Name: 꼬마 체: 낮은 악기와 작은 Multicellular 유기 체를 정렬에 대 한 방법론 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans를 체형별로 정렬하고 세척하는 효율적인 방법을. 맞춤형 도구를 사용하여 분자생물학 실험에 필요한 특정 발달 단계의 선충을 정확하게 선택할 수 있습니다.

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저자는 그녀의 초기 공헌 연구 설계에 대 한 헤더 Currey 박사 Swarup Mitra 원고 그의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 마이클 B. 해리스 박사 의견, 개선,이 방법론의 시범 생산 지원을 감사 하 고 싶습니다. 변종 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 이 간행물에서 보고 된 연구에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 UL1GM118991, TL4GM118992, 또는 RL5GM118990 국립 보건원의와 제도적 개발 상 수상 (IDeA는)에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 종합 의료 과학 보조금 번호 5P20GM103395-15 국립 보건원의. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. UA는 AA/EO 고용주 및 교육 기관 및 개인에 대 한 불법 차별 금지: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. 꼬마 체 건설 및 사용
<ol><li>
건설 프로토콜
	<ol>
<li>50 mL 원뿔 튜브 (그림 1A)에서 2 뚜껑을 얻을.</li>
		<li>(하단, 그림 1B에서 볼) 때 뚜껑의 안쪽 입술 안쪽 중심 영역을 제거 분 젠 버너와 뜨거운 금속 프로브 또는 납땜을 사용 하 여 또는 드릴 비트를 강화. 참고: 상해의 위험이 있기 때문에 블레이드 보다는 플라스틱 뚜껑을 열을 사용 하 여입니다.</li>
		<li>청소 하 고 잘라 가장자리를 모래 톱 곡선된 파일 또는 로타리 연마 도구 (예를 들어, Dremel) 표면. 그림 1C참조.</li>
		<li>적절 한 지름 (그림 1D) monofilament 메시의 동그라미를 잘라. 이 위해, monofilament 나일론 메쉬 시트에 뚜껑을 추적 하 고 그려진 라인 안에 그냥 잘라.</li>
		<li>접착제 (그림 1E) 플라스틱에 적용 되 면 두 개의 뚜껑의 접착을 강화 하는 뚜껑의 위쪽 표면에 홈/슬래시 잘라.</li>
		<li>에탄올과 뚜껑을 깨끗 하 고 건조 그들을 보자.</li>
		<li>외부 가장자리를 유지 하는 두 뚜껑의 위쪽 표면에 cyanoacrylate 접착제를 적용 합니다. 참고: 접착제 조금 먼 길을 간다.</li>
		<li>하나 붙어 뚜껑 (그림 1 층)에 표 1에 따라 monofilament 메쉬를 하다. 메쉬; 위에 거꾸로 두 번째 뚜껑을 배치 두 뚜껑 함께 그들의 꼭대기를가지고 있어야 합니다. 단단히 함께 (그림 1G)을 누릅니다. 메쉬 긴장 된 인지 확인 합니다. 참고: 안전 조치로, 뚜껑에는 메쉬를 사용 하 여 족집게.</li>
		<li>접착제의 초기 레이어는 건조 되 면 뚜껑 사이의 외부 간격 주위 cyanoacrylate 접착제의 링을 적용 합니다. 이 무결성을 추가 하 고 떨어져 또는 새 어떤 필 링 방지 관대 한 수 있습니다.</li>
		<li>필터 monofilament 메시의 메시 기 공 크기와 레이블을 지정 합니다. 참고: 여기, 우리가 사용 하 여 두 개의 메시 기 공 크기-20 µ m, 50 µ m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
프로토콜을 사용 하 여
	<ol>
<li>미리 체 젖은.<ol>
<li>염 분 해결책, M9 등 플라스틱 [5 g의 NaCl, 나2HPO46 g, KH2포4, 1 초순 H2O, L 그리고 MgSO4 (1 M)의 1 mL의 3 세대]17, 방울 양식까지 체의 센터를 통해 압축, 및 필터 아래쪽 (그림 2A)의 중심에서 drips. 필요에 따라 모양 아래쪽에 보풀 지우기 (예, Kimwipe)을 적용 하거나 메시에 수 분 물방울을 확산.</li>
