Name: 전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 배우세요 전체 혈액에서 바이러스 핵산을 신속하게 추출하는 수동 방법을. 장비 없이 현장 병원에서도 사용 가능하며, 의료진이 즉시 진단할 수 있어 환자 치료 결과를 개선합니다.

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그들의 기술 지원 및 임상 샘플 처리에 대 한 우리 감사 수잔 달리기 라 스무 센 및 Solvej Kolbjørn 젠 슨. 이 프로젝트는 혁신적인 의학 이니셔티브 2 공동 사업 보조금 계약 N ° 115843 아래에서 자금을 받고 있다 EbolaMoDRAD 컨소시엄의 일부입니다. 이 공동 사업 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 EFPIA에서 지원을 받습니다.

생명 의학 연구 윤리 위원회, 수도권은 동의 그리고 여기에 설명 된 모든 방법을 분석 결과 개발 프로젝트에 덴마크 법률에 따라 윤리 위원회 시스템에 의해 검토에서 제외 된.
1. 바이러스 비활성화 및 빠른 나 추출을 위한 혈액 컬렉션 진공관의 준비
주의:이 프로토콜에 사용 되는 버퍼 guanidinium 안산 (GITC)과 비 이온 계면 활성 제, irritants을 포함 되어 있습니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오. 버퍼를 유출 하는 경우 오염 된 표면 해야 합니다 절대 소독 되어야 chloramine 또는 염소 ("표 백제"의 활성 성분)와 직접이 혼합물 독성 시안 화물의 형성으로 이어질 수 있기 때문에. 첫째, 흡수 성 조직으로 유출된 버퍼를 닦아냅니다. 다음, 물, 그리고 70% 에탄올으로 표면 청소 하 고 마지막으로, chloramine 또는 염소를 사용 합니다.
<ol><li>준비 하려면 혈액 컬렉션 진공관, 25 G x 1 바늘과 3 mL 주사기를 사용 하 여 튜브의 뚜껑을 puncturing 의해 특정 상업 세포의 용 해 버퍼의 1.6 mL 4 mL EDTA 진공 튜브로 주사. 참고: 진공 튜브의 뚜껑을 제거 하지 마십시오. 진공 유지 되어야 합니다.</li>
	<li>실 온에서 버퍼 사용까지 포함 된 진공 튜브를 저장 합니다. 참고: 튜브는 적어도 1 년의 준비 후 안정.</li>
</ol>2입니다. 나 추출에 대 한 버퍼의 준비
<ol><li>나 추출에 대 한 버퍼를 준비 하려면 랙에서 두 1.8 mL, 두 4.5 mL, 그리고 한 3.6 mL 튜브를 배치 합니다.</li>
	<li>Pipetting, 960 µ L 자석 유리 입자 (MGPs) 깨끗 한 1.8 mL 튜브와 라벨이 MGPs. 그것은 그것을 pipetting 전에 완전히 MGP 정지를 Resuspend 하 여 추가 합니다. 참고:는 MGPs는 튜브의 하단에 신속 하 게 수집 하는 경향이 있다.</li>
	<li>Pipetting, 워시 버퍼의 4 mL 나 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 의해, 추가 하 고 WB-1로 그것을 분류. 주의: 워시 버퍼 나 자극성은 guanidinium 염화를 포함 합니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오.</li>
	<li>워시 버퍼 II 깨끗 한 3.6 mL 튜브 1.5 mL를 pipetting에 의해 추가 하 고 WB 2로 그것을 분류.</li>
	<li>Pipetting, 여 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 워시 버퍼 III의 3 mL를 추가 하 고 레이블을 WB-3로.</li>
	<li>깨끗 한 1.8 mL 튜브에 차입 버퍼의 100 µ L pipetting으로 추가 하 고 레이블을 EB로.</li>
	<li>사용 될 때까지 실 온에서 aliquoted 버퍼를 저장 합니다. 참고: 튜브는 그들의 준비 후 적어도 1 달 동안 안정.</li>
</ol>3. 바이러스 감염의 징후와 증상을 가진 환자에서 혈
주의: 환자에서 전체 혈액을 수집 하는 때 적절 한 실험실 안전 조치를 취할. 장갑과 안경 착용. 환자 격리에서는, biosafety 수준 4 절차를 따르시기 바랍니다.
<ol><li>환자에서 정 맥 전 혈을 수집 작은-내경 확장 튜브와 나비 바늘과 혈액 컬렉션 진공관 포함 하는 세포/바인딩 버퍼를 사용 합니다. 하향 위치에 환자의 팔을 휴식 하 고 컬렉션 튜브 나비 바늘 보다 낮은 위치. 환자의 정 맥에 나비 바늘을 삽입 하 고 작은-내경 확장 혈액 컬렉션 진공관을 연결할. 참고: 이것은 역류를 방지 합니다.</li>
