Name: 거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 배우세요 쥐의 거미 막 밑 출혈 후 대뇌 혈관 경련을 정량화하는 3D 혈관 재구성 방법을. Micro-CT와 방사선 불투명 주조 기법을 사용하여 혈관 부피를 측정하고 객관적인 혈관 경련 평가를 수행합니다.

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이 연구의 부분 의학 교수진의 요하네스 구텐베르크-대학 마인츠의 제시 T. Pantel의 박사 논문의 일부가입니다. 연구는 Friedhelm 해제 재단 및 재단 Neurochirurgische Forschung (A.N. 부여)에 의해 지원 되었다.

동물 실험 (Landesuntersuchungsamt 라인란드-Pfalz) 책임 있는 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었고 독일 동물 복지 행위 (TierSchG)에 따라 실시. 관심과 동물의 사용에 대 한 모든 해당 국제, 국가, 및 기관 지침 따라 했다.
이 연구에서는 남성 C57BL6 마우스 (10-12 주 나이) 사용 되었다. 간단히, 거미 막 밑 출혈은 마 취와 isoflurane 혈관 내 수술 필 라 멘 트 구멍 뚫 기에 의해 유발 됩니다. 왼쪽된 외부 경 동맥 수술 준비 되었다. 다음, 한 필 라 멘 트 외부 경 동맥에 삽입 되었고 경 T, 거미 막 밑 출혈을 유도에 천공 된 내부 경 동맥을 통해 intracranially 고급. Intracranial 압력에서 상승 성공적인 혈관 내 수술의 지표로 서 찍은 구멍 뚫 기. 쥐에 혈관 내 수술 필 라 멘 트 구멍 뚫 기 모델이 SAH의 상세한 프로토콜 되었습니다8,14다른 사람에 의해 출판.
1. 관류 및 혈관 내 수술 캐스팅
<ol><li>이 연구에서는 관류 SAH의 유도 후 72 시간을 수행 했다. Intraperitoneally 5 µ g/g 몸 무게 (bw) midazolam, 30 ng/g bw 펜타닐, 및 0.5 µ g/g bw medetomidin를 주입 하 여 마 취를 유도. 충분 한 마 취 수준에 도달 했습니다, 통증 자극에 반응의 결핍에 의해 확인 된 후에 계속 합니다.</li>
	<li>가슴을 열고, 21 G 정 맥과 좌 심 실 펑크, 오른쪽 아 트리 움, 열고 클램프 설명 대로 하강 대동맥 다른15.</li>
	<li>다음과 같은 솔루션을 사용 하 여 transcardiac 관류 수행: (i) Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 MgCl2 와 CaCl2 pH 7.4 1 g/L 포도 당, 및 (ii) 4 %paraformaldehyde 솔루션에 포함 된.<ol>
<li>(I) 2 분 동안 솔루션에 관류를 시작 하 고 (ii) 4 분에 대 한 솔루션을 계속.</li>
		<li>최적의 관류 압력 마우스16에서 vasospasm을 분석을 발견은 70 mmHg의 압력을 일정으로 perfuse를 변수 관류 속도와 압력 제어 펌프를 사용 하 여 37 ° C의 온도에서 솔루션을 달 이다. 솔루션 (ii) 압력의 손실을 솔루션 (i)에서 전환 하는 때 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>방사선 불 투과성 캐스팅 에이전트와 함께 실 온에서 20 분 동안 관류 계속 관류와 솔루션 (i) (ii), 후 ( 재료의 표참조) 0.2 ml/min의 일정 한 속도로.</li>
	<li>밤새 4 ° C에서 방사선 불 투과성 주조 재료의 치료에 대 한 허용. 다음 앞에서 설명한17두개골에서 뇌를 제거 하 고 4 %PFA 솔루션 샘플을 전송 마이크로 CT 스캔까지 4 ° C에서 샘플을 저장할.</li>
</ol>2. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영
<ol><li>무딘 해 부 집게와 두뇌 플라스틱 튜브의 중앙에 놓습니다. 이미지 수집 동안 개체 이동 하지 않습니다 수 있도록 샘플 보다 약간 더 큰 직경 튜브를 선택 하십시오. 거 즈를 사용 하 여 튜브를 닫습니다.</li>
	<li>개체의 가로 축을 회전은 x 선 실에서 컴퓨터 탐색 제어 (CNC) 포지셔닝 시스템에 마이크로 스테핑 모터에 플라스틱 튜브를 연결 합니다.</li>
	<li>X 선 방사선 아래 보기의 필드에서 샘플을 맞춥니다. 최대한 확대를 위해 x 선 소스에 최대한 가까이 개체를 배치 하 고 최대한 검출기에 거리를 극대화 합니다.</li>
	<li>단계 및 촬영 이미지 수집 프로토콜을 사용 하 여 다음 검색 매개 변수: 1 노출 시간 설정 신호 대 잡음 비율 (SNR)를 최적화, 전압 80 관 각 영사 s kV (현재 38 µ A), 1000 예측에서 결과 360 ° 회전.</li>
	<li>원시 데이터의 복구에 대 한 복구 소프트웨어를 사용 하 여 1024 x 1024 x 1024 복의 매트릭스로 Shepp-로 건 필터 적용 필터링된 다시 투영 알고리즘을 사용 ( 재료의 표참조). 추가 분석을 위해 가져올 결과 DICOM 데이터 3D 시각화 소프트웨어 ( 재료의 표참조).</li>
</ol>3. 3 차원 재구성 Intracranial 혈관 나무와 선박 볼륨의 결정의
참고: 시각화 소프트웨어의 기능에 대 한 배경 정보는 도움말기능 사용 하 여 찾을 수 있습니다.
<ol><li>가져오기함수를 사용 하 여 시각화 소프트웨어에 Dicom 데이터를 가져옵니다.</li>
	<li>Volren기능을 가진 그릇 트리를 시각화 합니다. 큰 뇌 동맥 날카로운 윤곽선에 묘사를 시각화 임계값을 선택 합니다. 그것은 실험 시리즈에 속하는 모든 데이터 세트에 대 한 동일한 시각화 임계값을 사용 해야 합니다.</li>
	<li>사실상 해 부 기저 대뇌 동맥 (Willis의 원형) 기능 VolumeEdit 커서 혈관 주변으로. 다음 사실상 선박 세그먼트 분석을 해 부. 따라서, 정확 하 게 모든 작은 가지 주요 동맥에서 분리 하기 위하여 혈관 나무의 3 차원 모델을 회전 합니다. 분석할 선박 세그먼트를 제외 하 고 모든 혈관을 삭제 하려면 추가 분석을 위해 필수적 이다.</li>
	<li>임계값 생성 시각화 임계값 설정 함수 Autoskeleton 을 적용 한 센터-라인- SpatialGraph를 기반으로.</li>
	<li>그런 다음 SpatialGraphToLineSet 를 만드는 함수를 적용 한 라인 세트. 수동으로 커서 단일 전향을 선택 하 고 "분할"을 클릭 하 여 그것의 단일 전향으로 설정 하는 줄을 나눕니다. 이 단계는 단일 전향의 볼륨을 계산 하기 위해 중요 한.</li>
	<li>LineSetToSpatialGraph 함수를 사용 하 여 공간 그래프를 다시 만듭니다.</li>
	<li>SpatialGraphStatistics 함수를 사용 하 여 길이, 볼륨, 및 각 subsegment의 직경을 결정. 색상된 시각화에 대 한 혈관 직경의 과정을 나타내는 함수 사용 하 여 SpatialGraphView. "두께" 선박 직경 상관을 색칠 하는 세그먼트를 설정 합니다. 그것은 실험 시리즈에 속하는 모든 데이터 집합에 대 한 동일한 색상 지도 선택 하는 것이 중요입니다.</li>
	<li>추가 분석에 포함 되어야 하는 전향 결정할 수 전향의 길이 추가 합니다. 현재 연구에서 우리가 경 T의 인접 내부 경 동맥의 1 m m 및 2.5 m m 경 t.의 원심 중간 대뇌 동맥의의 구성 된 선박 세그먼트 평가 정의 된 선 세그먼트의 혈관 볼륨을 확인 하기 위해 볼륨을 추가 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Macdonald, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+neurological+deterioration+after+subarachnoid+haemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage.</a> Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).</li>
<li>Dorsch, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+review+of+cerebral+vasospasm+and+delayed+ischaemia+following+aneurysm+rupture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica+Supplement%22%5BJournal%5D)">A clinical review of cerebral vasospasm and delayed ischaemia following aneurysm rupture.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 110 (Pt 1), 5-6 (2011).</li>
<li>Vergouwen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+delayed+cerebral+ischemia+after+aneurysmal+subarachnoid+hemorrhage+as+an+outcome+event+in+clinical+trials+and+observational+studies%3A+Proposal+of+a+multidisciplinary+research+group%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: Proposal of a multidisciplinary research group.</a> Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).</li>
<li>Friedrich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2+has+no+therapeutic+effect+on+early+microvasospasm+after+experimental+subarachnoid+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">CO2 has no therapeutic effect on early microvasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), e1-e6 (2014).</li>
<li>Friedrich, B., Muller, F., Feiler, S., Scholler, K., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+subarachnoid+hemorrhage+causes+early+and+long-lasting+microarterial+constriction+and+microthrombosis%3A+An+in+vivo+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Experimental subarachnoid hemorrhage causes early and long-lasting microarterial constriction and microthrombosis: An in vivo microscopy study.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (3), 447-455 (2012).</li>
<li>Terpolilli, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+inhalation+reduces+brain+damage%2C+prevents+mortality%2C+and+improves+neurological+outcome+after+subarachnoid+hemorrhage+by+resolving+early+pial+microvasospasms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide inhalation reduces brain damage, prevents mortality, and improves neurological outcome after subarachnoid hemorrhage by resolving early pial microvasospasms.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (12), 2096-2107 (2016).</li>
