Name: 마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 마우스 췌장 내 분비세포의 단일세포 RNA 시퀀싱 방법을 통해 췌장 섬 계통 분화와 세포 이형성을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 당뇨병 및 췌장 내분비 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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우리는 생명 과학 컴퓨팅 플랫폼에 대 한 단백질 과학, 베이징 (북경 대학) 및 북경 칭화 센터에 대 한 국립 센터를 감사합니다. 이 작품의 과학 및 기술 (2015CB942800), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31521004, 31471358, 및 31522036), 중국과의 북경 칭화 센터에서 C. R.X. 생명 과학에 대 한 자금에 의해 지원 되었다

<ol><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li>
<li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">On the origin of the beta cell.</a> Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li>
<li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756(2016).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+Advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li>
<li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li>
<li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li>
<li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data%3A+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+in+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li>
<li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li>
<li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v025i01">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li>
<li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadley%2C+W+%22ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: Elegant graphics for data analysis</a>. , Springer Science & Business Media. (2009).</li>
<li>Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016).</li>
<li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 우리는 췌 장 β 세포의 단일 셀 식 프로필 공부에 대 한 효과적이 고 사용 하기 쉬운 방법 시연. 배아, 신생아 및 산 후 췌 내 분 비 세포를 분리 하 고 단일 셀 transcriptomic 분석을 수행 하려면이 메서드를 사용할 수 있습니다.
가장 중요 한 단계 좋은 조건에서 단일 β 세포의 고립입니다. 완전히 끼얹는다 췌 후속 소화에 더 나은 응답합니다. 일반적으로 등 쪽 췌 장에서 발생, 부족 한 관류 낮은 섬 항복 발생 합니다. 관류, 후 소화 시간과 강도 떨고 특별 한 주의 필요로 합니다. -소화, 긴 외피 시간에서 그리고 활기찬 떨고, 조각으로는 독도 끊을 수 있다. 부족 한 소화는 완전히 인접 조직에서는 독도 분리 하지 것입니다. 췌 장의 소화, 후에 독도 손 따기 보다는 조밀도 기온 변화도 원심 분리에 의해 정화 되었다. 밀도 그라데이션 원심 독도 풍요롭게 수 있습니다, 비록 많은 작은 독도 또는 포상 조직으로 연결 하는 독도 실수로 삭제 됩니다....