	<li>혈액 수집 후 5-10 시간 튜브를 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합. 참고: 포함 하는 세포/바인딩 버퍼의 1.6 mL 혈액 컬렉션 튜브에 남아 있는 진공으로 인해 수집 된 샘플의 볼륨 자동으로 됩니다 1.6 mL.</li>
	<li>70% 에탄올을 사용 하 여 튜브의 외부를 소독.</li>
	<li>실 온에서 20 분 동안 튜브를 품 어. 참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 전체 혈액 컬렉션 튜브-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C 또는 적어도 1 달7에 대 한 37 ° C에 저장 될 수 있다.</li>
	<li>단순화 된 나 추출 방법에 직접 계속.</li>
</ol>4. 간단 하 게 전체 혈액의 나 추출
<ol><li>세포/바인딩 버퍼 비활성화 수집 된 혈액, 믹스에서에서 나를 정화 진공을 틀 지 하 여 튜브의 내용을 손으로 5-10 x 튜브.</li>
	<li>신중 하 게 튜브의 뚜껑을 제거 하 고 뚜껑을 방전.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 MGPs (1 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>샘플 포함 된 튜브에는 사용 하지 않는 혈액 컬렉션 튜브에서 새로운 뚜껑을 장소.</li>
	<li>튜브 긴밀 하 게 폐쇄 확인 혈액 컬렉션 튜브가 손으로 5-10 시간 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합을 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>자석 홀더에 튜브를 놓고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 유지 합니다.</li>
	<li>모든 MGPs는 자석으로 튜브의 측면에서 수집 되도록 손으로 튜브와 함께 자석 홀더는 몇 번을 플립. 참고: 자석 홀더는 길쭉한 자석 및 고무 밴드를 교체할 수 있습니다.</li>
	<li>튜브의 뚜껑을 제거 하 고 일회용 피 펫을 사용 하 여 또는 단순히 50 mL 수집 튜브에 내용을 붓는 하 여 튜브의 내용을 삭제 합니다. 참고: 튜브 뚜껑을 닫아서 50 mL 수집 튜브에서에 어로 졸을 피하십시오.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-1 (4 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>관에 뚜껑을 배치 하 고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>자석 홀더, 뚜껑을 손가락으로 안전 하 게 강화 유지에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.</li>
	<li>4.6 4.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-2 (1.5 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>MGPs는 손으로 몇 초 동안 혈액 컬렉션 튜브를 내리고 여 resuspend.</li>
	<li>4.6 4.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-3 (3 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.</li>
	<li>4.6 4.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>EB의 준비 된 약 수를 부 어 (100 µ L) 혈액 컬렉션 튜브에 직접.</li>
	<li>관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브 5-10 배는 손가락으로 두 드려서는 MGPs는 EB에 resuspend. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다, 그리고 튜브-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>Resuspended MGPs의 1.5 mL 일회용 피 펫 (모든 다운스트림 진단 나 증폭 시험 램프/RT-램프 또는 정량/RT-정량 분석을 사용할 수 있습니다와 같은)를 사용 하 여 다운스트림 나 증폭 반응 혼합 한 방울 (5-8 µ L)를 전송. 참고: NAs는 MGPs에 충실, 다운스트림 나 증폭 반응에는 MGPs를 사용 해야 됩니다. 혼합 사용 하기 전에 MGP 정지. 혼합 후, MGPs는 튜브의 아래쪽에 수집 합니다.</li>
</ol>