<li>Neulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+segmentation-based+volumetric+approach+to+localize+and+quantify+cerebral+vasospasm+based+on+tomographic+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data.</a> PLoS One. 12 (2), e0172010(2017).</li>
<li>Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+subarachnoid+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A murine model of subarachnoid hemorrhage.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50845(2013).</li>
<li>Altay, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+subarachnoid+hemorrhage+to+induce+vasospasm+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 136-140 (2009).</li>
<li>Momin, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+delivery+of+nitric+oxide+inhibits+leukocyte+migration+and+prevents+vasospasm+in+haptoglobin+2-2+mice+after+subarachnoid+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage.</a> Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).</li>
<li>Froehler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasospasm+after+subarachnoid+hemorrhage+in+haptoglobin+2-2+mice+can+be+prevented+with+a+glutathione+peroxidase+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neurocience%22%5BJournal%5D)">Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic.</a> Journal of Clinical Neurocience. 17 (9), 1169-1172 (2010).</li>
<li>Lin, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+subarachnoid+hemorrhage-induced+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm.</a> Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).</li>
<li>Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+intracranial+in+vivo+animal+models+of+delayed+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm.</a> British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).</li>
<li>Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+induction+of+subarachnoid+hemorrhage+in+mice+by+intracranial+pressure+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring.</a> Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).</li>
<li>Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+procedure+for+imaging+of+the+mouse+cerebral+vasculature+by+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT.</a> Journal of Neuroscience Methods. 221, 70-77 (2014).</li>
<li>Parra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+subarachnoid+hemorrhage+associated+cerebral+vasospasm%3A+methodological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+research%22%5BJournal%5D)">Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis.</a> Neurological research. 24 (5), 510-516 (2002).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. 105 (e53208), (2015).</li>
<li>Marjamaa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+a+deletion+in+the+first+intron+of+the+Col1a1+gene+develop+dissection+and+rupture+of+aorta+in+the+absence+of+aneurysms%3A+High-resolution+magnetic+resonance+imaging%2C+at+4.7+T%2C+of+the+aorta+and+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mice with a deletion in the first intron of the Col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms: High-resolution magnetic resonance imaging, at 4.7 T, of the aorta and cerebral arteries.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 55 (3), 592-597 (2006).</li>
<li>Schambach, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+high-resolution+in+vivo+volume-CTA+of+mice+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Ultrafast high-resolution in vivo volume-CTA of mice cerebral vessels.</a> Stroke. 40 (4), 1444-1450 (2009).</li>
<li>Figueiredo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+digital+subtraction+angiography%2C+micro-computed+tomography+angiography+and+magnetic+resonance+angiography+in+the+assessment+of+the+cerebrovascular+system+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice.</a> Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Murine SAH 모델 기본 SAH 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 대뇌 vasospasm 자주 SAH9,11후 DCI로 이어지는 메커니즘을 조사 하는 실험 연구에서 끝점으로 사용 됩니다. 그러나, 쥐에서 뇌 vasospasm의 정량화 또는 다른 작은 동물 모델 SAH의 도전 이다. 일반적으로, vasospasm 혈관 내 수술 관류와 주조7,,912 후 정의 된 해 부 지점에서 혈관 직경의 비보 전 결정 또는 둘레의 계량은 조직학에 정의 된 혈관의 섹션10,11. 그러나, 이러한 방법은 일부의 단점이: Vasospasm 정의 해 부 포인트;에 평가 됩니다 vasospasm 선박 세그먼트를 이웃의 평가 벗어날 수 있습니다. 조직학 아티팩트 오류의 또 다른 소스를 제공합니다. 또한, 평가 배 직경 측정은 정확한 위치는 조사에 의해 결정 되기 때문에 오히려 주관적 수 있습니다.
목표 그러므로 횡단면 영상 데이터7에서 전체 대뇌 혈관 세그먼트의 혈관 볼륨을 계산 하 여 대뇌 vasospasm을 수량화 하는 메서드를 설정 했다. 여기에 제시 된 체적 방법의 가장 중요 한 장점은 그 전체 선박 세그먼트 시험 될 수 있다 이다. 이 선박 직경 측정 포인트의 정의의 필요성을 피 한다. 전체 선박 세그먼트의 평가의 더 이점은 이다 그것은 아마도 더 근 이나 말 초 혈관의 vasospasm 탈출 수 정의 점에서 혈관 직경의 결정 보다 vasospasm 척도를 더 객관적인 매개 변수 제공 평가입니다. 색상 코드를 사용 하 여 혈관 직경의 디지털 표현을 vasospasm 정도의 직관적인 추정 수 있습니다. 또한, 체적 평가 vasospastic 선박 대표 결과에서 같이 혈관 직경의 평가에 비해 큰 차이를 리드. 여기에 제시 된 방법으로 달성 하는 가상 재건 혈관 해부학을 정확 하 게 반영 합니다. 이 용기에 직경 현미경으로 측정 하 고 디지털 복원에서 유사, 이전 연구7의 관측을 재현 했다 대표 시리즈의 평가 의해 표시 됩니다. 그러나, 그것의 장점에도 불구 하 고 더 연구는 필요 여부에 상관 없이 여기에 제시 된 방법은 vasospasm 분석의 전통적인 방법에 우수한 평가 합니다.
여기에 제시 된 방법의 한계는 그것 casted 뇌의 미세한 분석 또는 조직학 분석 (마이크로 CT 검사 뇌 샘플, 데이터 처리 뇌 샘플 당 45 분 당 90 분)에 비해 더 많은 시간을 준다. 또한, 마이크로 CT 스캐너의 여부는 응용 프로그램을 제한할 수 있습니다. 여기 검사 하는 동물의 수가이 원고에 설명 된 프로토콜의 타당성을 입증 하기에 충분 했다. 그러나, 치료 연구에는 프로토콜을 사용 해야 경우 동물 숫자를 계산 했 선박 볼륨 및 직경에 기대 효과에 따라. 이와 murine SAH 모델을 사용 하 여 다른 연구의 또 다른 한계는 vasospasm 결정 비보 전입니다. 이것은 경도 연구 불가능 SAH 유도 및 다른 시간 지점에서 vasospasm 전에 초기 계획 값을 조사 합니다. 비록 그것을 증명 하는 연구는 쥐에서 vivo에서 자기 공명 단층 촬영18, 계산 된 단층 촬영 혈관19또는 디지털 빼기를 사용 하 여의 큰 intracranial 혈관의 해부학을 묘사 하 제품은20, 우리의 지식, 이러한 방법을 하지 아직 사용 되었습니다 분석 murine SAH 모델 vivo에서 대뇌 vasospasm 하. 메모의 대뇌 vasospasm 여기에 제시 된의 후속 체적 평가와 대뇌 맥 관 구조의 디지털 재건 비보 전 마이크로 CT 데이터 사용에 국한 되지 않습니다. 마우스에 고해상도 혈관 교차 단면 뇌 이미징 미래에 사용할 수 있게 한다, vivo에서vasospasm volumetric 분석 수행 사용할 수 있습니다.