췌는 포유동물에 중요 한 변화 기관 이다. 췌 장 내 분 비와 외 분 비 구획 구성 됩니다. 췌 장 내 분 비 세포, 인슐린을 생산 하는 β 세포와 글 루카 곤 생성 α 세포를 포함 하 여 독도 Langerhans에 함께 클러스터링 하 고 전할 조직의 포도 당 항상성 조절. 내 분 비 세포의 기능 장애 결과 당뇨병 mellitus, 전세계 주요 공중 보건 문제가 되 고 있습니다.
췌 장 내 분 비 세포는 Ngn3에서 파생 된+ embryogenesis1동안 창시자. 나중에, perinatal 기간 동안 내 분 비 세포 증식 양식 미 성숙한 독도를. 이 미 성숙한 세포 개발 하 고 점차 성숙한 독도, 성인2혈액 포도 당 항상성 조절에 나가도록 풍부한 되는 계속.
비록 transcriptional 요인의 그룹 β 세포 분화를 조절 하는 발견 되었습니다, β 세포의 정확한 성숙 통로 아직 명확 하지 않습니다. 또한, β 세포 성숙 프로세스는 또한 셀 번호 확장3,4 의 규정 및 세포질이5,6세대 포함 한다. 그러나, 이러한 프로세스의 규제 메커니즘 하지 되었습니다 잘 공부 했습니다.
단일 셀 RNA 시퀀싱은 셀 부분 모집단을 프로 파일링 하 고 세포 계보 발달 경로7추적 수 있는 강력한 방법입니다. 이 기술, 단일 셀 레벨8에서 췌 장 섬 개발 중 발생 하는 이벤트를 해독 수 있습니다 키를 활용. 단일 셀 RNA 시퀀싱 프로토콜 중 스마트 seq2 향상 된 감도 정확도, 그리고 낮은 비용9표준 시 약의 사용 전장 cDNA의 생성을 허용 한다. 스마트 seq2 시퀀싱10cDNA 라이브러리를 만드는 데 약 2 일 소요 됩니다.
여기, 우리는 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 사용 하 여 성인 Ins1-RFP 유전자 변형 마우스11, 태아의 췌에서 형광 표시 된 β 세포의 격리 하는 방법을 제안 하 고 transcriptomic의 성능 분석에 스마트 seq2 기술 (그림 1)를 사용 하 여 단일 셀 수준입니다. 이 프로토콜은 일반, 병리학 및 노화 상태에서 각종 췌 장 내 분 비 세포의 transcriptomes 분석을 확장할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 분해 효소 P</td><td>Roche</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25 %), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 4 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30g BD 바늘 1/2 " </td><td>길이 BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>스테레오 Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 라운드 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함</td>) <td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96-Well PCR Microplate</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 밀봉 매트</td><td>Axygen</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>얇은 웰 PCR 튜브</td><td>Extragene</td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>모세관 피펫</td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA 스파이크인 믹스</td><td>Life Technologies</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>재조합 RNase 억제제</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II 역전사 효소</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>First-strand buffer (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>베타인</td><td>시그마-알드리치</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유 물</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi 핫스타트 레디믹스 (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA 클린 비드 XP 비드</td><td>Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Vazyme</td><td>TD502</td><td>용 TruePrep DNA 라이브러리 준비 키트 V2</td><td>Illumina Vazyme TD203용 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td></tr><tr><td>TruePrep Index Kit V3</td><td></td><td></td><td>포함 16 N6XX 및 24 N8XX</td></tr><tr><td>고감도 NGS 절편 분석 키트</td>, <td>Advanced Analytical Technologies</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Ca2+ 및 Mg2+</td><td></td><td></td><td>138mM 염화나트륨; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Isolation 버퍼</td><td></td><td></td><td>1 &times; 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM 포도당, pH 7.4</td></tr><tr><td>FACS 완충액</td><td></td><td></td><td>1 &times를 함유하는 HBS; HBSS 함유 15mM HEPES, 5.6mM 포도당, 1% FBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td> <td>시그마-알드리치</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>올리고-dT<하>30</>VN 프라이머</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR</td></tr> <tr><td>프라이머</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>Gapdh 포워드 프라이머</td><td></td><td></td><td>5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Reverse 프라이머</td><td></td><td></td><td>5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>Ins2 포워드 프라이머</td><td></td><td></td><td>5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>Ins2 리버스 프라이머</td><td></td><td></td><td>5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 transcriptomic 분석

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

독도에서 클러스터는 췌 장 내 분 비 세포는 혈액 포도 당 안정성과 에너지 대사 조절. 인슐린 분 비 하는 β 세포를 포함 하 여 독도에 뚜렷한 세포 유형 배아 단계에서 일반적인 내 분 비 창시자에서 구분 됩니다. 미 숙 내 분 비 세포는 세포 증식을 통해 확장 하 고 긴 출생 후 발달 기간 동안 성숙. 그러나, 이러한 프로세스를 기본 메커니즘 명확 하 게 정의 되지 않습니다. 단일 셀 RNA 시퀀싱은 뚜렷한 세포 인구와 추적 세포 계보 차별화 경로 특성에 대 한 유망한 접근 이다. 여기, 우리는 배아, 신생아 및 산 후 췌에서 고립 된 췌 장 β 세포의 단일 셀 RNA 시퀀싱에 대 한 메서드를 설명합니다.

