작은 규모에.
현재 액체 취급에서을 pipetting 시스템, 자동화 된 현미경 검사 법 및 실험실 해석기와 함께 만든 그것은 인간의 개입에 대 한 요구를 최소화 하는 절차를 개발할 수 합니다. 우리가 이러한 기술의 이용 및 많은 양의 기본에 대 한 인간의 간 조직 생성 하는 반자동된 차별화 시스템 개발 고 생물 의학 연구를 적용. 이 이렇게 인간의 ESC와 iPSC 라인 사소한 조정 셀 라인에 따라 필요한 수행할 수 있습니다. 이 시스템을 결합 하 여 높은 콘텐츠 분석, 적은 시간과 규모18,,1920,21에서 HLC 형질 수 설명 합니다.
요약, 여기에 설명 된 세포 문화 기술의 자동화 신뢰성, 실험 시간 관리 및 분석 결과 처리량 개선으로 이끌어 냈다.

<table><tbody><tr><td>405 LS Washer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 칼슘 및 마그네슘</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>14040133</tr><tr><td>부드러운 세포 해리 시약</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td> <td>17705021</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>용 GripTips<tr><td>인간 간세포 성장 인자</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>인간 종양-스타틴 M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 라미닌 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손 21-헤미소신산 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 혈청 교체</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 매체</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi 시약 디스펜서</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Operetta High-Content Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>생명 과학</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 Wnt3a</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>표준 튜브 디스펜싱 카세트</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 전자 96채널 피펫</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 4%, 완충, pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496&nbsp; EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 분석 및 스크리닝 시스템</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 분석 및 스크리닝 시스템</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (마우스)</td></tr><tr><td>알파태아단백</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (마우스)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>던디대학교</td><td></td><td>1:200 (양)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>던디대학교</td><td>던디대학교</td><td>1:200 (양)</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (토끼)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (마우스)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (2차 항체)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-sheep 488 (2차 항체)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 (2차 항체)</td><td>생명 과학 기술</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 hepatocyte의 반자동된 생산

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

인간의 pluripotent 줄기 세포는 인간 조직의 재생 소스를 나타냅니다. 우리의 연구는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 인간의 간 조직 생성에 집중 하 고 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc). 현재 차별화 절차 생성 인간의 hepatocyte 같은 셀 (HLCs) 태아 및 성인 특성의 혼합을 표시 합니다. 세포 표현 형을 개선 하기 위해, 우리는 완전히 정의 우리의 차별화 절차 및 셀 틈새 향상 된 유전자 발현 및 기능을 표시 하는 세포 인구의 세대의 결과로. 이러한 연구 진행 상황 표시, 하는 동안 능력 심사에 대 한 멀티 잘 플레이트의 대량 생성을 노동 집약적인 절차와 일괄 배치에 의해 제한 되었습니다 했다. 이 문제를 해결 하기 위해 우리는 HLCs 줄기 세포 시드로 만능 줄기 세포를 분화 하는 반 자동화 플랫폼을 개발 하 고 차별화 96 잘 접시 형태로 액체 처리 및 자동 pipetting 시스템을 사용 하 여 수행 했다. 차별화, 다음 셀 형 자동화 된 현미경 검사 법 및 멀티 잘 루미 노 사용 하 여 분석 했다.

