벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

이 방법을 통해 학부생들은 철 결합 금속 효소를 신속하게 정제한 다음 해당 단백질을 사용하여 교육 실험실의 범위 내에서 구조와 기능에 대한 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비헴 철 결합 효소에 적용할 수 있다는 것입니다. 학부생이 접근할 수 있으며 교육 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 루어 잠금 배출구가 장착된 1.5 x 20cm 컬럼, 루어 잠금 피팅이 포함된 상부 캡, 수지 입자를 유지하기 위한 하단 베드 지지대를 구합니다. 흐름을 제어하기 위해 스톱콕이 있는 하단 루어 잠금 피팅을 장착합니다. 다음으로, 이전에 섭씨 4도에서 보관했던 20% 에탄올에 니켈 결합 니트릴로아세트산 수지 50% 슬러리가 들어 있는 병을 얻습니다.

병을 부드럽게 휘젓어 수지를 고르게 다시 매달아 놓습니다. 실온에서 작업하려면 눈금이 매겨진 피펫을 사용하여 2mm의 슬러리를 빼내고 컬럼으로 옮깁니다. 여분의 저장 용액이 수지에서 배출된 후 파스퇴르 피펫을 사용하여 최소 30ml의 냉각 용해 결합 완충액을 조심스럽게 첨가하고 수지 표면을 방해하지 않도록 합니다.

튀는 것을 방지하기 위해 기둥의 벽 아래로 버퍼를 실행하십시오. 버퍼가 중력에 의해 컬럼에서 천천히 배출되어 수집 비커로 배출되도록 하여 수지를 평형화합니다. 시작하려면 마개를 열고 나머지 용해 결합 완충액이 니켈-NTA 수지를 통해 중력에 의해 배출되도록 하여 cell-free 미처리 추출물을 추가하기 위해 nickel-NTA 컬럼을 준비합니다.

버퍼가 완전히 배수되고 수지 표면이 노출되면 마개를 닫으십시오. 다음으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 무세포 미처리 추출물을 수지에 조심스럽게 피펫으로 넣고 표면을 방해하지 않도록 주의합니다. 튀는 것을 방지하기 위해 조잡한 추출물을 기둥 벽 아래로 실행하십시오.

모든 미가공 추출물이 컬럼으로 옮겨진 후 컬럼이 중력에 의해 배수될 수 있도록 마개를 엽니다. 추후 분석을 위해 100마이크로리터의 플로우 스루를 수집합니다. 짧은 길이의 플라스틱 튜브를 사용하여 10ml 루어 잠금 주사기를 컬럼 캡에 연결합니다.

실린지 플런저를 당겨 빼낸 다음 컬럼 상단에 컬럼 캡을 단단히 채웁니다. 플런저를 부드럽게 압축하면서 용리액을 눈금이 매겨진 실린더에 모아 유속을 수동으로 평가합니다. 분당 1밀리리터에서 2밀리리터 사이의 속도는 수지 및 실험 설정과 호환됩니다.

유속이 느려짐에 따라 주사기 플런저의 압축을 부드럽게 증가시킵니다. 적용된 액체의 메니스커스가 수지 베드 위로 5-10밀리리터에 도달하면 컬럼 캡과 부착된 핸드 펌프를 제거하여 수지에 공기가 유입되는 것을 방지합니다. 남은 부피가 중력에 의해 배출되도록하십시오.

미처리 추출물의 배수가 완료되고 수지 표면이 다시 노출된 후 파스퇴르 피펫을 사용하여 수지 표면을 방해하지 않도록 주의하면서 약 30ml의 냉각 세척 버퍼를 컬럼에 조심스럽게 추가합니다. 마개를 열고 세척 버퍼가 컬럼을 통해 배수되도록 합니다. 컬럼이 배출되는 동안 분획 수집을 위해 16개의 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 부착합니다.