췌 미 발달, 신생아 및 산 후 마우스에서 해 부 했다 (그림 2A 및 2B). 쥐 출생 후 하루 18 보다 더 오래 된, 대 한 소화 효과 관류;의 정도에 따라 달라 집니다. 따라서, 주사 섬 격리에 대 한 가장 중요 한 단계는 (그림 2C-2E 및 표 6). 이 단계 동안 췌를 채울 수 있어서 많은 콜라 주입 했다. 완전히 비정상적된 췌 2D 그림에에서 표시 됩니다. 경우는 관류 성공 (그림 2E), 하지만 샘플은 소중한 췌 나중에 충분 한 소화를 위한 작은 조각으로 찢 겨 수 있습니다.
<p class="jove_content...

단일 셀 RNA 시퀀싱 뒤 미 발달, 신생아 및 산 후 췌 내 분 비 세포의 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하면 분석 췌 장 내 분 비 계보 개발의 셀이 transcriptomic 역학.

마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

이 방법은 췌장 적 정문 필드에서 췌장 리니지 분화, 성숙 및 재생에 대한 주요 질문에 대한 답변을 가질 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고품질 단세포 RNA 염기서열 분석 데이터의 생성을 위한 단일 췌장 축암 세포의 수집을 허용한다는 것입니다. 이 기술의 적용은 병리학적 조건에 췌장 내분비 단 하나 세포의 전사 분석을 통해 당뇨병과 다른 췌장 내분비 관련 질병의 치료로 확장됩니다.이 방법의 시각적 데모는 관류에 대한 췌장의 좁은 담관에 바늘을 삽입하는 것이 까다로울 수 있기 때문에 중요합니다. 배아의 날 17.5 배아. 복강을 여은 후 팔꿈치 핀셋을 사용하여 내장 조직을 감기 PBS를 포함하는 6 센티미터 검은 바닥 접시로 옮춥시다.집게를 사용하여 내장 조직에서 췌장을 분리하십시오. 그리고 췌장 조직을 차가운 콜라게나아제 용액 5밀리리터를 포함하는 20 밀리리터 바이알에 넣습니다. 산후 일 0에서 15 마우스의 경우, 조직을 콜라게나아제에 넣기 전에 췌장의 모든 엽을 주의 깊게 해부하십시오.산후 일 18 받는 일 60 마우스에 대 한, 먼저 xiphoid를 제거 하 고 복 강의 오른쪽에 창 자를 추출. 담낭과 일반적인 담관을 노출하기 위해 각 측면에 간 좌측 및 오른쪽 내측 엽을 밀어 넣습니다. 그리고 십이지장 과 작은 선박 클램프 한 쌍으로 십이지장 간질은 담관이 십이지장으로 들어가는 부위를 측면으로 합니다.다음으로, 차가운 콜라게나제 용액이 있는 30 게이지 바늘을 장착한 5 밀리리터 주사기를 적재합니다. 그리고 현미경을 사용하여 담낭에 바늘 팁을 삽입하십시오. 일반적인 담관을 통해 바늘을 신중하고 원활하게 조작합니다.그리고 플런저를 우울하게 하여 마우스 크기에 따라 콜라게나제 용액의 1~5밀리리터로 췌장을 인페징합니다. 모든 솔루션이 침투되면 집게를 사용하여 췌장을 신선한 차가운 콜라게나아제 용액 5밀리리터를 포함하는 20 밀리리터 바이알로 즉시 전송합니다. 모든 췌장 조직이 수집되면 37도의 수수 욕조에 바이알을 넣고 3~5분간 부드러운 흔들림을 냅니다.그런 다음 0.25 밀리미터 나일론 여과기를 통해 소화된 제품을 새로운 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 필터링합니다. 얼음 차가운 PBS가 들어있는 20 밀리리터 주사기를 사용하여 스트레이너를 철저히 씻으십시오. 산후 일 18 받는 일 60 췌장, 원심 분리 필터 된 샘플을 원심 분리 하 고 감기 PBS의 30 밀리리터에서 조직을 다시 중단.그런 다음 조직 현탁액을 6센티미터 검은 바닥 접시로 분해하고, 200 마이크로리터 파이펫과 해부 현미경을 사용하여 소량의 감기 PBS를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮길 섬을 선택합니다. 배아일 17.5 산후 15일 췌장의 경우, 여과된 췌장 조직을 원심분리하고 트립신-EDTA 용액의 펠릿을 37°C의 수조에서 4분간 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 200 마이크로리터 파이펫으로 1분 동안 펠릿을 부드럽게 평가하고, 소화를 멈추기 위해 부드러운 소용돌이로 차가운 태아 소 혈청의 0.5배를 첨가합니다.