			<li>50 mL 원뿔 튜브 위에 체를 놓습니다. '폐 튜브' 튜브 라벨 (그림 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>한 천 배지에서 C. 선 충 의 인구를 씻어.<ol>
<li>M9 버퍼와 접시 세척 하 고 한 번 (그림 2C)에 웜 포함 된 매체 monofilament 메쉬 1 mL의 위쪽에 배치. 메시의 중심에서 작동 해야 합니다. 모든 벌레는 접시에서 씻는 다. 참고: 일반적으로, 60 m m 플레이트 m 9의 3 mL 충분 하다.</li>
			<li>Pipetting에 벌레의 수를 최소화 하기 위해 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 접시에서와 메쉬 센터 (필요에 따라 반복)에 벌레를 이동.</li>
			<li>상단에서 M9 버퍼와 필터를 씻어. 다시, 메시의 센터에서 운영 하 고 그 지역에서 모든 벌레를 헹 굴에 있는지 확인 하십시오. 모든 박테리아와 작은 벌레는 메시를 통해 전달 되도록 필요한 만큼 여러 번 씻는 다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>체에서 크기 일치 하는 동물을 수확.<ol>
<li>단계의 새 컬렉션 튜브 (그림 2D)의 내부를 직면 하는 1.2.2.3 어른 벌레와 체의 상단에 새로운 50 mL 원뿔 튜브를 연결 합니다.</li>
			<li>첫 번째 관 (폐기물 관)을 제거 하 고 신속 하 게 체 고을 드롭릿에 마이그레이션 하는 것을 막기 위해 새로운 튜브를 뒤집어 (그림 2E). 참고: 무 균 필요 하지 않은 경우 사용 하 여 보풀 지우기 (예, Kimwipe) 윅 유체를 튀기기 전에 메시의 하단에서.</li>
			<li>새로운 위쪽 (그림 2F)에서 새로운 50 mL 튜브에 M9와 메쉬 린스. 다시, 메쉬 센터에서 운영 하 고 메시의 밑면에 작은 물방울을 유지 합니다.</li>
			<li>정착 하거나 부드럽게 아래로 회전 웜 허용 (예를 들어, < 16 x g) 약 1 분 (그림 2G).</li>
			<li>에 벌레, 펠 릿에서 버퍼 솔루션을 이상적으로 발음 > 0.5 mL, 또는 펠 릿을 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거.</li>
			<li>플라스틱 유리 NGM 접시에 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 웜 하 고 그들을 건조. 공간 여러 방울 밖으로 새로운 접시에 그래서 그들은 더 빠른 (그림 2 H)를 건조.</li>
		</ol>
</li>
		<li>체를 청소.<ol>
<li>에탄올과 역방향 삼 투 물으로 체를 부드럽게 하 고 철저 하 게 린스. 건조 하자.</li>
			<li>무기한 미래의 사용에 대 한 깨끗 한 용기에 그것을 저장 합니다.</li>
			<li>메시 "sag" 외관을 개발 했을 때 그것을 폐기.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 꼬마 체 정렬 방법의 유효성 검사
<ol><li>일반 유지 보수
	<ol>
<li>모든 실험에 대 한 문화 표준 선 충 류 성장 미디어17 에 벌레 (NGM의 1 L 펩, 한 천, 3 g의 NaCl, 이중 증 류 물, 5 mg/mL 콜레스테롤, 1 M CaCl2 의 1 mL의 1 mL의 975 mL의 17 g의 2.5 g의 구성 1 mL의 1 M MgSO4, 1m KHPO4, 25 mL 및 100 mg/mL 스의 0.5 mL) 25 ° c.에</li>
	</ol></li>
	<li>실험 치료 관리
	<ol>
<li>3 치료 그룹을 비교: 선택, fluorodeoxyuridine (FUDR), 그리고 꼬마 체.<ol>
<li>FUDR 치료 그룹에 대 한 NGM 미디어 어떤 자손 생산을 방지 하기 위해 100 μ M의 최종 농도를 100mg/mL FUDR을 추가 하 고 매일 음식 소모를 피하기 위해 신선한 NGM 접시에 벌레를 전송.</li>
			<li>선택 그룹에 대 한 선택 하 고 웜 백 금 루프를 사용 하 여 수동으로 전송 합니다.</li>
			<li>꼬마 체 치료 그룹에 대 한 1.2 단계를 수행 하 고 플라스틱 NGM 접시에 벌레.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>꼬마 체 백분율 수확량
