Name: 벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 배우세요 비헴 철결합 디옥시게나제의 금속 친화성 크로마토그래피 정제 및 재구성 방법을 학부 실험실에서 적용하여 효소 구조와 기능을 탐구하세요. 이 기술은 생화학 교육에 효과적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 간행물은 부여 번호 아래 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반  체 1708237입니다.

1입니다. 정화에 대 한 준비
<ol><li>셀 무료 원유 추출의 준비<ol>
<li>대장균 (BL21) overexpressed 태그 polyhistidine metalloprotein25 50 mL 원뿔 튜브에 그의 9 ~ 10 g 셀 펠 렛을 얻습니다.</li>
		<li>셀 펠 릿 총 볼륨 ~ 45-50 ml의 9 ~ 10 g을 방 임시 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미)의 그램 당 5 mL를 추가 합니다. 해산을 장려 하기 위해 주기적으로 소용돌이입니다. 펠 릿, 냉동 면 미지근한 물 욕조에 녹여.</li>
		<li>얼음 물 목욕을 사용 하 여, 진정 세포 세포의 용 해에 대 한 준비에 ~ 3 ° C에 세포 현 탁 액. 참고:이 시점에서 세포 세포의 용 해 쥡니다, 비드 밀링 또는 다른 방법에 의해 가능 하다. 비드 밀링 때문에 급속 한, 상대적으로 저렴 한, 그리고 귀 보호를 필요 하지 않습니다 여기 증명 됩니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 챔버 밀링 50ml 비드 조립.</li>
		<li>채우기의 전체 절반 비드 밀 챔버 냉장-20 ° c.에 저장 된 0.1 m m 유리 구슬</li>
		<li>냉장된 셀 서 스 펜 션 챔버의 나머지와 4 ° C 세포/바인딩 버퍼를 사용 하 여 챔버를 완전히 채우기.</li>
		<li>비드 밀의 샤프트를 회전 하는 구슬 세포 현 탁 액을 혼합 작은 주걱을 사용 합니다.</li>
		<li>피펫으로와 모든 큰 거품을 제거 하 고에 뚜껑을 나사.</li>
		<li>어떤 누설에서 챔버 드라이.</li>
		<li>명확 하 고, 플라스틱 자 켓에 얼음의 약 1 컵, 얼음 가득 재킷과 나사 폐쇄로 채워진된 50 mL 챔버를 반전.</li>
		<li>모터에 얼음 외피 챔버를 보호 합니다.</li>
		<li>비드 밀 15,800 rpm에서 15 초 동안에 모터 설정 후 45 초 동안 휴식을 허용. 8 회 반복 한다.</li>
		<li>8 주기 완료 되 면 50 mL 또는 더 큰 튜브 고속 원심 분리 (25000 g x 이상)에 대 한 평가로 전체 세포 세포 현 탁 액을 가만히 따르다. 작은 세포 파편과 유리 구슬에 4 ° C에서 40 ~ 45 분 스핀 25000 x g에서 원심 분리기에 균형된 관의 쌍을 놓습니다. 참고: 50 mL 또는 고속 원심 분리에 대 한 평가 큰 튜브 사용할 수 없는 경우에서 centrifuging 여 유리 구슬 제거 작은 양의 세포 현 탁 액 (25 mL) 작은 volum에 decanted 수 있는 수익률 50 mL 원뿔 튜브에 2-3 분 동안 g x 1000-2000 e 튜브 고속 원심 분리에 대 한 평가.</li>
		<li>원심 분리가 완료 되 면 가만히 따르다, 노란색 셀 무료, 원유 추출 물 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브로. 알아서 하지 어떤 세포 파편을 전송.</li>
		<li>SDS 페이지26에 의해 정화의 나중에 분석 셀 무료 원유 추출의 작은 샘플을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아이맥 칼럼의 준비<ol>
<li>수 지 입자, Luer 잠금 콘센트 및 Luer 잠금 피팅을 포함 하는 상위 모자를 유지 하기 위해 낮은 침대 지원을 갖춘 1.5 x 20 cm 열을 가져옵니다. 흐름을 제어 하는 자 지와 Luer 잠금 콘센트에 맞게.</li>
		<li>안전 하 게 벤치탑에서 working, 링 스탠드에는 열을 탑재 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에 저장 된 20% 에탄올에 니켈 바인딩된 nitriloacetic 산 (Ni-NTA) 수 지의 50% 슬러리를 얻기</li>
		<li>부드럽게 균등 하 게 다시 중단 수 지 병을 소용돌이 친다.</li>
		<li>실내 온도에 및 벤치탑, 사용의 1 mL을 보장할 슬러리의 2 개 mL를 철회 졸업된 피펫으로 정착 수 지 바인딩 polyhistidine의 50-60 밀리 그램의 단백질, 태그와 열에 슬러리 전송에 작업.</li>
		<li>자 지를 열고 수 지에서 중력에 의해 배수 하는 과잉 스토리지 솔루션을 허용 합니다.</li>
		<li>자 지를 안전 하 게 닫으십시오</li>
		<li>파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 냉장된 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미) 추가 수 지-적어도 30 mL의 열. 알아서 하지 방해 수 지 표면. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.</li>
		<li>세포/바인딩 버퍼 컬렉션 비 커에 중력에 의해 열에서 천천히 배출 함으로써 수 지 equilibrate.</li>
		<li>세포/바인딩 버퍼는 대부분 물기를 때 세포의 용 해 버퍼의 ~ 5 mL 수 지 위에 때 버퍼의 흐름을 중지 하려면 자 지 닫고 열, 직 립, 진행 준비가 될 때까지 또는 최대 1 주에 대 한 탑재를 두고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 정화 태그 Polyhistidine 아이맥으로 대상의
<ol><li>워시 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 mM NaCl, 20mm 이미 pH 8) 및 차입 버퍼 (인산 염, 300 mM NaCl, 250 m m 이미 10% 글리세롤 pH 8 m 50 m)를 준비 합니다. 4 ° c.에 진정</li>
	<li>자 지를 열고 남은 세포/바인딩 버퍼 Ni NTA 수 지를 통해 중력에 의해 배수를 허용 하 여 Ni NTA 열 셀 무료 원유 추출의 추가 대 한 준비. 모든 버퍼는 물기와 수 지 표면 노출는 자 지를 닫습니다.</li>
	<li>파스퇴르 피펫으로, 신중 하 게 피펫으로 사용 하 여 셀 무료 원유 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용 수 지에 추출 합니다. 원유 추출 물 튀는 것을 방지 하려면 열 벽을 아래로 실행 합니다. 원유 추출 물 적용의 볼륨은 polyhistidine 태그 단백질;의 표현 수준에 따라 원유 추출의 총 볼륨 포함 50-60 밀리 그램 이하의 Ni NTA 수 지의 mL 당 대상 단백질의 (1.2.4 단계 참조).</li>
	<li>때 모든 원유 추출의 열으로 전송 되었습니다, 그래서 열이 중력에 의해 배수 할 수 있다는 자 지를 엽니다. 이 흐름을 통해 수 지-SDS 페이지에 의해 정화의 향후 분석을 위해 수집 100 μ에 바인딩되지 않은 단백질으로 구성 된다. 26
</li>
	<li>셀 무료 원유 추출의 점성 열의 중력 흐름을 상당히 느려질 수 있습니다. 흐름의 속도 높이려면 간단한 "손 펌프"를 적용:<ol>
<li>10 mL Luer 잠금 주사기를가지고 하 고 플라스틱 튜브 및 열 모자와 주사기 Luer 잠금 피팅 사이 짧은 길이 사용 하 여 열의의 모자를 연결 합니다. 주사기 플런저 밖으로 그리고 단단히 적합 열 상단 열 모자.</li>
		<li>부드럽게 수동으로 졸업된 실린더;에 eluent 수집 하 여 흐름 속도 평가 하는 동안 주사기의 플런저를 압축 분 당 1-2 mL의 수 지 및이 설치와 호환 됩니다. 부드럽게 유량으로 주사기 플런저의 압축을 증가.</li>
		<li>수 지에 공기의 도입을 방지 하려면 열 뚜껑을 제거 적용된 액체의 초승달 모양에 도달 하면 수 지 침대 위에 5-10 m m 손 펌프를 연결 및 중력에 의해 배수 하는 나머지 볼륨을 허용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 무료 원유 추출 물 배출 완료 하 고 수 지 표면에 다시 노출, 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 워시 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.</li>