그런 다음 원심 분리에 의해 소화를 수집하고 유동 세포측정에 의해 정렬을위한 5 밀리리터 FACS 튜브에서 FACS 버퍼의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 단일 세포 따기 및 용해의 경우, aliquot 갓 준비 된 셀 리시스 버퍼를 8 개의 스트립 PCR 튜브로 버퍼링하고 단일 셀을 각각 전달합니다. RNA의 방출을 위해 세포를 lyse하는 견본을 소용돌이, 4섭씨에서 30 초 동안 원심분리, 얼음에 즉각적인 저장.역전사의 경우, 리스를 섭씨 72도에서 3분간 배양한 다음 얼음에서 1분간 배양합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 30초 동안 간략하게 원심분리하고 각 샘플에 5.7 마이크로리터의 역전사 믹스를 추가하여 각 샘플에 대해 총 부피를 10 마이크로리터로 가져옵니다. 부드러운 소용돌이와 원심분리 후 샘플을 열순환기에 적재하고 역전사 프로그램을 시작합니다.폴리머라제 연쇄 반응 전암증폭 또는 PCR의 경우, 첫 번째 가닥 반응을 포함하는 각 샘플에 PCR 믹스 15마이크로리터를 추가하고 부드러운 소용돌이와 원심분리를 합니다. 그런 다음 샘플을 열순환기로 로드하고 PCR 프로그램을 시작합니다. PCR 정화의 경우, 각 샘플에 재부유 된 DNA 정화 구슬 25 마이크로 리터를 추가하고 소용돌이에 의해 잘 섞습니다.그런 다음 재빨리 실온에서 샘플을 회전하여 구슬의 정착을 피하면서 액체를 수집합니다. 실온에서 5분 후, 샘플을 적절한 자기 스탠드에 놓고 용액이 명확할 때 상체를 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 워시당 80%에탄올로 준비된 200마이크로리터200마이크로리터로 30초 세척2개로 구슬을 씻습니다.그리고 두 번째 세척 후 나머지 에탄올을 폐기하십시오. 구슬이 공기건조되면 11 마이크로리터의 핵을 첨가하여 구슬에서 DNA 표적을 엘루트하고 소용돌이를 피하십시오. 그런 다음 샘플을 신속하게 원심 분리하고 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자기 스탠드로 반환하고 각 샘플의 10 마이크로리터를 새로운 PCR 튜브로 전송합니다.성공적으로 증폭된 cDNA는 500개의 기본 쌍 보다 전체 길이를 가지며 1.5~2킬로베이스 쌍으로 보강되어야 합니다. 더욱이, 인슐린 1RFP 플러스 세포에서 관찰된 cDNA의 500~600개의 염기 쌍 농축이 일반적으로 인슐린 전사체를 나타낼 수 있다. 그러나, 100개의 염기 쌍 근처의 cDNA 단편은 일반적으로 과도한 프라이머에 의해 유발되고 DNA 정화 단계를 반복하여 제거되어야 하는 프라이머 디머이다.100과 500개의 염기 쌍 사이의 cDNA 단편은 일반적으로 저하된 cDNA를 나타내며, 이는 RNase 오염과 같은 나쁜 세포 상태 또는 지역 문제로 인해 발생하며 배제되어야 합니다. 시퀀싱을 위한 cDNA 라이브러리의 정제 후, 250에서 450개의 염기 쌍에 이르는 cDNA는 정제의 제1 및 제2 라운드에 DNA 정화 구슬의 첨가를 통해 얻을 수 있다. DNA 비드 정제 후, 시퀀싱 품질 평가 중에 시퀀싱 품질 점수가 30을 초과해야 한다.다운스트림 분석을 위한 고품질 세포를 얻기 위하여는, 0.5백만 미만의 매핑된 읽기 또는 4 이하의, 000검출된 유전자를 가진 세포는 제외되고, 세포의 다른 단의 특성화 및 주요 성분 분석 및 계층적 클러스터링 후에 다른 단에서 이질적으로 표현되는 유전자의 식별을 용이하게 합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 소화를 통해 유슬을 피하고 단일 세포 절차 동안 RNase 무료 환경을 유지하기 위해 콜라게나아제 소화 전에 신속하게 췌장을 perfuse하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, islet 화상 진찰 및 배양같이 그밖 방법은 islet 구조의 시각화를 용이하게 하고 세포 반응 및 약 자극을 검토하기 위하여 수행될 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 포유류의 당뇨병 진행뿐만 아니라, 유방 계보 발달 및 재생의 메커니즘을 탐구하는 췌장 연구 분야의 연구자를위한 길을 열었습니다.