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<li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Instructions+for+Use%3A+Idylla+TM+Ebola+Virus+Triage+Test%22">Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf">https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf</a> (2016).</li>
<li>MPLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+Nucleic+Acid+Isolation+Kit.+Safety+data+sheet+version+1.7%22">Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001">https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001</a> (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 간단한 수동 침대 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 다운스트림 분자 검출에 대 한 설명합니다. 직접 세포/바인딩 버퍼 (자료 테이블)7를 포함 하는 진공 혈액 컬렉션 튜브에 수집 된 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 설명된 나 추출 방법 개발 되었다. 이 특정 버퍼 EBOV7 생긴다 고 방법의 중요 한 구성 요소입니다. 혈액 수집 후 적어도 20 분7 튜브 샘플의 완전 한 비활성화를 위해 배양 하는 것이 좋습니다. 머리 맡 EBOV 비활성화 BSL-4 조건 등 엄격한 제약 조건 하에서 어떤 EBOV 긍정적인 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하 고 정상 BSL-2 조건 처리 샘플 있습니다. 그것은 다른 위험 그룹 4 개의 병원 체, 같은 Lassa 바이러스, Marburg 바이러스, 및 크림 콩고 ...

바이러스 발생 상황에서 환자 병원 격리 병 동 또는 때 빠른 진단이 필요 하 고에 수감 되는 때, 간단 하 고, 안전 하 고 정확한 포인트의 케어 분자 진단 환자 관리 및 위험 포함에 대 한 필수적입니다. 에볼라 바이러스 (EBOV) 서 부 아프리카 (2013) 및 남미 (2015), Zika 바이러스의 2 개의 최근 바이러스 발생, 향상 된 관리 포인트 분자 진단 테스트, 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 등에 대 한 관심 증가 증폭 (RT-램프)1,2 , recombinase 중 합 효소 증폭 (RPA)3,4. RT-램프와 RPA는 단순화 된 샘플 준비에 수행할 수 있는 빠른, 민감한, 그리고 특정 분자 테스트. Zika 바이러스에 대 한 실시간 램프는 측면 흐름 분석 결과 (LFA), 30 분1; 내 정화 비 전체 혈액 샘플에서 Zika 바이러스를 검출할 수 있는 결합 되었습니다. 그러나, 위험 그룹 4 병원 체로 분류 되는 매우 전염성이 EBOV 샘플 biosafety 아래 처리 될 필요 레벨 4 (BSL-4) 조건 및 안전 진단 절차를 수행할 수 있습니다 전에 비활성화.
단순화 된 비활성화 방법 EBOV, 샘플2,3,,45에 세포의 용 해 버퍼의 추가 같은 발발; 하는 동안 사용 되었다 그러나, 이러한 방법을 BSL-3 biosafety 캐비닛, 원심 분리기, 난방 블록 및 펫, 최소한 같은 실험실 장비와 BSL-4 조건 하에서 처리를 해야합니다. 이 장비는 격리 병 동에 또는 필드 병원에 일반적으로 존재. 이 문제를 해결 하려면 시도에 가방3, 진단 수행 되었습니다 되며 여러 휴대용 장치 및 기계 개발 [예를 들어, (나) 핵 산 추출에 대 한 휴대용 장치]6. 그러나, EBOV 긍정적인 샘플 여전히이 장치를 사용할 수 있습니다 비활성화 될 필요 합니다.
우리가 이전에 보고 된 EBOV7, Vaccinia 바이러스 및 Cowpox 바이러스8 에 대 한 신속한 머리 맡 바이러스 비활성화 방법 상업 세포/바인딩 버퍼의 추가 의해 일반 진공 혈액 컬렉션 튜브를 직접 허용 양도 혈액 환자에서 비활성화 버퍼7에. 어떤 엄격한 봉쇄, BSL-4 조건7, 등을 사용 하 여 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하는 닫힌된 시스템에서이 직접적이 고 즉각적인 비활성화 하 고 샘플 정상적인 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 이 비활성화 방법은 여러 나 추출 시스템, 로봇 등 손 정화 키트7;와 호환 그러나, 이러한 방법은 항상 병원 격리 병 동 내부 또는 필드 설정에 존재 하지 않는 로봇, 원심 분리기, 전기, 등 실험실 장비가 필요 합니다.
이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 단순화 된 수동 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 분자 검출에 대 한 설명합니다. 나 추출 방법에는 어떤 장비의 자석/자석 홀더 필요 하지 않습니다. 아니 원심 분리기, 블록, 또는 전기 난방 나 추출 필요 합니다. 따라서,이 방법은 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 하 고 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원, 병원 격리 병 동, 또는 낮은 리소스 설정을) 어디서 나 사용할. 나 추출 방법 신속 하 고 간단 하 고 모든 다운스트림 나 테스트, 정량, 실시간 정량, 램프, 또는 RT 램프 등에서 직접 사용할 수 있습니다. 이 나 추출 방법은 램프와 휴대용 배터리 구동 등온선 악기와 결합 하면 머리 맡 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 EDTA 튜브 (4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus 혈액 수집</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK 주사기 (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>나비 바늘 작은 구멍 확장 튜빙</td><td>J&oslash; rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1% Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - 용해/결합 버퍼 - 리필</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC 총 핵산 분리 키트</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 바이오뱅킹 및 세포 배양 극저온 튜브(1,8mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 바이오뱅킹 및 세포 배양 극저온 튜브(3,6mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 바이오뱅킹 및 세포 배양 극저온 튜브(4.5mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-5 자석</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫(3.5mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; 삼코&트레이드; 미세 팁 전송 피펫 (1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Nunc&trade; 50mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

