전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

이 방법은 치료 내성 후 신호 전달 네트워크의 변화를 평가하기 위해 암 분야와 같이 인산화 신호가 관심 있는 모든 연구 분야에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수천 개의 인산펩타이드를 비교적 간단하고 저렴한 방법으로 식별하여 인산단백질체를 전역적으로 평가할 수 있다는 것입니다. 종양 조직을 채취하려면 종양의 무게를 측정하고 배양 시험관에 조직 100mg당 2ml의 얼음 저온 용해 완충액을 추가합니다.

그런 다음 휴대용 또는 벤치 탑 균질화기를 사용하여 용해물을 균질화합니다. 샘플을 줄이고 알코올화하려면 튜브를 섭씨 95도에서 5분 동안 가열한 다음 샘플을 얼음에서 15분 동안 냉각합니다. 얼음 위에서 용해물을 세 번 초음파 처리 한 다음 샘플을 섭씨 95도에서 5 분 동안 가열합니다.

초음파 처리 튜브를 스윙 버킷 로터에 넣고 3, 500g 및 섭씨 15도에서 15 분 동안 용해물을 원심 분리 한 다음 상등액을 수집하고 펠릿을 버립니다. 용해물을 분해하려면 100밀리몰 트리스를 사용하여 샘플을 12배 희석하여 구아니디늄의 양을 줄입니다. 단백질 5mg의 경우 10마이크로그램의 리실 엔도펩티다아제 또는 lys-C를 첨가하고 실온에서 5-6시간 동안 샘플을 배양합니다.

20 밀리몰의 염화칼슘과 트립신을 1:100 트립신 대 단백질 비율로 첨가한 1밀리몰 HCL에 TPCK 처리된 트립신을 1밀리리터당 1밀리그램씩 준비합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브에 트립신 분취액을 추가로 추가하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 샘플을 배양합니다.

샘플을 15 밀리리터 10 킬로달톤 차단 필터에 추가합니다. 잔류물 부피가 250마이크로리터 미만이 될 때까지 섭씨 3, 500g 및 15도의 스윙 버킷 또는 고정각 로터에서 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음 흐름을 수집하고 잔류물을 버립니다.

샘플을 산성화하려면 약 20마이크로리터의 5% 트리플루오로아세트산 또는 용해물 1밀리리터당 TFA를 첨가합니다. 튜브를 잘 섞고 pH 스트립을 사용하여 pH를 측정합니다. 필요한 경우 5%TFA를 추가하여 pH를 2.5로 조정합니다.

다음으로, C18 컬럼의 짧은 쪽 끝을 진공 매니폴드에 연결합니다. 진공을 17에서 34킬로파스칼 사이로 설정한 후 100% 아세토니트릴 3밀리리터와 유리 피펫을 사용하여 컬럼을 적십니다. 유리 피펫을 사용하고 0.1%TFA의 3밀리리터 분취량 2개를 적용하여 컬럼을 평형화합니다.

그런 다음 산성화된 샘플을 컬럼에 로드합니다. 3mL 용량의 0.1 TFA를 3회 사용하여 컬럼을 세척합니다. 그런 다음 2밀리리터의 40%ACN 0.1%TFA를 도포하여 샘플을 용리시키고 2밀리리터 분획 2개를 유리 배양 튜브에 수집합니다.

파라필름으로 용리액 튜브를 덮고 20게이지 바늘을 사용하여 덮개에 3-5개의 구멍을 뚫은 후 밤새 샘플을 동결 건조합니다. 동결건조된 분말을 각 분획에 0.5ml의 얼음처럼 차가운 면역침전 또는 IP 결합 완충액으로 재현탁시킵니다. 0.5 ml의 재부유 부피를 두 번째 분획에서 첫 번째 분획이 있는 튜브로 옮기고 피펫 팁을 저장합니다.

내용물을 cryotube로 옮기기 전에 다른 0.5ml의 IP 버퍼를 사용하여 각 동결 건조 튜브를 헹군 다음 2ml의 IP 버퍼를 사용하여 헹굼을 반복합니다. 절단 팁이 있는 P200을 사용하여 밀리리터당 0.5mg의 항체 비드 슬러리 스톡을 마이크로분리 튜브로 옮긴 후 450마이크로리터의 얼음 냉각 IP 결합 버퍼를 추가하여 50마이크로리터의 4G10 항체 비드 슬러리와 25마이크로리터의 27 B10.4 항체 비드 슬러리를 마이크로분리 튜브에 세척합니다. 튜브를 100g과 섭씨 4도에서 1분 동안 원심분리합니다.

상등액을 흡인시킨 후 IP 결합 완충액의 원래 슬러리와 동일한 부피를 첨가하여 비드를 재현탁합니다. 스크류 캡 cryotubes의 재현탁 샘플 용액에 사전 세척된 pY 비드를 추가한 다음 엔드-투-엔드 회전기에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 비드를 회전시킨 후 pST 펩타이드를 농축하는 데 사용할 상등액을 저장합니다.