Aneurysmatic 거미 막 밑 출혈 (SAH), 출혈 성 뇌졸중의 하위 유형이 neurointensive 치료 단위에 일반적인 질병 이다. 초기 뇌 손상 (비), 구성 자체는 출혈 이벤트로 인 한 뇌 손상, 게다가 환자 결과 결정 하는 또 다른 중요 한 요소는 지연된 대뇌 국 소 빈 혈 (DCI), 임상에 의해 정의 된 통해 악화 대뇌 장애 관류 또는 대뇌 경색 중재 또는 외과 절차1,2,3와 관련 되지 않은. DCI에 기여 하는 중요 한 메커니즘은 큰 대뇌 혈관의 vasospasms 한편으로; 다른 한편으로, microvessels 및 microthrombosis, 및 외피 퍼지는 불경기와 관련 된 허 혈 vasospasm와 microcirculatory 부전 역할 (Madonald 20141에서 검토). 따라서, vasospasm 큰 대뇌 혈관의 진단 임상 연습에서 중요 하 고 많은 실험과 임상 연구에서 중요 한 끝점을 표시 합니다.
Vasospasm murine SAH 모델에서의 기능을 직접 하지 않습니다 사실에도 불구 하 고 인간의 환자, murine 모델 SAH의 양도 관련된 vasospasm이 되었습니다 지난 몇 년 동안에서 성장 하는 의미의. 이러한 모델에 SAH는 혈관 내 수술 필 라 멘 트 천공4,5,6,7,8, cisternal 선박9, transection 또는 CSF10에 혈액의 주입에 의해 유도 된 ,,1112. 큰 동물 모델 SAH의 전통적으로 vasospasm13를 연구 하도록 설계 되었습니다, 달리 murine 모델 수많은 유전자 변형 쥐 종자 사용할 수 있는 큰 장점이 있다. 이로써 그들 분자 메커니즘 vasospasm 및 DCI를 공부 하기 위한 훌륭한 도구. 그러나, 쥐의 대뇌 vasospasm의 도전 이다. 이 때문에 큰 동물 모델에서 vasospasm 시험 될 수 있다 임상 이미징 기술을 사용 하 여, 달리 vivo에서 이미징 쥐에서 대뇌 vasospasm을 분석 하는 아직 사용할 수 없습니다. 따라서, vasospasm은 어느 조직학 섹션10,11 을 사용 하 여 또는 미세 후 대뇌 혈관7,,912의 주조에 일반적으로 결정 됩니다. 그러나, 이러한 기술은 직경만 정의 된 지점에서 검사는 그 선박 단점은 있다.
7이전 연구 바탕으로,이 원고는 murine SAH 모델에 목표 및 재현성 분석 vasospasm 위해 메서드를 제공 합니다. 방법은 관류 및 대뇌 혈관, ex vivo 마이크로-CT 검사, 선박 트리의 디지털 개조의 주조에 따라 그리고 후속 전체 대뇌 혈관의 볼륨의 평가.