	<ol>
<li>C. 선 충분류에 얼마나 효과적인 체는 계량, 25 ° C (즉, 달걀 누워 후 48 h)에서 성년의 날 1 세 동기 N2 동물을 성장 하 고 신선한 NGM 접시에 그들을 수확 하 여 그들을 전송 (총 N = 50 또는 N = 트 레 당 100 동물 atment 그룹)입니다.</li>
		<li>24 시간 복구의 새로운 NGM 번호판 인구 전송 후 다음 위의 꼬마 체와 프로토콜 (단계 1.2 참조) 하 고 성공적으로 전송 된 동물의 수를 계산.</li>
		<li>100 (%)을 곱한 전송의 시작 부분에 시작 번호에 비해 전송 하는 동물의 수의 비로 백분율 수확량을 계산 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan 분석 실험 참고: 일 2, 4, 6, 및 8 나이 동기화 N2 동물 25 ° c.에 유지에 대 한 성인 기의 운동 성 클래스, 인 두 펌프 속도 및 모두는 앞쪽 및 후부 부드러운 터치 응답의 healthspan 매개 변수를 점수<ol>
<li>추적 운동<ol>
<li>클래스를 기반으로 시스템 (A, B 및 C 클래스)에 따라 운동 성 점수를 할당 Herndon 외 의 방법에 따라 18. 통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 세 가지 실험 그룹의 효과 비교. 참고: 클래스 A 개인 일반, 정현파 패턴에서 자연스럽 게 이동합니다. 클래스 B 개인 현저 하 게 비 정현파 움직임에 이동 하 고 장려 운동 괴롭히는 필요할 수 있습니다. 클래스 C 개인 괴롭히는에 그들의 머리 또는 꼬리를 이동 하지만 agar 가로질러 이동할 수 없습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>인 두 펌프 속도<ol>
<li>1 분에 대 한 최종 배율 X 600 stereomicroscope에서 시각적으로 동물의 터미널 인 두 전구의 분쇄기 움직임을 계산 합니다.</li>
			<li>Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>터치 응답<ol>
<li>부드러운 터치 응답을 기록 하 고 3 개의 치료 그룹 사이 비교. Calixto 연구진이 설명 하는 방법에 따라 분석 실험을 수행 19.</li>
			<li>레코드는 앞쪽 및 후부 부드럽게 쓰 다듬어 속눈썹 선택 수직 꼬리 또는 동물의 머리 (5 x, 번갈아가 며 머리와 꼬리) 하 여 응답을 터치 합니다.</li>
			<li>앞쪽 및 후부 응답에 대 한 0 ~ 5의 규모에 1 점으로 선의 반대 방향으로 움직임을 점수.</li>
			<li>Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>통치 분석 결과
	<ol>
<li>25 ° c.에 성년의 날 2에 나이 동기 N2 동물 복제에 꼬마 체의 영향의 사용을 확인 하려면 성장</li>
		<li>달걀 누워 후 60 h 플래티넘 선택 또는 꼬마 체 새로운 NGM 번호판 동물을 전송 하 고 그들 복구에 4 h (20-30 분에 대 한 체질된 접시 건조).</li>
		<li>복구, 개별적으로 접시 속눈썹 통해 동물 NGM 번호판 선택 후 그들에 게 산란, 24 h 하 고 동물을 제거 합니다. 또 다른 24 h에 대 한 25 ° C에서 표준 상태 하에서 개발을 각 접시에 자손을 허용 합니다. 참고: 속눈썹 선택은 인간의 속눈썹 매니큐어와 파스퇴르 피 펫의 끝을 확보 하 고 에탄올으로 소독.</li>
		<li>실행 가능한 F1 세대 개인의 수를 계산 합니다. Α와 T-검정을 사용 하 여 통계 분석을 수행 = 0.05. 참고: 가능한 자손 계란 성공적으로 해치 고 일반 애벌레 사이클을 통해 그들의 개발을 시작 하는 것으로 간주 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 기자 스트레스 응답 분석 실험
	<ol>