세포 분화 된 배아 줄기 세포 라인 (H9)를 사용 하 여 수행 되었다. 반자동된 플랫폼 차별화 하 고 세포 (그림 1A) 특성 사용 되었다. 자동 액체 처리 디스펜서 매트릭스 코트 단일 세포 씨앗을 사용 되었다. 세포질 감 별 법 세포에 도달 40 %confluency (0 일) 때 시작 되었다. 미디어 변화는 매체 및 매체 추가 (그림 1A)의 액체 처리 디스펜서를 제거 하는 자동 휴대용 전자 채널 피 펫 시스템을 사용 하 여 수행 되었습니다. 셀 고정 하 고 얼룩은 자동 액체 처리 디스펜서를 사용 하 여 자동 접시 세탁기와 함께에서 하는 것을 수행 했다. 이미징 및 정량화 높은 콘텐츠 이미징 시스템 및 콜럼버스 소프트웨어를 사용 하 여 수행 했다. 시 토 크롬 P450 활동 설립된 분석 결과 사용 하 여 측정 했다. 기판 부 화, 다음 셀 supernatants 수확 했다, 그리고 생물 발광 다중 모드 microplate 리더 (그림 1A)를 사용 하 여 기록. 또한, 기존의 단계 대조 현미경 검사 법 hepatocyte 차별화 (그림 1B) 동안 셀 형태학에 있는 변화를 측정 하기 위해 사용 되었다.
하루 18에 우물 사이 셀 수 있는 가변성 DAPI 얼룩 (그림 2A)에 따라 시험 되었다. 7 시야는 핵 계량 (그림 2A)의 수와 잘 당 점령 했다. 우리는 41,662 ± 3, 평균 우물 우물 (그림 2B) 당 366 셀 간에 통계 차이가 발견.
18 일에 HLCs 전형적인 hepatocyte 표식 (그림 3A-G)에 대 한 스테인드 및 CYP P450 활동에 대 한 테스트 고정 했다. HLCs 표현 HNF4α 같은 hepatocyte 마커 (89.2% ± 2 양수 세포), ALB (92.8% ± 6 긍정적인 세포), AFP (61.8% ± 2 양수 세포). 또한 HLCs CYP P450 단백질, CYP2D6 그리고 CYP3A4 표현 하 고 E Cadherin 단백질 식으로 같이 뚜렷한 다각형 모양을 표시. HLCs P450 CYP 활동 하루 18에서 측정 했다. HLCs 295,906 편각, 단백질의 828 RLU/mL/mg와 1,066,112 ±177, 416 RLU/mL/mg의 단백질 (그림 3 H)에서 CYP3A CYP1A2 활동 전시.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> 그림 1: 96에 Psc에서 Hepatocyte 차별을 잘 포맷. 반 자동화 세포질 감 별 법, 고정, 얼룩, 이미징 및 기능 활동 하는 데 사용 하는 장비 (A). 도표. (B). 대표 HLC 차별화 동안 세포 형태학 변화. 간단히, Psc는 최종 endoderm, hepatoblast 규격 취득 다각형 모양 세포와 조약돌 모양의 형태를 표시 하는 세포 그리고 hepatocyte 성숙 이전 특징 다음으로 끝났다. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> 그림 2: HLCs 잘-투-잘 가변성의 평가. (A) 대표는 96 잘 접시 HLCs DAPI 스테인드의 보기. 눈금 막대 = 1 m m. (B) 잘 당 휴대폰 번호의 정량화. 잘 하 고 콜럼버스 소프트웨어를 사용 하 여 정량 뷰 7 분야에서 (아래), 행과 열 (위)에 우물 당 휴대폰 번호의 평균. 접시에 걸쳐 평균 휴대폰 번호 잘 당 41,662 ± 3,366 sem의 셀입니다. 웰 스 사이 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 되었다. Tukey의 게시물-특별 통계적 테스트와 단방향 ANOVA 고용 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> 그림 3: Hepatocyte 마커 표현과 P450 CYP 활동 측정 HLCs에서 하루 18. Hepatocyte 핵 요인 4 알파 비율 (A) (HNF4α) 식 ± SEM 잘 당 10 볼 필드 30 우물에 기반. (B) SEM, + 알 부 민 (장백의) 식의 비율 잘 당 10 시야와 3 별도 우물에 기반. (C) SEM + alpha fetoprotein (AFP)의 비율 잘 당 10 시야와 3 별도 우물에 기반. (D) 전자 cadherin 얼룩. (E) CYP2D6 얼룩입니다. (F) CYP3A4 얼룩입니다. (G). 면역 글로불린 G (IgG) 컨트롤을 얼룩. 눈금 막대 하루 18에서 50 µ m. (H) CYP P450 1A2 및 3A 대사 활동 HLCs에서 =. 6 생물 SEM. 활동 + 복제 데이터 나타내는 단백질의 1 밀리 그램 당 상대 빛 단위 (RLUs) /mL으로 인용 된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜에는 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시 형태로 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 반자동된 접근 방식을 설명 합니다. 이 프로세스는 신속 하 고 비용 효율적인, 품질의 생산 기초 및 응용 연구를 인간의 hepatocyte 같은 셀 배치를 안심 수 있도록 합니다.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