	<li>자 지를 열고 워시 버퍼 열을 통해 배수를 허용 합니다. 이 프로세스는 수 지에서 약하게 바인딩된 단백질을 제거 합니다. Eluent는 삭제 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼를 배출 하는 동안 준비 16, 표시, 1 mL 분수를 수집 하기 위해 microcentrifuge 튜브.</li>
	<li>워시 버퍼는 물기, 수 지 표면에 다시 노출 되는 자 지를 닫습니다. 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 차입 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.</li>
	<li>자 지를 천천히 열고 열에서 태그 polyhistidine 단백질을 elute 차입 버퍼를 허용 합니다. 각 표시 된 microcentrifuge 튜브, 1 16-eluent의 1 mL를 수집 합니다.</li>
	<li>단백질 시 약 또는 악기 제조 업체27,28여 Bradford 분석 실험 또는 특정 방법에 따라 UV 보이는 분광학 등 색도계 단백질 분석 결과 사용 하 여 분수를 테스트 합니다. 같이, 색도계 분석 결과 Coomassie blue를 사용 하 여이를 축소 100 μ 볼륨 각 분수에서만 작은 볼륨을 희생 하기 위하여.</li>
	<li>색도계의 100 µ L 각 분수의 혼합 3 μ 시 약을 시험 하 고 수동으로 분수; 단백질의 존재를 나타내기 위해 어떤 색깔 든 지의 형성 탐지는 분석기와 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>단백질 분수 16에에서 있으면 1 mL 분수와 단백질에 대 한 분석 결과 정기적으로, 방출까지 계속 eluted 분수 이상 단백질의 상당한 금액을 포함.</li>
	<li>깨끗 한 원뿔 관으로 포함 하는 단백질 분수를 결합 하 고 나중에 분석 100 μ 샘플 SDS 페이지26에 의해 철회.</li>
	<li>금속 이온 공동 인자의 재구성으로 진행 하거나 3 mL aliquots-80 ° c.에 있는 단백질을 고정 그 10% 글리세롤 포함 한지는 차입에 버퍼가 cryoprotectant 동결 동안 순수 단백질을 안정.</li>
	<li>Ni NTA 열의 차입 완료 되 면, 즉, 모든 단백질은 열에서 고 분수에서 수집, 전달 열을 통해 차입 버퍼의 또 다른 25 mL 단기 저장을 위해 차입 버퍼의 ~ 5 mL에 4 ° C에 열을 저장 또는 장기 저장을 위한 20% 에탄올과 세포/바인딩 버퍼.</li>
</ol>3. Fe2 + 대상 단백질의 재구성
<ol><li>Fe2 + 의 추가 참고:이 예제에서 아미노산의 일종 dioxygenase 같은 효소 바인딩 비 heme 철 (II) 필요는 Fe2 + 이온 활동; 그러나, 철 (II)는, 철 (III), 쉽게 산화 하 고 전혀 어떤 철 없이 정화 단백질의 일부분.<ol>
<li>금속의 재구성을 시작 하려면 차입 버퍼에 순화 된 효소의 3 mL을 구하십시오. 냉동, 미지근한 물 목욕을 사용 하 여 빠르게 해 동 하 고 한 번 해 동, 얼음에 단백질을 넣어.</li>
		<li>튜브에 단백질의 볼륨을 사용 하 여, 나트륨 하는데 (198.1 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다. 또한, dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다.</li>
		<li>단단한 나트륨 하는데 및 DTT 추가 하 고 부드럽게, 그러나 철저 하 게, 완전히 분해를 혼합. 알아서 하지 지나치게 공격적 혼합 단백질 강 수 발생할. 단백질 견본을 철 (II) 황산 염 heptahydrate (MW 278.01 g/mol)의 작은 금액을 추가 합니다.</li>
		<li>몇 가지 1 철 소금, 수돗물의 충분히 작은 수량을 얻기 위하여 mm FeSO4•7H2O 밖으로 단단한 조각에의 립 종이 무게과 립, 종이 접고 고 금속 주걱의 편평한 측으로 그것을 분쇄.</li>
		<li>단백질의 튜브를 결과 분말의 입자를 추가 합니다.</li>
		<li>혼합 하는 소용돌이 장미빛 핑크 색 튜브에 표시 됩니다.</li>
		<li>단백질, 얼음에 10-30 분 출장의 분홍색 솔루션을 품 어. 핑크 색상 천천히 시간이 지남에 사라질 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤 여과<ol>
<li>약 6, 000의 분자량 제외 제한와 10 mL 저수지도 갖춘 1.5 x 12 cm 열 µ m 90-180의 수 화 입자 크기 범위 구형 polyacrylamide 젤 10 mL 포장 젤 여과 열을 사용 합니다. 열은 낮은 갖추고 상단 침대 지원 열에 수 지를 유지 하 고 수 지 침대 건조 실행에서 방지 30 um 다공성 폴 리 에틸렌 디스크의 형태로 확인 합니다. 젤 여과 열 링 스탠드를 탑재 합니다.</li>
		<li>사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 뚜껑을 제거 하 고 상단 침대 지원 위에 초과 버퍼에서 부 어.</li>
		<li>열, equilibrate에 버퍼 후속 분석 결과 및 저장, 예를 들어 50mm NaH2포4, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤과 호환 되는 저수지를 작성 하 여 시작 합니다.</li>
		<li>사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 버퍼의 흐름을 시작 하 여 노출 Luer 슬립 피팅 젤 여과 열의 아래쪽 끝에서 스냅. 열, Luer 슬립 끝에 자 지를 맞게 하지만 고 열 중력 드립에 허용.</li>
		<li>버퍼 열에서 뽑아가 고 상단 침대 지원 노출, 자 지, 닫고 노출된 상단 침대 지원에 솔루션 pipetting으로 열에 Fe (II) 재구성 metalloenzyme ~ 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>자 지를 열고 전체 3.0 mL 샘플 중력에 의해 열을 입력을 허용 합니다. Eluent의이 첫 3 mL을 삭제 합니다. 솔루션을 처리 하는 동안 형성 된 핑크 색상 열의 상단에 갇혀 있을 것입니다.</li>
		<li>열 물이 뚝뚝 떨어지는 중지 하 고 상단 침대 지원 노출, 열에 젤 여과 버퍼 (예를 들어, 50mm NaH2포4, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤)의 4 개 mL를 추가 합니다. 자 지를 열고 microcentrifuge 튜브 8 0.5 mL 분수는 eluent 수집 합니다.</li>
		<li>앞에서 설명한 대로 색도계 단백질 분석 결과 또는 UV 마주27,28 를 사용 하 여 단백질에 대 한 분수를 테스트 합니다.</li>
		<li>결합 단백질이 포함 된 분수.</li>
		<li>SDS 페이지 분석26에 대 한 샘플을 철회 한다.</li>
		<li>분석 결과 또는 샘플의 스토리지와 함께 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1188-1321">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321(1988).</li>
<li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687909630275">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li>
<li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwitzer%2C+RL+%22Experimental+Biochemistry%22">Experimental Biochemistry</a>. , Macmillan. (1999).</li>
<li>Boyer, R. <a target="_blank" href="https://www.pearson.com/us/higher-education/program/Boyer-Modern-Experimental-Biochemistry-3rd-Edition/PGM122783.html">Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition</a>. , (2001).</li>