버퍼가 완전히 배수되고 수지 표면이 다시 노출되면 마개를 닫으십시오. 파스퇴르 피펫을 사용하여 약 30ml의 냉각 용출 완충액을 컬럼에 조심스럽게 첨가하고 수지 표면을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 마개를 천천히 열어 용출 버퍼가 폴리히스티딘 태그가 지정된 단백질을 컬럼에서 용리할 수 있도록 합니다.

표시된 각 마이크로 원심분리기 튜브에 1ml의 용리액을 수집합니다. 단백질을 검사한 후, 단백질을 함유한 분획을 깨끗한 원뿔형 튜브에 결합하십시오. 금속 이온 보조인자의 재구성을 진행하거나 섭씨 영하 80도에서 3밀리리터 분취액으로 단백질을 동결합니다.

금속의 재구성을 시작하려면 용리 완충액에 현탁된 정제된 효소의 3ml 분취액을 얼음 위에 올려 놓습니다. 튜브에 있는 단백질의 부피를 사용하여 샘플에서 각각의 최종 농도가 12.5밀리몰이 되도록 필요한 아스코르브산나트륨과 디티오트레이톨의 양을 계산합니다. 고체 아스코르브산나트륨과 디티오트레이톨을 넣고 부드럽지만 완전히 섞어 완전히 녹입니다.

1밀리리터의 고체 황산철 헵타하이드레이트 알갱이 몇 개를 계량지 한 장에 두드립니다. 과립 위에 종이를 접고 금속 주걱의 평평한 면으로 부수십시오. 생성된 분말 알갱이를 단백질 용액이 들어 있는 튜브에 추가합니다.

소용돌이가 섞여 장밋빛 분홍색이 됩니다. 튜브의 뚜껑을 덮고 분홍색 용액을 얼음 위에서 10분에서 30분 동안 배양합니다. 분홍색은 시간이 지남에 따라 희미해집니다.

겔 여과의 경우 1.5 x 12cm 컬럼에 10ml의 구형 폴리아크릴아미드 겔로 충전된 겔 여과 컬럼을 사용하며, 이 컬럼에는 10ml 저장소도 장착되어 있습니다. 그런 다음 text 프로토콜에 설명된 대로 열을 평형화합니다. 버퍼가 컬럼에서 배수되고 상부 베드 지지대가 노출되면 스톱콕을 닫습니다.

철, 2 개의 재구성 된 금속 효소의 3 밀리리터 용액을 노출 된 상부 침대 지지대에 피펫팅합니다. 마개를 열고 전체 3 밀리리터 샘플이 중력에 의해 컬럼에 들어가도록합니다. 처음 3ml의 용리액을 버립니다.

용액을 처리하는 동안 형성되는 분홍색은 컬럼 상단에 갇히게 됩니다. 컬럼 드립이 멈추고 상부 베드 지지대가 노출되면 4ml의 겔 여과 완충액을 추가하고 8.5ml 분획 이상의 용리액 4ml를 수집합니다. 단백질 함유 분획을 결합한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플의 분석 또는 보관을 진행합니다.

이 연구에서 학생들은 폴리히스티딘 태그가 붙은 비헴철 결합 디옥시게나제를 정제한 후 재구성했습니다. SDS-PAGE 분석은 태그가 지정된 단백질이 효과적으로 정제되었음을 보여줍니다. iron two로 재구성하고 후속 겔 여과 후 정제된 L-dopa dioxygenase의 효소 작용에 대한 학생 수집 활동 데이터가 여기에 나와 있습니다.

데이터 수집이 시작되기 전 5초의 지연은 이 기술을 처음 실행하는 학생들에게 일반적입니다. 정상 상태 분석은 진행 곡선을 피팅하여 결정된 운동 매개변수가 발표된 결과와 일치함을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 철분이 너무 많으면 단백질이 침전될 수 있으므로 철분이 많다고 해서 더 좋은 것은 아니라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

단백질의 3-5몰 초과분에 있는 철 농도는 충분합니다. 이 절차에 따라 학생들은 용액 구조를 측정하고 효소 또는 기질 의존성 화학을 살펴보기 위한 추가 실험을 수행하여 반응 메커니즘에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.