전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

이 방법은 바이러스 감염 징후가 있는 환자의 현장 진단을 수행할 때 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 실험실 장비와 전기 없이 수행할 수 있으므로 병원 병동에서 수행할 수 있다는 것입니다. 혈액 채취 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 의사 안데르스 폼가드(Anders Fomsgaard)와 과학자 모르텐 라스무센(Morten Rasmussen

채혈 튜브를 준비하는 것으로 시작합니다. 3ML 주사기에 부착된 25게이지 1인치 바늘을 사용하여 1.6ML의 상업용 용해 버퍼를 4ML EDTA 진공관에 주입합니다. 혈액 채취를 위해 채혈 튜브의 진공을 유지하는 것이 중요합니다.

따라서 항상 바늘을 사용하여 용해 완충액을 채혈관에 주입하십시오. 그런 다음 960 마이크로 리터 부피의 자성 유리 입자 또는 MGP를 완전히 다시 현탁하고 라벨이 붙은 1.8ML 튜브로 옮깁니다. 다음으로 세척 버퍼 1의 4ML를 WB-1.1.5ML이라고 표시된 4.5ML 튜브에, 2개의 세척 버퍼를 WB-2라고 표시된 3.6ML 튜브에, 세탁 버퍼 3ML를 WB-3이라고 표시된 4.5ML 튜브에 피펫으로 넣습니다.

마지막으로 EB라고 표시된 1.8ML 튜브에 100마이크로리터의 용출 완충액을 추가하고 튜브를 사용할 때까지 실온에 둡니다. 환자로부터 전혈 정맥을 채취하려면 작은 구멍 확장 튜브가 있는 버터플라이 바늘과 용해 완충액이 들어 있는 미리 준비된 채혈 진공관 중 하나를 사용합니다. 환자의 팔을 아래쪽 위치에 놓습니다.

나비 바늘을 환자의 정맥에 삽입하고 채혈 진공관을 소구멍 확장에 부착합니다. 혈액 수집 후에 관을 5 10 배 튀겨서 관의 내용을, 섞으십시오. 70% 에탄올을 사용하여 튜브 외부를 소독합니다.

그런 다음 바이러스 비활성화를 위해 실온에서 20분 동안 튜브를 배양합니다. 채취한 혈액에서 핵산을 정제하려면 진공관을 5회에서 10회 정도 손으로 뒤집어 튜브의 내용물을 다시 혼합합니다. 준비된 MGP 분취액을 채혈관에 직접 붓습니다.

사용하지 않은 채혈 튜브의 새 뚜껑을 샘플이 들어 있는 튜브에 놓습니다. 뚜껑에 손가락을 대고 튜브가 단단히 닫혔는지 확인하고 튜브의 내용물을 5-10회 뒤집어 섞습니다. 튜브를 마그네틱 홀더에 넣고 뚜껑에 손가락을 대고 튜브가 단단히 닫혔는지 확인합니다.

그런 다음 튜브가 있는 마그네틱 홀더를 몇 번 뒤집어 MGP가 자석이 있는 튜브 측면에 모이기 전에 분산시킵니다. 튜브의 뚜껑을 제거하고 일회용 피펫을 사용하여 튜브의 내용물을 50ML 수집 튜브에 버립니다. 준비된 WB-1 분취액을 채혈 튜브에 직접 붓고 튜브의 뚜껑을 닫습니다.

내용물을 5-10회 손으로 섞습니다. 그런 다음 자석을 사용하여 튜브 측면의 구슬을 수집하고 이전과 같이 액체를 제거합니다. 준비된 WB-2 분취액에 비드를 다시 현탁시킨 다음 용액을 버리고 준비된 WB-3 분취액으로 절차를 반복합니다.

마지막으로, 마그네틱 홀더에서 튜브를 제거하고 준비된 EB 부분 표본을 채혈 튜브에 직접 붓습니다. 튜브에 뚜껑을 놓고 손가락으로 5-10번 두드려 MGP를 다시 매달아 놓습니다. 마지막으로, 1.5ML 일회용 피펫을 사용하여 다시 현탁된 MGP 한 방울을 다운스트림 핵산 증폭 반응 혼합물로 전달합니다.

PCR 반응에 하나의 액적만 이동하기 전에 MGP를 완전히 다시 현탁해야 합니다. 개념 증명을 입증하기 위해, 최근 기니 남부에서 발생한 에볼라 바이러스 표준의 10배 희석 또는 3가지 농도의 엡스타인 바 바이러스로 음성 전혈을 스파이크했습니다. 추출된 핵산은 사내 바이러스 특이적 R2 qPCR 또는 qPCR로 분석했습니다.

교차 임계값(CT)이 낮을수록 바이러스 게놈 복제 수가 높아집니다. 여기서, 에볼라 바이러스의 농도가 서로 다른 스파이크된 전혈이 에볼라 바이러스 특이적 램프에 의해 검출되었습니다. 스파이크된 전혈 샘플에서 바이러스의 최종 농도는 X축에서 볼 수 있고 양성까지의 시간(분)은 Y축에서 볼 수 있습니다.

여기서, 전혈은 C형 간염 WHO의 표준화된 혈청 샘플을 10배 희석하여 HCV 특이적 RT qPCR에 의한 검출로 스파이크되었습니다. 마지막으로, 이 이미지는 Epstein Barr 바이러스 양성 전혈에 대한 Epstein Barr 바이러스 특이적 램프 반응의 결과를 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 지정된 lysis 결합 버퍼를 사용하는 것이 중요합니다.

이것은 중요한 단계이며 방법에 대한 중요한 시약입니다. 이 용해 결합 버퍼는 샘플에서 바이러스를 비활성화합니다. 이 기술에 따라 램프 및 PCR과 같은 다양한 분자 검출 방법을 수행할 수 있으므로 감별 진단을 수행할 수 있습니다.