이 방법은 반자동 플랫폼을 사용하여 96웰 형식으로 재현성이 높은 간세포 유사 세포를 생성합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 빠르고 비용 효율적이며 변동이 적고 간세포와 같은 세포의 96웰 플레이트를 대량 생산할 수 있다는 것입니다. 해동된 라미닌 521의 밀리리터당 5마이크로그램 용액을 둘베코의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS를 칼슘 마그네슘과 함께 얼음처럼 차갑게 한 번에 희석하여 준비합니다.표준 튜브 디스펜싱 카세트가 있는 자동 액체 취급 디스펜서를 사용하여 96웰 플레이트의 웰당 50마이크로리터의 라미닌 521 용액을 추가합니다. laminin 521 코팅된 플레이트를 배양합니다. 배양 후 8채널 흡인 어댑터를 사용하여 코팅된 표면에서 laminin 521 용액을 흡입하고 코팅된 표면과의 접촉을 피합니다.10마이크로몰의 Rho-associated kinase 또는 ROCK inhibitor Y27632가 보충된 mTeSR1 배지 웰당 50마이크로리터를 즉시 추가합니다. 세포가 섭씨 37도, CO2 5%에서 파종될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 보관합니다. 10 마이크로몰 ROCK 억제제 Y27632가 보충된 mTeSR1 배지의 3배 10 세포 현탁액에서 밀리리터당 5번째 세포까지.50마이크로리터의 세포 현탁액을 플레이트에 추가합니다. 파종 후 플레이트를 섭씨 37도, 5%CO2에서 24시간 동안 세포 배양기로 되돌려 세포가 부착될 수 있도록 합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼낸 후 다음날 플레이트를 검사하고 세포 간 접촉이 이루어졌고 포화도가 40%에 도달했는지 확인한 다음 분화 배지로 전환합니다.세포 포화도는 분화의 시작을 호소합니다. 세포와 같은 간세포의 좋은 품질을 달성하는 것이 중요합니다. 분화의 시작, 일단 포화도가 40%에 도달하면, 포화도가 더 높으면, 플레이트는 분화에 적합하지 않습니다.파종 후 24시간이 지나면 자동 휴대용 전자 채널 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 제거합니다. 그리고 100 밀리리터 activin A당 100 나노그램과 Wnt3a 밀리리터 당 50 나노그램이 보충된 100 마이크로리터의 새로운 내배엽 프라이밍 배지를 추가합니다. 최종 내배엽 유도 후 간아세포 사양을 위해 KSR DMSO 배지로 전환합니다.그리고 5일 동안 2일마다 매체를 교체하십시오. 간세포세포 분화 후, KSR DMSO 배지를 제거하고 보충제 없이 HepatoZYME 배지로 세포를 한 번 세척합니다. 세척 후, 100 μm의 HepatoZYME 성숙 배지 100 밀리리터 간세포 성장 인자와 밀리리터 20 나노 그램 Oncostatin M.Change가 보충 된 HepatoZYME 성숙 배지 100 마이크로 리터를 7-10 일 동안 48 시간마다 배지를 교체합니다.분화 18일째에 세포를 고정하고 액체 처리 및 자동 플레이트 세척기를 사용하여 면역세포화학을 수행합니다. 이미징할 때까지 암흑 속에서 플레이트를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이미징 및 정량화를 따릅니다.18일째에는 DAPI 염색 후 웰 간의 변동성과 세포 수를 조사했습니다. 웰당 7개의 시야를 포착하고 핵의 수를 정량화한 후 통계적 차이는 확인되지 않았습니다. 18일째에 세포 또는 HLC와 같은 인간 간세포를 염색한 결과 간세포 마커 HNF4 알파, 알부민 및 AFP의 발현이 나타났습니다.HLC는 또한 CYP P450 단백질, CYP2D6 및 CYP3A4를 발현하여 CYP P450 대사 활성을 보였습니다. HLC는 또한 E-cadherin에 의해 보여진 뚜렷한 다각형 모양을 보여주었습니다. 이 프로토콜의 표준화에도 불구하고, 분화 전의 세포 밀밀도는 HRC 분화에 매우 중요합니다.우리는 세포 독립적이라고 봅니다. 따라서 각 세포주에 대해 판매 시딩과 밀도 최적화가 필요합니다. 이 방법론을 완전히 익히면 질병 모델링, 약물 스크리닝 또는 약물 제안 연구를 위해 인간 간 세포의 여러 플레이트를 빠르게 생성할 수 있습니다.이 시스템을 사용하면 간세포 생물학에 대한 기계론적 분석을 위한 다중 매개변수 데이터 세트를 생성할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.

간 질환 연구를 위한 말초 혈액의 인간 간 스페로이드

이 프로토콜은 빠르고 재현 가능한 내배엽 간 오가노이드(eHEPO)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 eHEPO를 2주 이내에 생산할 수 있으며 차별화와 기능을 잃지 않고 장기(1년 이상)로 확장할 수 있습니다.

기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

만능 줄기 세포에서 유래한 간세포는 미토콘드리아 및 활성 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM, CD166이라고도 함) 염색을 사용하여 세포 분류를 통해 정제할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용

사용 가능한 만능줄기세포(PSC)-기능성 세포 분화 시스템은 현재 심각한 line-to-line 및 batch-to-batch 변동성 문제로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 심장 분화를 주요 예로 사용하여 이미지 기반 기계 학습을 기반으로 PSC 분화 과정을 지능적으로 모니터링하고 조절하는 프로토콜을 제시합니다.

만능줄기세포 분화를 모니터링하기 위한 살아있는 세포 이미지 기반 기계 학습 전략

배우세요 만능 줄기 세포에서 간세포 유사 세포를 반자동으로 대량 생산하는 방법을. 96웰 플레이트 형식으로 빠르고 재현성 있게 세포를 분화시켜 질병 모델링과 약물 스크리닝에 활용할 수 있습니다.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

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