<li>le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ale+Maire%2C+M+%22Laboratory+Guide+to+Biochemistry%2C+Enzymology%2C+and+Protein+Physical+Chemistry%3A+A+Study+of+Aspartate+Transcarbamylase%22">Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase</a>. , Springer Science & Business Media. (2012).</li>
<li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBettelheim%2C+FA+%22Laboratory+Experiments+for+General%2C+Organic%2C+and+Biochemistry%22">Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry</a>. , Thomson Brooks/Cole. (2013).</li>
<li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed065p901">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901(1988).</li>
<li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed068p430">Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430(1991).</li>
<li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+mutation+to+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li>
<li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students%3A+An+illustration+of+protein+expression+and+purification%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li>
<li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression%2C+purification%2C+and+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li>
<li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li>
<li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKay%2C+BK+%22Phage+Display+of+Peptides+and+Proteins%3A+A+Laboratory+Manual%22">Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual</a>. , Elsevier. (1996).</li>
<li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21591176">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li>
<li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li>
<li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+writing-intensive%2C+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%3A+A+Bimonthly+Publication+of+the+International+Union+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li>
<li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization%3A+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Known+structure%2C+unknown+function%3A+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li>
<li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/metalloenzymes-use-of-recombinant-protein-expression-and-affinity-tags-to-aid-identification-of-native-metal-ion-cofactors-2161-1009.1000132.php?aid=11177">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li>
<li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/3527600906.mcb.200400107/abstract">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li>
<li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470048672.wecb327/abstract">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li>
<li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="https://Link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-485-2:257">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e45">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="https://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li>
<li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2%2C3-dioxygenase%2C+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li>
<li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+overexpression%2C+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2%2C3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li>
<li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li>
<li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis%3A+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li>
<li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016748389390013H">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li>
<li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2%2C3-Dihydroxyphenylpropionate+1%2C2-Dioxygenase+%28MhpB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li>
<li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246%2C+His-199%2C+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2%2C3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li>
<li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC%2C+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li>
<li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li>
</ol>