감염의 급속 한 진단 발발 관리, 위험 봉쇄, 그리고 환자 치료를 위해 필수적 이다. 우리 이전 진공 혈액 컬렉션 튜브에 직접 상업 세포/바인딩 버퍼를 추가 하 여 안전한 핵 산 (나) 테스트를 위한 혈액 샘플링 동안 에볼라 바이러스의 급속 한 머리 맡 비활성화 하는 방법을 나타났습니다. 이 침대 비활성화 접근을 사용 하 여, 신속, 안전 하 고 단순화 된 머리 맡 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 검색에 대 한 개발 했습니다. 나 추출 혈액 컬렉션 튜브에서 직접 수행 하 고 아무 장비 또는 전기를 요구 한다.
혈액 세포/바인딩 버퍼에 수집 후 내용을 손으로 튜브를 틀 지 하 여 혼합 하 고 혼합물은 실 온에서 20 분 동안 알을 품을. 자석 유리 입자 (MGPs) 튜브에 추가 되 고 내용을 손으로 컬렉션 튜브를 틀 지 하 여 혼합 됩니다. MGPs는 다음 자석 홀더 또는 자석 및 고무 밴드를 사용 하 여 혈액 컬렉션 튜브 측에 수집 됩니다. MGPs는 세 번 씻어 그리고 컬렉션 튜브에 직접 차입 버퍼의 추가, NAs 나 테스트, 정량 등의 반응에서 MGPs 제거 없이 등온선 루프 증폭 (램프)에 대 한 준비가. 나 추출 메서드는 모든 실험실 시설에 의존 하지 않으며 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원 및 병원 격리 병 동에서) 어디서 나 사용할. 이 나 추출 방법은 램프 및 휴대용 악기와 결합 하면 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

여기에 제시 된 프로토콜 간단 하 고 효율적 이며 세포/바인딩 버퍼와 비활성화 전염 성 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 모든 분자 분석 결과에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다. 혈액 비활성화 및 나 추출에 대 한 워크플로 나온 그림 1혈액 컬렉션 진공관7 (그림 1A), 혈액 컬렉션7 (그림 1B), 나 추출 ( 준비 등 그림 1 c - 1 H), 및 다운스트림 나 분석 (그림 1I).
단순화 나 추출 프...