<table><tbody><tr><td>메데토미딘&nbsp;</td><td>Pfizer, Karlsruhe, Germany</td><td>n.a.Midazolam</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td>n.a.Fentanyl</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Curamed, Karlsruhe, Germany</td><td>n.a.Venofix</td><td></td></tr> <tr><td>21G</td><td>B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>n.a.21G</td> <td>캐뉼라&nbsp;</td></tr><tr><td>둘베코' MgCl2 및 CaCl2를 함유하는 인산염 완충 식염수, pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, 함부르크, 독일</td><td>D8662&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드 용액&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, 함부르크, 독일</td><td>100496</td><td></td></tr><tr><td>Microfil MV-122&nbsp;</td><td>Flowtech Inc., Carver, MA, USA</td><td>n.a.Radiopaque</td><td></td></tr> <tr><td>Micro-CT system</td><td>Y.Fox Yxlon, Garbsen, Germany</td><td>n.a.Reconstruction</td><td></td></tr> <tr><td>Studio 소프트웨어 버전 1.2.8.1</td><td>TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany</td><td>n.a.Reconstruction</td> <td>software</td></tr><tr><td>Amira 소프트웨어 버전 5.4.2&nbsp;</td><td>FEI 시각화 과학 그룹, 힐스보로, 오레곤, 미국</td><td>n.a.</td><td>시각화 소프트웨어</td></tr><tr><td>PHD 울트라 주사기 펌프</td><td>하버드 장치</td><td>70-3</td><td>압력 제어 펌프</td></tr><tr><td>해부학적 집게 (무딘)</td><td>B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>160323_v&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Infinity X-21</td><td>Deltapix, Maalov, Denmark</td><td>n.a.</td><td>고해상도 카메라</td></tr><tr><td>DeltaPix Insight 소프트웨어 버전 2.0.1</td><td>Deltapix, Maalov, Denmark</td><td>n.a.C57BL6</td><td></td></tr> <tr><td>마우스</td><td>Charles River, Cologne, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