다음으로, 300마이크로리터의 IP 결합 버퍼를 사용하여 비드를 재현탁하고 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 100g과 섭씨 4도에서 1분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 500마이크로리터의 IP 바인딩 버퍼로 비드를 세 번 세척합니다.

pH 7.5의 25 밀리몰 중탄산 암모늄 450 마이크로 리터로 비드를 4 번 세척합니다. 겔 로딩 팁을 비드 표면 약간 아래에 담그고 상층액을 완전히 흡인합니다. 비드에 0.1%TFA의 비드 부피의 4배를 추가합니다.

그런 다음 잘 섞고 1, 000rpm 및 섭씨 37도의 온도 혼합기에서 15분 동안 튜브를 배양합니다. 재현탁액을 0.2마이크로미터 스핀 필터로 옮기고 850g의 속도로 필터를 1분 동안 원심분리합니다. 용리액을 저단백질 결합 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후 용리액을 섭씨 40도에서 진공 농축하고 밤새 300분의 가열 시간을 유지합니다.

팁에 포함된 산화티타늄 비드를 준비하려면 100% ACN 200마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 뒤집고 좁은 끝을 튕겨 액체를 캡 쪽으로 이동합니다. 면도날을 사용하여 끝을 자르고 저단백질 바인딩 튜브 위에 놓습니다.

그런 다음 캡을 제거하고 마이크로피펫을 삽입하여 세척을 반복하기 전에 남아 있는 ACN을 빼냅니다. 이산화 티타늄을 500 마이크로 리터의 100 % ACN으로 두 번 전처리합니다. 그런 다음 이산화 티타늄을 500 마이크로 리터의 0.2 몰 인산나트륨 완충액 pH 7로 두 번 컨디셔닝합니다.

마지막으로 300마이크로리터의 평형 완충액을 사용하여 비드를 세 번 세척합니다. 저단백질 결합 튜브에 400마이크로리터의 50%ACN 0.1%TFA를 추가합니다. 그런 다음 84마이크로리터의 젖산을 추가합니다.

재현탁된 인산펩티드를 저단백질 결합 튜브로 옮기고 엔드-투-엔드(end-over-end) 회전기를 사용하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 비드를 펠릿화한 후 300마이크로리터의 평형 완충액을 사용하여 두 번 세척하고 스핀다운합니다. 300마이크로리터의 헹굼 버퍼로 비드를 두 번 헹굽니다.

그런 다음 0.2마이크로미터 스핀 필터로 옮깁니다. 회전 후 필터 장치를 깨끗한 1.5ml 저단백질 결합 튜브로 옮기고 200마이크로리터의 물에 0.9%암모늄을 넣고 내용물을 두 번 용출합니다. pH를 확인한 후 용리액을 밤새 진공 농축하여 암모니아를 증발시킵니다.

MS 분석을 위해 펩타이드를 탈염하려면 15마이크로리터의 0.1%TFA로 인산펩타이드를 재구성합니다. 결합 용량이 5마이크로그램인 C18 팁을 사용하여 샘플을 세척하고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 마지막으로, 진공 농축에 의해 용출량을 완전히 건조시킨 후, 건조된 포스호펩티드를 12.5마이크로리터의 질량 분석 용액에 재현탁합니다.

이 Coomassie 염색 된 사전 소화 용해 물의이 겔은 단백질의 존재를 확인하고 소화 후 용해 물의 염색은 완전한 소화를 확인합니다. 완전한 소화를 위해서는 lys-C와 trypsin에 대해 각각 30 킬로달톤과 23.3 킬로달톤 띠를 제외하고는 15 킬로달톤 이상으로 띠가 나타나지 않아야 합니다. lys-C를 추가하면 놓친 분열의 수도 줄어듭니다.

pY 면역침전은 pST로부터 pY를 효과적으로 분리하며, pY 제제로부터 확인된 인산펩티드의 평균 85%가 pY이며, pST 제제로부터 확인된 인산펩티드의 99% 이상이 pST였다. 이산화티타늄은 두 제제 모두에서 인산펩티드를 농축하는 데 사용됩니다. MS 준비 제제에서 인산화되는 펩타이드의 예상 비율은 30-50%이며 검출된 인산펩티드의 대다수는 단일 또는 이중 인산기를 가지고 있습니다.

질량 분석법을 수행한 후 MS 원시 파일을 MS 분석 소프트웨어에 로드합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 국소화 확률 컷오프를 0.75보다 크게 설정하면 pY 펩타이드의 약 5%와 pS 및 pT 펩타이드의 각각 15% 및 34%가 필터링됩니다. 이러한 필터를 적용한 후, MS 분석 종료 시 예상되는 인산펩타이드 식별 수는 시작 단백질 5mg에 대해 약 300pY 펩타이드, 각 농축 제제에서 시작 펩타이드 양 2.5mg에 대해 약 7, 500pS 펩타이드 및 640pT 펩타이드입니다.

이 기법을 마스터하면 pY 및 pST 단계를 병렬로 수행하는 경우 6일 이내에 완료할 수 있습니다. 그러나 8개 이상의 샘플의 경우 단계를 순서대로 수행하여 추가로 4일 동안 기술 오류를 줄이십시오. 이러한 절차를 시도하는 동안 세부 사항에 집중해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

모든 단계가 중요하며 필요한 품질 관리를 포함하여 최종 준비의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단백질을 추출하고 분해하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 인단백질체의 전반적인 변화를 조사하기 위해 질량 분석법을 통한 분석을 위해 포스호펩타이드 농축을 수행해야 합니다.