저자 아무 공개 있다.

재조합 형 단백질을 아이맥에 의해 그들의 정화 polyhistidine 태그의 추가 생 화 확 적인 문학3,4,5, 효소 정화를 아이맥의 애플 리 케이 션에에서 거의 유비 쿼터 스 되는 생화학에 스파스, 남아 가르치는 실험실 및 게시 방법을 항상 교육의 자원 한계를 고려 하지 않습니다 연구소20. 또한, 교육 연구소에 아이맥의 사용 평가 활동 및 순수성, 효소는 이상적인 교육 활동의 아이맥 정화를 만드는 실험에 결합 될 때 가장 효과적입니다. 아이맥의 효소, metalloenzymes를 포함 하 여 교육 실험실에서의 정화에 응용 프로그램을 확장 하기 위해 안정적이 고 저렴 한 방법 필요 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 벤치탑 아이맥 또한 종속 iron(II)를 재구성 하 여 metalloproteins22아이맥의 응용 프로그램에서 한계를 해결 하는 동안 쉽게 구할 수 있고 저렴 한 실험실 공급을 사용 하 여 metalloenzyme, l 아미노산의 일종 dioxygenase 정화 게시. 8 학생 그룹에 대 한 소모품의 비용입니다 $500-600 그림 1 과 그림 2에서 설명 하는 분석 단계를 포함 하 여이 프로토콜을 실행 하는 학기 당 사이 예상 시 약 및 자료를 사용 하 여.
용이성은 Fe2 + 수에서 해리 아미노산 ligands24 와 Fe2 + 의 손쉬운 산화 O2 Fe3 +, 비-헤의 재구성으로 인해 재조합 metalloenzyme에 iron(II) 아미노산 킬레이트 화 되는 효소 정화의 일반적인 구성 요소입니다. 클래식 크로마토그래피를 사용 하면 일부 경우32, 철 분의 총 손실을 방지 하기 위해 가능 하다 그러나 철 (II)를 추가 하 여 다시 감소 시키는 대리인33,,3435, 의 존재는 더 자주, 36 및 과잉 철은 어떤 경우에는 혐 기성 분위기가37,,3839, 아래 자주 제거33,,3436, 복잡 모든 후속 분석 결과입니다. 클래식 크로마토그래피와 혐 기성 분위기의 연속 단계 학부 실험실,이 프로토콜의 개발을 자극에 대 한 현실 되지 않습니다.
동안 Ni NTA 열의 수동 준비 및 중력에 의해 크게 샘플의 처리는 추가 시간 및 노력 때 사전 패키지 된 열에 비해 크로마토그래피 계측 자동화, 수동 단계 허용에 대 한 실습 학습 과정의 뒤에 과학의 증가 이해에서 발생 하는 학생에 의해. 여기에 설명 된 조건 하에서 철 (II) 소금의 추가 초과 dithiothreitol에 특히 민감합니다. 학생 dithiothreitol의 과잉, 실수로 추가 강수량 이벤트가 높습니다. 우리는 도움이 필요 시 수량 계산 실험실 시간 벤치에 가장 효과적으로 사용할 수 있도록 실험실에 도착 하기 전에 수행 하는 학생을 발견 했다. 세포-세포 단백질 차입-하에서 전체 벤치탑 아이맥 정화-재구성 및 이후 실험실 기간 분석 결과 1 4 시간 실험 기간에 수행할 수 있습니다.