거미 막 밑 출혈의 murine 모델에 대뇌 vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

거미 막 밑 출혈 (SAH) 출혈 성 뇌졸중의 하위 형식입니다. 출혈의 여파에서 발생 하는 대뇌 vasospasm 환자 결과 결정 하는 중요 한 요소 이며 따라서 자주 연구 끝점으로 찍은. 그러나, SAH에 작은 동물 연구, 대뇌 vasospasm의 정량화는 주요 도전 이다. 여기, ex vivo 메서드는 대뇌 vasospasm을 계량 하는 객관적인 측정으로 사용 될 수 있는 전체 선박 세그먼트의 볼륨의 정량화를 허용 하 여. 첫 번째 단계에서 대뇌 맥 관 구조의 혈관 내 수술 캐스팅 방사선 불 투과성 캐스팅 에이전트를 사용 하 여 수행 됩니다. 다음, 횡단면 영상 데이터는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 획득 됩니다. 마지막 단계는 센터 라인과 선택한 선 세그먼트의 볼륨을 계산 하는 알고리즘에 의해 다음 가상 혈관 트리의 3 차원 재구성을 포함 한다. 메서드 결과 뇌혈관 성 나무 직경에 기초를 둔 그들의 가상 복원 해 부 샘플 비교 하 여 표시의 정확한 가상 재건. 혼자 배 직경에 비해, 선박 볼륨 SAH, 가짜 운영 마우스의 시리즈에 표시 된 vasospastic 및 vasospastic 비 혈관 사이의 차이점을 강조 표시 합니다.