여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

이 방법은 바이러스 감염 징후가 있는 환자의 현장 진단을 수행할 때 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 실험실 장비와 전기 없이 수행할 수 있으므로 병원 병동에서 수행할 수 있다는 것입니다. 혈액 채취 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 의사 안데르스 폼가드(Anders Fomsgaard)와 과학자 모르텐 라스무센(Morten Rasmussen)입니다.채혈 튜브를 준비하는 것으로 시작합니다. 3ML 주사기에 부착된 25게이지 1인치 바늘을 사용하여 1.6ML의 상업용 용해 버퍼를 4ML EDTA 진공관에 주입합니다. 혈액 채취를 위해 채혈 튜브의 진공을 유지하는 것이 중요합니다.따라서 항상 바늘을 사용하여 용해 완충액을 채혈관에 주입하십시오. 그런 다음 960 마이크로 리터 부피의 자성 유리 입자 또는 MGP를 완전히 다시 현탁하고 라벨이 붙은 1.8ML 튜브로 옮깁니다. 다음으로 세척 버퍼 1의 4ML를 WB-1.1.5ML이라고 표시된 4.5ML 튜브에, 2개의 세척 버퍼를 WB-2라고 표시된 3.6ML 튜브에, 세탁 버퍼 3ML를 WB-3이라고 표시된 4.5ML 튜브에 피펫으로 넣습니다.마지막으로 EB라고 표시된 1.8ML 튜브에 100마이크로리터의 용출 완충액을 추가하고 튜브를 사용할 때까지 실온에 둡니다. 환자로부터 전혈 정맥을 채취하려면 작은 구멍 확장 튜브가 있는 버터플라이 바늘과 용해 완충액이 들어 있는 미리 준비된 채혈 진공관 중 하나를 사용합니다. 환자의 팔을 아래쪽 위치에 놓습니다.나비 바늘을 환자의 정맥에 삽입하고 채혈 진공관을 소구멍 확장에 부착합니다. 혈액 수집 후에 관을 5 10 배 튀겨서 관의 내용을, 섞으십시오. 70% 에탄올을 사용하여 튜브 외부를 소독합니다.그런 다음 바이러스 비활성화를 위해 실온에서 20분 동안 튜브를 배양합니다. 채취한 혈액에서 핵산을 정제하려면 진공관을 5회에서 10회 정도 손으로 뒤집어 튜브의 내용물을 다시 혼합합니다. 준비된 MGP 분취액을 채혈관에 직접 붓습니다.사용하지 않은 채혈 튜브의 새 뚜껑을 샘플이 들어 있는 튜브에 놓습니다. 뚜껑에 손가락을 대고 튜브가 단단히 닫혔는지 확인하고 튜브의 내용물을 5-10회 뒤집어 섞습니다. 튜브를 마그네틱 홀더에 넣고 뚜껑에 손가락을 대고 튜브가 단단히 닫혔는지 확인합니다.그런 다음 튜브가 있는 마그네틱 홀더를 몇 번 뒤집어 MGP가 자석이 있는 튜브 측면에 모이기 전에 분산시킵니다. 튜브의 뚜껑을 제거하고 일회용 피펫을 사용하여 튜브의 내용물을 50ML 수집 튜브에 버립니다. 준비된 WB-1 분취액을 채혈 튜브에 직접 붓고 튜브의 뚜껑을 닫습니다.내용물을 5-10회 손으로 섞습니다. 그런 다음 자석을 사용하여 튜브 측면의 구슬을 수집하고 이전과 같이 액체를 제거합니다. 준비된 WB-2 분취액에 비드를 다시 현탁시킨 다음 용액을 버리고 준비된 WB-3 분취액으로 절차를 반복합니다.마지막으로, 마그네틱 홀더에서 튜브를 제거하고 준비된 EB 부분 표본을 채혈 튜브에 직접 붓습니다. 튜브에 뚜껑을 놓고 손가락으로 5-10번 두드려 MGP를 다시 매달아 놓습니다. 마지막으로, 1.5ML 일회용 피펫을 사용하여 다시 현탁된 MGP 한 방울을 다운스트림 핵산 증폭 반응 혼합물로 전달합니다.PCR 반응에 하나의 액적만 이동하기 전에 MGP를 완전히 다시 현탁해야 합니다. 개념 증명을 입증하기 위해, 최근 기니 남부에서 발생한 에볼라 바이러스 표준의 10배 희석 또는 3가지 농도의 엡스타인 바 바이러스로 음성 전혈을 스파이크했습니다. 추출된 핵산은 사내 바이러스 특이적 R2 qPCR 또는 qPCR로 분석했습니다.교차 임계값(CT)이 낮을수록 바이러스 게놈 복제 수가 높아집니다. 여기서, 에볼라 바이러스의 농도가 서로 다른 스파이크된 전혈이 에볼라 바이러스 특이적 램프에 의해 검출되었습니다. 스파이크된 전혈 샘플에서 바이러스의 최종 농도는 X축에서 볼 수 있고 양성까지의 시간(분)은 Y축에서 볼 수 있습니다.여기서, 전혈은 C형 간염 WHO의 표준화된 혈청 샘플을 10배 희석하여 HCV 특이적 RT qPCR에 의한 검출로 스파이크되었습니다. 마지막으로, 이 이미지는 Epstein Barr 바이러스 양성 전혈에 대한 Epstein Barr 바이러스 특이적 램프 반응의 결과를 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 지정된 lysis 결합 버퍼를 사용하는 것이 중요합니다.이것은 중요한 단계이며 방법에 대한 중요한 시약입니다. 이 용해 결합 버퍼는 샘플에서 바이러스를 비활성화합니다. 이 기술에 따라 램프 및 PCR과 같은 다양한 분자 검출 방법을 수행할 수 있으므로 감별 진단을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

자동 microfluidic 장치는 세포 손실없이 고품질의 샘플의 절연을 보장 적혈구 용해를 통해 말초 혈액에서 nucleated 세포 농축을 순환하기 위해 개발되었습니다.

Nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 Microfluidic 혈액 용해 프로토콜

도구 및 화학 순차적으로 전기없이 샘플의 단백질이어서 핵산을 분리 설명되어 있습니다. 도구는 격리 화학은 고체 상 추출 원리에 기초하는 동안 전송 피펫 내에서 개최 sorbent 구성되어 있습니다. 격리된 macromolecules는 immuno 기반 및 PCR 기반 assays에 의해 분석할 수 있습니다.

전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

이 동영상은 실리카로 코팅된 작은 자성 구슬인 자성 유리 입자(MGP)를 사용하여 전혈에서 핵산을 추출하는 기술을 보여줍니다. 용해 완충액을 사용하여 혈액 세포를 용해시키면 방출된 핵산이 실리카로 코팅된 MGP의 표면에 결합하여 샘플에서 분자를 추출합니다.

혈액에서 자성 유리 입자 매개 핵산 추출 기법

TruTip은 다공성, 모 놀리 식 바인딩 행렬 피펫 팁에 삽입 그것에 간단한 핵산 추출 기술입니다. 따라서, 샘플 준비 형식은 대부분의 액체 취급 장비와 호환되며, 높은 처리량 임상 응용 및 샘플 유형에 여러 매체에 사용할 수 있습니다.

일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

항 레트로 바이러스 치료 (ART)를 실패한 HIV-1에 감염된 개인에 대한 약제 내성 검사는 미래의 치료법을 안내하고 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 높은 HIV의 유행하지만 자원 제한 설정에서 최적화 개인과 집단의 건강 결과는 궁극적으로 저렴하고 접근 약제 내성 유전자형과 해석 방법이 필요합니다.

자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

추가 분석을 위한 다양한 성분을 얻기 위해 전혈을 처리하는 방법론을 간략하게 설명합니다. 당사는 비임상 환경에서 전혈 샘플의 빠르고 높은 처리량의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 최적화했습니다.

지역 사회 기반의 설정에서 획득 샘플의 신속한 분별 및 전체 혈액 성분의 분리

우리는 여기에서 정량적 PCR에 의해 검출 된 전혈로부터 HIV 프로 바이러스 DNA의 단순하고 신속한 종이 기반의 DNA 추출 방법을 설명한다. 이 프로토콜의 다른 유전자 마커의 검출 또는 다른 증폭 방법을 이용하여 사용하기 위해 확장 될 수있다.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

여기에서 우리는 VirWaTest를 제시, 이는 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스의 농도 및 검출을위한 간단하고 저렴하고 휴대용 방법입니다.

VirWaTest, 물 샘플에서 바이러스 검출을 위한 사용 시점 방법

시민 과학 프로젝트는 SARS-CoV-2에 대한 환경 샘플을 수집하기 위해 샌디에고 주민을 모집하도록 설계되었습니다. 다국어 웹 기반 플랫폼은 사용자 친화적인 모바일 장치 인터페이스를 사용하여 데이터 제출을 위해 만들어졌습니다. 실험실 정보 관리 시스템은 실시간 결과 추적을 통해 지리적으로 다양한 수천 개의 샘플을 수집할 수 있도록 했습니다.

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

이 프로토콜은 오픈 소스 자동화를 활용하여 타액 샘플의 RT-qPCR 분자 테스트를 수행하는 SARS-CoV-2 진단 방법을 설명합니다. 이 확장 가능한 접근 방식은 임상 공중 보건 감시뿐만 아니라 소규모 대학 실험실의 용량을 늘리는 데 적용될 수 있습니다.

오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

배우세요 전체 혈액에서 바이러스 핵산을 신속하게 추출하는 수동 방법을. 장비 없이 현장 병원에서도 사용 가능하며, 의료진이 즉시 진단할 수 있어 환자 치료 결과를 개선합니다.

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

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