고정된 금속에 의해 히스티딘 태그의 chelation를 사용 하 여 호스트 유기 체의 추출 물에서 태그 polyhistidine 단백질의 정화의 첫 번째 보고서는 문학 19881,2입력. 그때 이후로, 재조합 단백질 및 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 그들의 정화 태그 polyhistidine 추가 되었다 생 화 확 적인 문학3,4,에에서 거의 유비 쿼터 스 5. 아이맥 정화 방법 자동된 크로마토그래피를 사용 하 여 벤치탑 및 스핀 열 형식을 구현할 수 있습니다. 친 화력 정화 방법, 특히 아이맥, 연구 실험실에서 널리 이용 된다, 그러나 그들은 보다 적게 일반적 학부 교육 연구소. 생화학 실험실에 대 한 가장 널리 사용 되는 실험실 교과서 정기적으로 치지 않는다 이러한 방법, 대신 더 전통적인 이온 교환 또는 염료 바인딩 크로마토그래피6,,78 선택 , 9. 예를 들어 앤더슨10 젖 산 효소의 정화 염료 바인딩에서 선호도 사용 하 고 소 우유 α-lactalbumin7,11 Boyer에 의해 정화 사용 니켈 nitriloacetic 산 행렬, 하지만 아무 재조합 폴 리 히스티딘 태그, 수 지에 대 한 단백질의 본질적인 선호도에 대신 의존. 일부 현대 학부 실험실 교과서 및 출판물 녹색 또는 빨간색 형광 단백질12,13와 같은 폴 리 히스티딘은 단백질 목표에 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 구현 14,15,16, 항 체 및 선택한 효소17,18,,1920, 심지어 알 수 없는 함수21일부. 확실 하 게, 효소의 정화는 교육 연구소에서 바람직 대상 수 수 분석 활동에 대 한 후속 세션에서 학생; 편에서 "진짜 과학"의 경험을 풍부 하 게 하기 때문에 사실, 실험실 경험의이 종류는 출판 하 고 학생 들의 학습에 도움이 결과 보고17,18,,2021. 생화학 실험실 스파스, 유지 및 게시 방법 일반적으로 사용할 수 있는 크로마토그래피 계측에 대 한 액세스를 감히 심지어 수 있습니다 효소 정화를 아이맥의 애플 리 케이 션 교실 실험실에서 사용 하는 아직, 그리고 20. metalloproteins, 특히 그 활동22에 필수적인 산화 환 원에 민감한 divalent 금속 묶는 아이맥의 응용 프로그램에 제한이 있다. 자주, 금속 이온은 분실 또는 정화 저조한 학부 실험실에 어울리지 비활성 효소 중 산화.
효소의 전체 1/3 바인딩 금속 이온23, 그리고 모든 형태의 생활23에 대 한 거의 보편적인 요구에도 불구 하 고 철 틀림 없이 enzymology에서 가장 금속 이온 중. 비 헤 Fe2 + 바인딩 효소는 아이맥; 중 특히 손실 및 금속의 산화 하는 경향이 heme는 Fe와2 + 수에서 해리 아미노산 ligands24용이성 같은 전용된 유기 ligand의 결여 때문에 아마도 또한, Fe2 + Fe3 + 산소 의존 산화 용액, 부정적인 자유 에너지 변화와 Fe3 +의 상대적인 안정성 때문에 자연입니다. 종종, 이러한 과제는 혐 기성 분위기 및/또는 비-아이맥 컬럼에 방법22의 사용에 의해 극복 된다. 이 문서에서는, 우리 벤치탑 정화는 Fe2 + 종속 metalloenzyme l 아미노산의 일종 dioxygenase 사용 하 여 간단 하 고 저렴 한 크로마토그래피 소모품, Fe2 +, 활성 사이트의 재구성에 의해 다음 아이맥의 사용을 시연할 예정 이다 하 고 효소 분석 실험입니다. 이러한 방법 6-12 학생 그룹의 우리의 자신의 학부 생화학 실험실에 있는 표준 및 효소 조사 학부 수준에서의 레 퍼 토리를 확장 하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 0.1mm 유리 구슬</td><td>BioSpec 제품</td><td>11079101</td><td>1파운드 각</td></tr><tr><td>50mL 원뿔형 튜브(나사 캡 포함), 멸균</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨, 일염기성</td><td>아크로스(Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산나트륨</td><td>아크로스(피셔)</td><td>AC35268-1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>철(II) 황산염 헵타하이드레이트</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur NiNTA 수지&nbsp;</td><td>Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column 크로마토그래피 컬럼 - 1.5 x 20cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&nbsp;</td><td>1.5 x 20cm, 35ml, 2개,&nbsp;</td></tr><tr><td>스톱콕 밸브, 편도, 여성에서 남성으로 루어</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>50</td></tr><tr><td>BD 10mL 루어-로크 주사기 팩 (비멸균, 바늘 없음)</td><td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>튜빙용 피팅: 1.6 mm 바브에서 여성 루어</td>까지 <td>Biorad</td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>튜브용 피팅: 1.6 mm 바브에서 남성 루어까지&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>7318225</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙(1.6mm ID/0.8mm 벽, 연동 펌프에서 0.2-5ml/분)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>1, 1.6mm ID/0.8mm 벽, 10m, 액체 취급용 저압 튜빙</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher(Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus(Bradford) 단백질 분석</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 스냅 캡, 1.5mL</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Fiserbrand 유니버설 피펫 펌프</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 트랜스퍼 피펫</td><td>피셔&nbsp;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG 탈염 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>상자 30</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE 5x 샘플 버퍼</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (샘플로 1:5 희석)</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 웰</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 gels</td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 큐벳, 메티아크릴레이트</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&nbsp;</td><td>500개 케이스</td></tr><tr><td>큐벳 캡 스퀘어 일회용</td><td>피셔</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-디하이드록시페닐알라닌)</td><td>아크로스</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>영구 장비:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 50mL 챔버&nbsp;</td><td>BioSpec Products</td><td>110803-50SS</td><td>1 챔버</td></tr><tr><td>BeadBeater</td><td>BioSpec Products</td><td>1107900-101</td><td>350 ml 폴리카보네이트 챔버, 로터 어셈블리, 모터 베이스, 얼음물 냉각 재킷 및 1파운드의 유리 구슬.</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 고속 PPCO, 50mL</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기영동 셀, Mini Precast Gels, 4-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>&nbsp; 4-gel 수직 전기영동 시스템, 전극 조립체, 동반 주행 모듈, 탱크, 전원 케이블이 있는 뚜껑, 미니 셀 버퍼 댐</td></tr><tr><td>PowerPac HC 전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>100&ndash; 120/220&ndash; 240V, 고전류 애플리케이션용 전원 공급 장치, UV</td></tr><tr>프로브 소프트웨어 <td>Shimadzu</td><td>UV-1800이 있는</td> 전원 코드 <td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>포함 Kintek Global Kinetic Explorer</td><td>Kintek Corp</td><td>버전 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 polyhistidine의 태그 metalloenzyme