3 차원 intracranial 혈관 트리의 가상 재건
3 차원 복원된 intracranial 혈관 나무 제공 매우 정확한 혈관 해부학 (그림 1). 우리 선박 직경 미세 결정 사이 그리고 2 해부학 적인 몸의 구조 정의 지점에서 3 차원 가상 개조에서 직경 기반 비교를 수행 하는 정확도 평가, (1: 중간 대뇌 동맥 (MCA) 1 m m의 원심 왼쪽에 경 T; 2: 오른쪽 MCA 경 T의 원심 1 m m). 혈관 직경의 미세한 결정에 대 한 고해상도 카메라 (무한대 X-21, Deltapix) DeltaPix 통찰력 소프트웨어 버전 2.0.1와 마이크로미터 눈금 보정 사용 되었다. 이 평가 대 한 10 뇌 샘플 (5 SAH, 5 가짜) 분석 되었다. 이들은 7의는 SAH 유도 되었다, 5 가짜 수술 (수술 후 일 1과 2에 각각 사망 SAH 그룹의 2 동물) 동안에 12 마우스의 시리즈에서. Intracranial 혈관 해부학 (가상 재건 대 미세한 결정의 정확한 가상 재건을 나타내는 미세 하 고 거의 결정 직경 사이의 중요 한 차이가 있었다 ± 표준 오차를 의미: 왼쪽 MCA 150 ± 9 µ m 대 왼쪽된 MCA 150 ± 8 µ m; 바로 MCA 153 ± 8 μ m 대154 ± 9 µ m, 그림 2참조). 
SAH와 쥐의 대뇌 vasospasm의 정량화
(I) 2 해부학 정의 포인트 (왼쪽 및 오른쪽 MCA)에 직경 1 m m 내부 경 동맥 (ICA)와 왼쪽, 그리고 (ii)는 선박에 2.5 m m MCA 구성 된 미리 정의 된 대표적인 3.5 m m 선 세그먼트의 볼륨이 했다 대뇌 vasospasm을 계량 하기 SAH를 운영 하는 가짜 동물 뇌 견본에서 결정 (n = 5). 선박 볼륨은 SAH 가짜에 비해 크게 낮은 (36 ± 4 nL 대 71 ± 9 nL, p &lt; 0.05). 혈관 직경은 SAH 가짜에 비해 낮은 (MCA 왼쪽: 140 ± 11 µ m 대 160 ± 10 µ m, p = 0.11; MCA를 마우스 오른쪽: 130 ± 16 µ m 대 158 ± 13 µ m, p &lt; 0.05; 그림 3참조), 레벨의 중요성만 분석가 대 한 도달 하는 동안 오른쪽 MCA의입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig1.jpg"> 그림 1. Intracranial 혈관 트리의 가상 재건입니다. (A) 표시는 대표적인 두뇌 샘플; (B) 혈관 트리 재건축 사실상 해당 표시 됩니다. ((C)) 왼쪽 MCA의 직경의 색상된 시각화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57997/57997fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig2.jpg"> 그림 2 . 정확도 맥 관 구조 디지털 재건의. 평균 직경 미세 결정 들에 비해 3D 복원된 뇌 견본에서 측정. 데이터는 평균 ± 표준 오차의 평균으로 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57997/57997fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig3.jpg"> 그림 3 . 선박 볼륨 및 선박 직경 SAH 후. (A) 비교의 MCA 직경 측정 SAH 맥 3D 복원된 관 구조에서 쥐를 가짜 고. (B) 선박 볼륨 SAH에 가짜 쥐와. 데이터는 평균 ± 표준 오차의 평균으로 표시 됩니다. p &lt; 0.05입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57997/57997fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 기사의 목적은 마이크로 계산 된 단층 촬영 및 전체 선박 세그먼트에 대뇌 vasospasm을 계량 하는 데 사용할 수 있는 볼륨의 결정 후 마우스에서 뇌혈관 나무의 3 차원 재구성을 허용 하는 방법을 제시 하는 것입니다. 거미 막 밑 출혈의 murine 모델입니다.