<li>스트레스의 잠재적인 마커를 감지 하 세 가지 일반적으로 사용 되는 형광 기자 분석 수행: 스트레인 [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; 세포의 핵에 DAF 16::GFP 전 hsp-16.2 식 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; 그리고 잔디-3 식 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>각 분석 결과 대 한 문화 20 ° C에서 3 개의 치료 그룹에서 나이 동기 동물 및 성년의 날 3에 그들을 검토: 부정적인 제어를 사용 하 여 (매일, 수동으로 백 금 선택과 동물의 그룹 전송), (매일에 긍정적인 통제 백 금 선택 플러스 설립된 스트레스와 수동으로 동물의 그룹 전송), 그리고 꼬마 체 (체 동물을 통과 하 고 이미징 직전 NGM에 30 분 동안 복구 하도록 허용).</li>
		<li>DAF 16::GFP 분석 결과에서 열 충격을 30 분 동안 37 ° C에서 긍정적인 제어 동물20이미징 하기 전에. Hsp-16.2 분석 결과 대 한 열 충격 90 분,21이미징 하기 전에 20 h 긍정적인 제어 동물. Sod-3 분석 결과 대 한 이미징22전에 4 h 100 m m 파라콰트와 긍정적인 제어 동물을 취급 합니다.</li>
		<li>속눈썹 선택으로 즉시 벌레를 수확 하 고 벌레를 무력화 하는 36% poloxamer 407 계면 활성 솔루션의 1 μ와 coverslip에 탑재.</li>
		<li>다른 coverslip로 탑재 된 웜 샌드위치 표준 유리 현미경 슬라이드 및 이미지를 두 개의 coverslips 벌레는 거꾸로 형광 현미경 (80 X의 전반적인 확대)에 8 배 확대와 지속적인 노출 FITC 필터를 사용 하 여 탑재 합니다.</li>
		<li>DAF 16::GFP 분석 결과에서 세 그룹 간의 차이 감지, DAF 16::GFP 기자 (핵 기자 기자 cytosol, 그리고 중간에 있는 cytosolic 핵을 translocated 경우의 위치에 따라 동물 분류 기자 핵 그리고 cytosol에 위치한).</li>
		<li>통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 결과 비교 합니다. Hsp-16.2 및 잔디-3 식 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 α와 = 0.05와 Tukey의 임시 게시물 테스트 α = 0.05 머리 영역의 총 형광 비교 하.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다. 저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

여기, 우리 디자인 및 정렬 및 선 충 C.유지를 위한 도구로 서, 효과적인 꼬마 체의 사용을 소개 했다. 이 도구는 수동으로 개별 동물, 인구, 화학 치료 (예를 들어, FUDR), 그리고 더 비싼 방법 분리 동물의 세척을 따기 위해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 꼬마 체 효율적이 고 신속 하 게 (20 분 미만) 동물 (표 2)의 큰 혼합된 인구에서 자손을 정렬. 또한, 도구를 사용 하 여 효과가 없습니다 감지 독성 동물 healthspan (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6)에, 잘 설명된 유전 스트레스 기자 (그림 7, <strong class="xfig...

선 충 벌레, 꼬마 선 충, 최고의 모델 생물 이다. 실험실에 있는 그들의 경작의 간단 하 고 제어 특성, 뿐만 아니라 그들의 전체 게놈 시퀀스1 이며 각 셀의 개발 운명2알려져 있다. 이러한 기능을 구현, C. 선 충 유전자 연구에 대 한 널리 사용 되는 모델 생물 이다. 그러나, 이러한 유익한 특성 함께 연구자에 대 한 몇 가지 과제를 올. 그들의 빠른 생성 시간 때문에 C. 선 충 인구 음식에서 신속 하 게 실행할 수 있습니다 또는 여러 세대와 인구 혼합 되 고 발달 단계를 한 번에 제시. 따라서, 고체 선 충 성장 매체 (NGM)에서 수행 하는 실험 연구자 세균 식량 고갈 시키고 새로운 애벌레 개발 하기 전에 물리적으로 신선한 번호판 동물 이동에 필요 합니다. 이 자식 세대와 혼합 되 고에서 실험적인 인구를 방지 하는 데 필요한 동물의 빈번한 전송 지루한 될 수 있습니다. 아직도, 실험 동물 및 확장된 시간 포인트 (예, 성인 기에 DNA 또는 RNA 추출)의 둘 다 다 수 필요합니다. 이 정확 하 게 동기화 된 인구를 유지 하 고 전송 하는 동물의 많은 수의 문제 화합물.