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 태그 polyhistidine 단백질의 학부 학생 들에 의해 쉽게 마스터 그리고 현대 문학에서 가장 널리 사용 되 단백질 정화 방법 되고있다. 하지만, 산화 철, 민감한 금속에 특히 그들 금속 바인딩 단백질 친화성 크로마토그래피의 응용 프로그램은 종종 실험실 글러브 박스-일상적으로 학부에서 사용할 수 있는 장비에 대 한 액세스 제한 실험실입니다. 이 문서에서 설명 하는 절연, 아이맥 폴 리 히스티딘 태그의 정화 및 금속 이온 재구성, 산화 환 원 활성, 비 heme 철 바인딩 extradiol dioxygenase 및 다양 한 기판으로 dioxygenase의 분석 결과 대 한 우리의 벤치탑 메서드 농도 그리고 산소를 흠뻑 젖 게입니다. 이러한 메서드는 학부 학생 들에 의해 실행 되 고 액세스할 수 있고 주로 학부 기관에서 저렴 한 계측과 학부 교육 및 연구 실험실에서 구현.

이러한 대표적인 결과 BCM 341의 2 개의 과정 실험실 기간 동안이 프로토콜을 실행 그들은 학부 학생 들에 의해 수집 된: Muhlenberg 대학에서 실험 생화학. 그림 1 보여줍니다 20 kDa 폴 리 히스티딘의 정화의 결과 4 시간 교실 실험실 기간 동안 두 학부 학생에 의해 수행으로 metalloenzyme, l 아미노산의 일종 dioxygenase 태그와 같은 SDS 페이지 분석 후속 실험 기간 동안 학생입니다. 폴 리 히스티딘은 단백질이 효과적으로 정화 (그림 1, 2 차선). 폴 리 히스티딘 태그에 대 한 항 체를 사용 하 여 젤의 immunoblot 나타냅니다는 흐름-를 통해 (데이터 표시 되지 않음), 폴 리 히스티딘 태그 대상 단백질의 작은 금액을 손실 됩니다 가능성이 있기 때문에 대상 단백질에의 100 밀리 그램 양 보다 큰에 수 지의 바인딩 용량 초과 lysate.
그림 2 에서는 철 (II)와 여과 젤-후속 프로토콜에서 설명 된 대로 재구성 후 폴 리 히스티딘 태그 metalloenzyme 대상, l 아미노산의 일종 dioxygenase의 효소 반응에 학생 수집 활동 데이터를 보여 줍니다. 여기. 데드 타임 데이터 수집 전에 시작 5 초 처음으로이 기술을 실행 하는 학생 들의 전형 이다. metalloenzyme의 강력한 활동 게시 된 분석 결과 사용 하 고 정상 상태 운동 매개 변수 게시 결과29일치를 굴복 발견 되었습니다. 정상 운동 매개 변수 피팅 그림 2에 표시 된 진행률 곡선30 에 의해 결정 되었다 그러나, 기질 농도의 시리즈를 통해 수집 하는 초기 속도의 비 선형 최소 제곱법 피팅 가능한31똑같이 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> 그림 1입니다. 폴 리 히스티딘의 SDS 페이지26 분석 하기 전에, 동안과 정화 후 단백질을 태그. 레인 1-분자량 마커, 2 순화 단백질 (20 kDa) 게시물 Ni NTA, 4-셀 무료 원유 추출 물 정화, 5 이전-세포 파편 펠 릿 게시물 세포 '를 통해 3-Ni-NTA 흐름. 샘플 샘플/로딩 버퍼 x 5를 사용 하 여 준비 하 고 프리 카스트 4-20 %polyacrylamide 젤 젤 전기 이동 법 체계를 사용 하 여에 분리 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> 그림 2입니다. 정상 상태 분석 결과 철 (II)의 버퍼 (인산 50 mM, 200 mM NaCl, pH 8) 기판 (l 아미노산의 일종-5 µ M (빨강), 25 µ M (녹색), 50 µ M (블루))와 metalloenzyme를 (즉, l 아미노산의 일종 dioxygenase, 10µM)를 재구성 된다. 흔적 묘사 414nm에서 제품 형성. 흡 광도 데이터 지속적으로 분할 빔 스캐닝 자외선 보이는 분 광 계29에 1 mL 메타 크 릴 산 큐 벳을 사용 하 여 인수 했다. 원시 데이터는 Michaelis-Menten 정상 상태 근사 (KM 30.8 µ M ± 14.4, k고양이명백한 2.3-1 ± 0.05)30의 모델에 맞게 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 우리가 현재 벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 정화 태그 polyhistidine의 후속 재구성에 대 한 프로토콜, 비 heme 철 바인딩 dioxygenase 학부 교육 실험실에 적합.