거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

이 절차의 전반적인 목표는 지주막하 출혈 유도 후 마우스의 뇌관 경련을 정량화하는 것입니다. 이것은 방사선 불투과성 주조제를 사용하여 동물에게 경심 관류 및 혈관 내 주조를 실시함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 뇌에 마이크로컴퓨터 단층촬영을 실시하여 단면 이미지 데이터를 얻는 것입니다.그런 다음 이미지와 데이터가 처리됩니다. Miro 소프트웨어는 두개내 혈관 트리를 가상으로 재구성하고 정의된 혈관 세그먼트의 부피를 계산하는 데 사용되며, 이는 혈관 경련을 정량화하기 위한 객관적인 척도를 나타냅니다. 지주막하 출혈은 Isoflurane으로 마취된 상태에서 혈관내 필라멘트 천공에 의해 마우스에서 유도됩니다.좌측 외부 경동맥은 수술을 통해 준비됩니다. 그런 다음 필라멘트를 외부 경동맥에 삽입하고 경동맥 t에 천공된 내부 경동맥을 통해 두개골 내부로 전진하여 지주막하 출혈을 유발합니다. 두개내 압력의 상승은 성공적인 혈관내 천공의 지표로 간주됩니다.혈관 경련을 분석하려면 마취를 유도합니다. 충분한 마취 수준에 도달한 후에만 계속하며, 이는 통증 자극에 대한 반응이 없는 것으로 확인됩니다. 다음 솔루션을 사용하여 경심 관류를 수행합니다.나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘의 생리학적 농도를 함유하는 생리학적 염 용액으로 pH는 7점 4입니다. 그 후, 4% PFA 용액. 2분 동안 솔루션 번호 1로 풍부함을 시작하고 솔루션 번호 2로 4분 동안 계속합니다.섭씨 37도의 온도에서 용액을 주입하고 가변 관류 속도의 압력 제어 펌프를 사용하여 70mm 수은의 일정한 압력으로 관류합니다. 솔루션 1에서 솔루션 2로 전환할 때 압력 손실을 피하십시오. 두 용액으로 관류한 후 방사선 불투과성 캐스팅제를 사용하여 분당 2밀리리터의 일정한 속도로 실온에서 20분 동안 관류를 계속합니다.방사선 불투과성 주조 재료의 경화를 위해 샘플을 밤새 섭씨 4도에서 보관합니다. 그리고 뇌를 제거하고 마이크로 setisiny까지 4% PFA 용액에 섭씨 4도의 샘플을 보관하십시오. 뭉툭한 해부학적 집게가 있는 플라스틱 튜브 중앙에 뇌를 놓습니다.샘플보다 직경이 약간 더 큰 튜브를 선택하여 이미지 획득 중에 물체가 움직이지 않도록 합니다. 거즈를 사용하여 튜브를 닫습니다. 물체가 그것의 수평축의 주위에 회전하는 X-ray 캐빈에서 제어 포지셔닝 시스템을 탐색한 컴퓨터의 마이크로 스테핑 모터를 통해 플라스틱 튜브를 부착하십시오.필드를 위한 샘플을 정렬합니다. X-ray 방사선 촬영 아래의 시야. 최대 배율을 달성하려면 물체를 X선 소스에 최대한 가깝게 배치하고 검출기까지의 거리를 최대한 최대화하십시오. 다음 스캔 매개변수와 함께 단계 및 촬영 이미지 획득 프로토콜을 사용합니다.각 프로젝션에 대해 노출 시간을 1초로 설정하고 80kV의 튜브 전압을 사용하여 신호 대 잡음비를 최적화합니다. 한 회전에 대해 투영 수를 1, 000으로 설정합니다. 원시 데이터를 복원하려면 필터링된 역투영 알고리즘을 사용하며, 이는 1,024 입방 복셀로 구성된 행렬을 갖는 Shepp-Logan 필터를 의미합니다.함수 import를 사용하여 dicom 데이터를 Miro 소프트웨어로 가져옵니다. 함수 vol-run을 사용하여 vessel tree를 시각화합니다. 큰 대뇌 동맥이 선명한 윤곽선으로 묘사되도록 시각화 임계값을 선택합니다.실험 계열에 속하는 모든 데이터 세트에 대해 동일한 시각화 임계값을 사용하는 것이 중요합니다. Circle of Willis의 기저 대뇌 동맥을 가상으로 절개하고, 혈관을 cur-zon으로 둘러싸서 기능 볼륨을 추가합니다. 그런 다음 분석할 혈관 세그먼트를 가상으로 해부합니다.따라서 주동맥에서 모든 작은 가지를 정확하게 분리하기 위해 혈관 나무의 3차원 모델을 회전합니다. 추가 분석을 위해서는 분석할 선박 세그먼트를 제외한 모든 선박을 삭제하는 것이 필수적입니다. 임계값이 시각화 임계값으로 설정된 auto skeleton 기능을 적용하면 중심선 기반 공간 그래프가 생성됩니다.그런 다음 기능 공간 그래프를 선 세트에 적용하여 라인 세트를 만듭니다. 라인 세트를 '단일 하위 세그먼트'로 나누려면 커서로 단일 하위 세그먼트를 수동으로 선택하고 split을 클릭합니다. 이 단계는 단일 하위 세그먼트의 부피를 계산하는 데 중요합니다.spatial graph로 설정된 function line을 사용하여 공간 그래프를 다시 만듭니다. 공간 그래프 통계량 함수를 사용하여 각 하위 세그먼트의 길이, 부피 및 지름을 확인할 수 있습니다. 색상으로 구분된 시각화의 경우, 선박 직경의 항로를 나타내는 Spatial Graph View 기능을 사용합니다.segment coloring을 vessel diameter와 상관관계가 있는 thickness로 설정합니다. 실험 계열에 속하는 모든 데이터 세트에 대해 동일한 색상 맵을 선택하는 것이 중요합니다. 하위 세그먼트의 길이를 추가하여 추가 분석에 포함할 하위 세그먼트를 결정합니다.본 연구에서는 경동맥 t의 근위부 1mm, 경동맥 t의 근위부 대뇌동맥 2점 5mm로 구성된 혈관 분절을 평가했습니다. 그런 다음 부피를 추가하여 정의된 용기 세그먼트의 용기 부피를 결정합니다. 혈관 나무의 가상 재구성의 정확성을 평가하기 위해 10개의 뇌 샘플에서 해부학적으로 정의된 2개의 지점에서 현미경으로 결정된 혈관 직경과 3D 가상 재구성 간의 직경 기반 비교를 수행했습니다.용기 직경의 현미경 측정을 위해 고해상도 카메라, 소프트웨어 보정 도구, 마이크로미터 스케일을 사용했으며, 현미경으로 측정된 직경과 가상으로 측정된 직경 사이에는 큰 차이가 없었습니다. 두개내 혈관 해부학의 정확한 가상 재구성을 나타냅니다. 대뇌 기저 경련을 정량화하기 위해 왼쪽의 1mm IC8 및 2점 5mm MCA로 구성된 사전 정의된 대표 3점 5mm 혈관 세그먼트의 부피를 측정했습니다.SAH와 가짜 수술 동물의 뇌 샘플. SAH에서 혈관 부피는 가짜에 비해 현저히 낮았으며, 이는 뇌관 경련을 나타냅니다. 용기 직경도 SAH에서 가짜에 비해 현저히 낮았습니다.여기에 제시된 방법으로 달성된 가상 재건은 혈관 해부학적 구조를 정확하게 반영합니다. 전체 혈관 세그먼트를 검사할 수 있으며, 이는 단일 지점에서 혈관 직경을 결정하는 것보다 혈관 경련을 정량화하기 위한 더 객관적인 매개변수를 제시하는 것으로 추정됩니다. 부피 측정은 혈관 직경만 평가하는 것과 비교하여 vasopastic 혈관과 non-vasospastic 혈관 간에 더 큰 차이를 초래합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Aneurysmal subarachnoid 출혈 (SAH)은 때 동맥 파열 subarachnoid 공간에 발생합니다 출혈이 있습니다. subarachnoid의 출혈이 몇 년 전 예전처럼 될 수 계속 한 후이 행사의 병적 상태와 사망률이 개선 치료 방법으로 인해 감소, vasospasm의 위험에 왔지만. 뇌성 vasospasm의 시작 이벤트를 식별하기 위해 포괄적이고 재현 동물 모델을 확립의 중요성은 배리의 1979 년 실험 vasospasm 모델 쥐의 첫 번째 사용하기 때문에 연구의...