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

다음 프로토콜은 가상 슬라이스 이미지에 대한 췌장 해부 과정을 설명하고, 전체 췌장에있는 모든 GFP - 태그 베타 세포의 후속 부량.

마우스의 췌장 베타 세포 질량의 원위치 부량에서

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

이 문서에서는, 우리는 분리와 생쥐 췌장에서 배양 기본 췌장 포상 세포에 대한 신속하고 편리하게 절차를 설명합니다. 이 방법은 신선한 차 변환되지 않은 정상 / 외분비 췌장 세포의 생리학을 연구하는 귀중한 방법을 구성합니다.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

여기서, 우리는 중간 엽 세포의 분리에 초점 배아 신생아 및 성인 마우스 조직에서 췌장 미세 세포의 분리 방법을 설명한다. 이 방법은 췌장 개발, 기능 및 종양 형성을 조절하는 외부 신호를 명료하게하기 위하여 세포 유전자 발현 및 단백질 분비를 프로파일 링 할 수있다.

분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

췌장 메타 플라스틱 세포는 췌장 종양을 일으키는 악성 세포의 전구체입니다. 그러나 온전한 생존 가능한 췌장 세포를 분리하는 것은 어렵습니다. 여기에서는 췌장 조직 해리를 위한 효율적인 방법을 제시합니다. 그런 다음 세포를 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 또는 2차원 또는 3차원 공동 배양에 사용할 수 있습니다.

생존 가능한 단일 세포를 분리하기 위한 췌장 조직 해부

이 프로토콜은 거의 생리학적 조건에서 세포 기능을 연구하기 위해 사망한 장기 기증자로부터 인간 췌장 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 혁신적인 접근법은 정상 및 구조적으로 손상된 섬과 내분비 구획 간의 복잡한 상호 작용을 조사할 수 있게 합니다.

내분비 및 외분비 췌장 생리학을 연구하기 위해 인간 췌장 조직 절편 생성

이 프로토콜은 전체 췌장에서 마우스 내피 세포를 분리하는 방법을 설명합니다.

마우스 췌장 내피 세포의 분리

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

배우세요 마우스 췌장 내 분비세포의 단일세포 RNA 시퀀싱 방법을 통해 췌장 섬 계통 분화와 세포 이형성을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 당뇨병 및 췌장 내분비 질환 치료 연구에 활용됩니다.

마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석

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