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

이 방법을 통해 학부생들은 철 결합 금속 효소를 신속하게 정제한 다음 해당 단백질을 사용하여 교육 실험실의 범위 내에서 구조와 기능에 대한 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비헴 철 결합 효소에 적용할 수 있다는 것입니다. 학부생이 접근할 수 있으며 교육 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 루어 잠금 배출구가 장착된 1.5 x 20cm 컬럼, 루어 잠금 피팅이 포함된 상부 캡, 수지 입자를 유지하기 위한 하단 베드 지지대를 구합니다. 흐름을 제어하기 위해 스톱콕이 있는 하단 루어 잠금 피팅을 장착합니다. 다음으로, 이전에 섭씨 4도에서 보관했던 20% 에탄올에 니켈 결합 니트릴로아세트산 수지 50% 슬러리가 들어 있는 병을 얻습니다.병을 부드럽게 휘젓어 수지를 고르게 다시 매달아 놓습니다. 실온에서 작업하려면 눈금이 매겨진 피펫을 사용하여 2mm의 슬러리를 빼내고 컬럼으로 옮깁니다. 여분의 저장 용액이 수지에서 배출된 후 파스퇴르 피펫을 사용하여 최소 30ml의 냉각 용해 결합 완충액을 조심스럽게 첨가하고 수지 표면을 방해하지 않도록 합니다.튀는 것을 방지하기 위해 기둥의 벽 아래로 버퍼를 실행하십시오. 버퍼가 중력에 의해 컬럼에서 천천히 배출되어 수집 비커로 배출되도록 하여 수지를 평형화합니다. 시작하려면 마개를 열고 나머지 용해 결합 완충액이 니켈-NTA 수지를 통해 중력에 의해 배출되도록 하여 cell-free 미처리 추출물을 추가하기 위해 nickel-NTA 컬럼을 준비합니다.버퍼가 완전히 배수되고 수지 표면이 노출되면 마개를 닫으십시오. 다음으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 무세포 미처리 추출물을 수지에 조심스럽게 피펫으로 넣고 표면을 방해하지 않도록 주의합니다. 튀는 것을 방지하기 위해 조잡한 추출물을 기둥 벽 아래로 실행하십시오.모든 미가공 추출물이 컬럼으로 옮겨진 후 컬럼이 중력에 의해 배수될 수 있도록 마개를 엽니다. 추후 분석을 위해 100마이크로리터의 플로우 스루를 수집합니다. 짧은 길이의 플라스틱 튜브를 사용하여 10ml 루어 잠금 주사기를 컬럼 캡에 연결합니다.실린지 플런저를 당겨 빼낸 다음 컬럼 상단에 컬럼 캡을 단단히 채웁니다. 플런저를 부드럽게 압축하면서 용리액을 눈금이 매겨진 실린더에 모아 유속을 수동으로 평가합니다. 분당 1밀리리터에서 2밀리리터 사이의 속도는 수지 및 실험 설정과 호환됩니다.유속이 느려짐에 따라 주사기 플런저의 압축을 부드럽게 증가시킵니다. 적용된 액체의 메니스커스가 수지 베드 위로 5-10밀리리터에 도달하면 컬럼 캡과 부착된 핸드 펌프를 제거하여 수지에 공기가 유입되는 것을 방지합니다. 남은 부피가 중력에 의해 배출되도록하십시오.미처리 추출물의 배수가 완료되고 수지 표면이 다시 노출된 후 파스퇴르 피펫을 사용하여 수지 표면을 방해하지 않도록 주의하면서 약 30ml의 냉각 세척 버퍼를 컬럼에 조심스럽게 추가합니다. 마개를 열고 세척 버퍼가 컬럼을 통해 배수되도록 합니다. 컬럼이 배출되는 동안 분획 수집을 위해 16개의 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 부착합니다.버퍼가 완전히 배수되고 수지 표면이 다시 노출되면 마개를 닫으십시오. 파스퇴르 피펫을 사용하여 약 30ml의 냉각 용출 완충액을 컬럼에 조심스럽게 첨가하고 수지 표면을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 마개를 천천히 열어 용출 버퍼가 폴리히스티딘 태그가 지정된 단백질을 컬럼에서 용리할 수 있도록 합니다.표시된 각 마이크로 원심분리기 튜브에 1ml의 용리액을 수집합니다. 단백질을 검사한 후, 단백질을 함유한 분획을 깨끗한 원뿔형 튜브에 결합하십시오. 금속 이온 보조인자의 재구성을 진행하거나 섭씨 영하 80도에서 3밀리리터 분취액으로 단백질을 동결합니다.금속의 재구성을 시작하려면 용리 완충액에 현탁된 정제된 효소의 3ml 분취액을 얼음 위에 올려 놓습니다. 튜브에 있는 단백질의 부피를 사용하여 샘플에서 각각의 최종 농도가 12.5밀리몰이 되도록 필요한 아스코르브산나트륨과 디티오트레이톨의 양을 계산합니다. 고체 아스코르브산나트륨과 디티오트레이톨을 넣고 부드럽지만 완전히 섞어 완전히 녹입니다.1밀리리터의 고체 황산철 헵타하이드레이트 알갱이 몇 개를 계량지 한 장에 두드립니다. 과립 위에 종이를 접고 금속 주걱의 평평한 면으로 부수십시오. 생성된 분말 알갱이를 단백질 용액이 들어 있는 튜브에 추가합니다.소용돌이가 섞여 장밋빛 분홍색이 됩니다. 튜브의 뚜껑을 덮고 분홍색 용액을 얼음 위에서 10분에서 30분 동안 배양합니다. 분홍색은 시간이 지남에 따라 희미해집니다.겔 여과의 경우 1.5 x 12cm 컬럼에 10ml의 구형 폴리아크릴아미드 겔로 충전된 겔 여과 컬럼을 사용하며, 이 컬럼에는 10ml 저장소도 장착되어 있습니다. 그런 다음 text 프로토콜에 설명된 대로 열을 평형화합니다. 버퍼가 컬럼에서 배수되고 상부 베드 지지대가 노출되면 스톱콕을 닫습니다.철, 2 개의 재구성 된 금속 효소의 3 밀리리터 용액을 노출 된 상부 침대 지지대에 피펫팅합니다. 마개를 열고 전체 3 밀리리터 샘플이 중력에 의해 컬럼에 들어가도록합니다. 처음 3ml의 용리액을 버립니다.용액을 처리하는 동안 형성되는 분홍색은 컬럼 상단에 갇히게 됩니다. 컬럼 드립이 멈추고 상부 베드 지지대가 노출되면 4ml의 겔 여과 완충액을 추가하고 8.5ml 분획 이상의 용리액 4ml를 수집합니다. 단백질 함유 분획을 결합한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플의 분석 또는 보관을 진행합니다.이 연구에서 학생들은 폴리히스티딘 태그가 붙은 비헴철 결합 디옥시게나제를 정제한 후 재구성했습니다. SDS-PAGE 분석은 태그가 지정된 단백질이 효과적으로 정제되었음을 보여줍니다. iron two로 재구성하고 후속 겔 여과 후 정제된 L-dopa dioxygenase의 효소 작용에 대한 학생 수집 활동 데이터가 여기에 나와 있습니다.데이터 수집이 시작되기 전 5초의 지연은 이 기술을 처음 실행하는 학생들에게 일반적입니다. 정상 상태 분석은 진행 곡선을 피팅하여 결정된 운동 매개변수가 발표된 결과와 일치함을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 철분이 너무 많으면 단백질이 침전될 수 있으므로 철분이 많다고 해서 더 좋은 것은 아니라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.단백질의 3-5몰 초과분에 있는 철 농도는 충분합니다. 이 절차에 따라 학생들은 용액 구조를 측정하고 효소 또는 기질 의존성 화학을 살펴보기 위한 추가 실험을 수행하여 반응 메커니즘에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