실험 Subarachnoid의 출혈 후 뇌 지연 Vasospasm을 평가하기 위해 낮은 사망 쥐 모델

이 비디오는 지주막하 출혈 쥐 모델을 설정하는 절차를 보여줍니다. 마취된 쥐에게는 두개내압과 뇌혈류를 측정하기 위해 프로브를 이식합니다. 표적 부위가 확인되고 바늘이 chiasmatic 전 위치에 삽입됩니다. 그런 다음 자가 혈액을 지주막하 공간으로 주입하여 두개내 압력을 높이고 뇌 혈류를 감소시켜 모델을 확립합니다.

자가 혈액 주입에 의해 유도된 지주막하 출혈 쥐 모델 구축

윌리스 천공의 관내 서클 지주막 하 출혈의 표준화 된 마우스 모델을 설명한다. 선박 천공 및 지주막 하 출혈은 두개 내 압력 모니터링에 의해 모니터링된다. 또 각종 중요한 파라미터는 기록 및 생리적 조건을 유지하도록 제어된다.

지주막 하 출혈의 생쥐 모델

이 프로토콜은 마우스의 일시적인 중대뇌동맥 폐색 후 경색 부피와 혈액-뇌 장벽 파괴를 감소시키는 반복적인 저산소증 전조건화 또는 전신 저산소증에 대한 짧은 노출을 설명합니다. 또한 신경혈관 보호의 효능을 평가하기 위해 뇌졸중 후 경색 용적과 혈액-뇌 장벽 파괴의 이중 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

우리는 이 프로토콜에서 시스테나 마그나에 자가 전혈을 이중 으로 주입하여 표준화된 지주막 출혈(SAH) 마우스 모델을 기술하였다. 이중 주사 절차의 높은 수준의 표준화는 사망률에 관한 상대적 안전과 SAH의 중간-급성 모델을 나타낸다.

수브라크누드 출혈의 모델로 시스테나 마그나에 혈액을 이중 직접 주입

이 원고의 목적은 마우스의 대뇌 동맥에서 혈류의 생체 내 이미징을 허용하는 초음파 기반 방법을 제시하는 것입니다. 우리는 지주 막 증 출혈의 뮤린 모델에서 혈관 경련과 관련 된 혈액 흐름 속도의 변화를 결정 하기 위해 그것의 응용 프로그램을 보여줍니다 (SAH).

고주파 두개골 이중 초음파를 가진 수브라크누이드 출혈의 뮤린 모형에 있는 뇌 혈관경련의 분석

지주막하 출혈은 계속해서 사람의 사망률과 이환율에 대한 높은 부담을 안고 있습니다. 상태와 병태생리학에 대한 추가 연구를 용이하게 하기 위해 pre-chiasmatic, 단일 주입 모델이 제시됩니다.

쥐 모델에서 실험적 지주막하 출혈을 유도하기 위한 자가 혈액의 Pre-chiasmatic, 단일 주사

여기서 우리는 정확한 출혈 부위를 보장하고 다른 관련 두개내 병리를 배제하기 위해 수술 후 24 시간 동안 자기 공명 영상 (MRI)과 결합 된 혈관 내 필라멘트 천공에 의해 유도 된 표준화 된 SAH 마우스 모델을 제시합니다.

자기 공명 영상(MRI)과 결합된 Subarachnoid 출혈에 대한 혈관 내 천공 모델

이 프로토콜에서 설명하는 생쥐에서 했습니다만 출혈의 autologous 혈액 주입 모델은 바늘 트랙까지 혈액 역류, 펌핑 시스템에서 anticoagulants의 위험을 최소화하기 위해 이중 사출 기술을 사용하고, 시스템의 모든 죽은 공간 및 확장 튜브를 제거합니다.

마우스에서 자연 했습니다만 출혈을 모델로 Autologous 혈액 주입

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를...

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

배우세요 쥐의 거미 막 밑 출혈 후 대뇌 혈관 경련을 정량화하는 3D 혈관 재구성 방법을. Micro-CT와 방사선 불투명 주조 기법을 사용하여 혈관 부피를 측정하고 객관적인 혈관 경련 평가를 수행합니다.

거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

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