benchtop-immobilized-metal-affinity-chromatography-reconstitution

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 클로스트리듐 디피실리 박테리아에서 히스티딘 태그가 지정된 피로포스포키나제 효소를 정제하는 니켈 친화성 크로마토그래피 기술을 보여줍니다.

니켈 친화성 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 박테리아 세포 용해물에서 폴리히스티딘 표지 재조합 단백질을 정제하는 기술

이 비디오는 메탈로펩티다아제에 대한 재조합 항체 생산 절차를 보여줍니다. 항체, 녹색 형광 단백질 및 항생제 내성에 대한 유전자를 운반하는 재조합 플라스미드는 리포펙타민을 사용하여 상피 세포로 transfection됩니다. 형질주입된 세포를 선택하고 배양하여 재조합 항체를 생성합니다.

메탈로펩티다아제에 대한 재조합 항체를 생산하는 방법

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

강력한 검출 시약은 새로운 말라리아 진단 도구를 개발하기 위해 점점 더 많은 필요성을 느끼고 있습니다. 이리듐(III) 프로브는 히스티딘이 풍부한 말라리아 단백질 바이오마커가 있는 상태에서 오래 지속되는 발광 신호를 방출하도록 설계되었습니다. 용액 내에서 또는 자성 입자에 고정된 단백질을 검출하면 응용 분야에 유연성을 제공합니다.

말라리아 단백질 바이오 마커 히스티딘 풍부한 단백질-II의 검출을위한 이리듐 (III) 발광 프로브

유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 연결된 크기 배제 크로마토그래피는 생물학적 시료에서 직접 금속 단백질의 다양성 변화를 측정할 수 있는 강력한 도구입니다. 여기에서는 분자 질량 및 알려지지 않은 단백질과 관련된 금속의 양을 추정하는 데 사용되는 일련의 금속 단백질 표준물질에 대해 설명합니다.

크기 배제 ICP-MS를 이용하여 정량적 Metalloproteomic 분석을위한 표준

이 프로토콜 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 모 세관 젤 전기 이동 법 및 충전된 ligands에 대 한 빠른 바인딩 심사를 단백질 샘플의 특성을 결합합니다. 그것은 본질적으로 무질서 단백질 등 유연한 구조를 가진 단백질에 대 한 다른 conformers에 대 한 바인딩 차이 확인 하려면 권장.

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

여기, 히스티딘 태그 pyrophosphokinase 효소 정화 및 radiolabelled 기질 그리고 효소 활동 체 외에 대 한 분석 결과를 제품의 얇은 층 크로마토그래피를 이용 하는 방법을 설명 합니다. 효소 활동 분석 결과 모든 키, 뉴클레오티드 있고, 또는 인광 체 전송 반응의 메커니즘 포함 뉴클레오티드 3 인산 염 가수분해에 광범위 하 게 적용 됩니다.

정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

우리는 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 제조 된 샘플에 도입 된 금속의 쉬운 정량화를위한 분석법을 제시합니다. 이 방법은 하이드록시나프톨 블루를 비대금속 표시기로 사용하고 UV-Vis 분광광도계를 검출기로 사용합니다.

고정화 금속 친화성 크로마토그래피에서 금속 침출정 정량화

여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.  본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

이 기사에서는 6X-histidine 태그로 라벨링된 인간 재조합 단백질인 flap endonuclease 1(FEN1)의 친화성 정제 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 태그된 단백질의 정제를 위해 두 개의 뚜렷한 고정화된 금속 이온 컬럼을 사용하는 것을 포함합니다.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

배우세요 비헴 철결합 디옥시게나제의 금속 친화성 크로마토그래피 정제 및 재구성 방법을 학부 실험실에서 적용하여 효소 구조와 기능을 탐구하세요. 이 기술은 생화학 교육에 효과적입니다.

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

더 많은 동영상 탐색