C. 선 충 NGM에서 양식 전송의 현재 방법 따기 또는 세척 동물 격판덮개; 화학적 치료 동물 (예를들면, DNA 복제 억제 물 fluorodeoxyuridine 또는 FUDR); 또는 cytometry 정렬 다 잘 판에 동물을 사용 하 여. 따기 개인 또는 여러 동물3,4를 수동으로 전송 하는 얇은 백 금 철사 또는 속눈썹로 만든 손 도구를 사용 하 여를 포함 한다. 이 방법은 정확한 하지만 기술 그리고 시간 요구 이며 동물의 많은 수를 포함 하는 연구에 대 한 제한. 또한 5 월을 따기 되며 물리적으로 손상 동물에 스트레스 잠재적으로 힘의 부 자연스럽 고 일관성 없는 금액에 개인을 쓰는 하 여. 세척 포함 버퍼 솔루션 문화 접시를 헹 구 고 새로운 문화 접시에는 동물 들과 함께 솔루션 유리 파스퇴르 피 펫을 통해 전송 됩니다. 이 방법은 신속 하 고 효율적인 하지만 여러 세대와 동물의 발달 단계는 대량에서 전송에 정확 하지 않다. FUDR, 같은 화학 치료는 차단 어떤 DNA 복제 그리고 이렇게, 생식 체 생산 및 계란 개발 통해 자손의 생산을 방지 하기 위해 자란 미디어에 녹아 수 있습니다. 동안 효과, 즉, 자사의 관리3이전 동물을 전송 하는 요구는 여전히 그리고 정상적인 발달 과정을 방해 하지로 발달 성숙 후이 메서드를 적용 해야 합니다. 이 메서드는 또한 여러 개의 셀룰러 신호 경로, 결과 동물에 눈에 띄는 효과 (예를 들어, 수명 연장 또는 변경 된 proteostasis) C. 선 충 사용5의 변형에 따라 영향 6,,78,,910. 교류 cytometry 방법을 자동으로 정렬 하 고 다른11한 멀티 잘 플레이트에서 개별 C. 선 충 을 전송. 이 방법은 매우 효과적이 고 효율적인 동안 흐름 cytometry 장비는 엄청나게 비싼 많은 연구원에 액세스할 수 있습니다. 동물을 전송 하는 대신 온도 등 그다지 15 fem-1, 온도 조정12살 균 되는 민감한 돌연변이 모델을 사용 하는 것입니다. 돌연변이 동물을 사용 하 여 하는 것이 어떤 상황에 유용 하지만 이러한 특정 변종 야생-타입 동물 보다 느리게 성장 하 고 그들은 에이징 또는 건강 한 벌레에 대 한 불 쌍 한 대표자로 봉사 하는 변경 된 게놈에 의존. 또한, 무 균을 유도 하기 위해 온도 변화에 대 한 의존도 또한 정적 환경의 부재에 발생 하 고 온도 변화 유전자 식13,14, 에 영향을 쉽게 표시 되었습니다 15. 연구 그룹 이전 크기16 C. 선 충 을 필터링 하는 메시의 사용을 설명 하는 기술을 출판. 그러나, 우리가 이전 작품 어떤 변화 같은 필터의 사용과 관련 된 전반적인 건강 결과에 대 한 테스트를 찾을 수 없었습니다.
따라서, 문화 판 사이의 동물의 많은 수를 전송 하기 위한 저렴 한 가격, 신속, 효율적이 고 정확한 방법에 대 한 C. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 필요 하다. 향상 된, 액세스할 수 (라는 이름의 꼬마 체) 장비 및 그것의 제조 및 C. 선 충 연구 커뮤니티의 요구를 충족 하는 작업에 대 한 연결된 프로토콜의 조각을 개발 했습니다. 여기, 우리 꼬마 체 및 그 사용 방법의 디자인을 공유 하 고 우리는 그것의 사용 영향을 주지 않는 일반적인 건강 또는 표준 수동 채집 및 치료는 일반적으로 사용 되에 비교 될 때 어떤 스트레스 마커 입증 다 산 제한 화학 FUDR

<table><tbody><tr><td>보안경</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>보호용 내열 장갑</td><td>Grainger</td><td>품목 # 3AT17 Mfr. 모델 # 3AT17 카탈로그 페이지 # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>합성 나일론 메쉬</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 및 NTX50</td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제</td><td>스카치 슈퍼 글루 액체</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>플라이어</td><td>뱀플라이어</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>원형 파일이 있는 Dremmel 도구</td><td>Lowe's</td><td>Item # 525945 모델 # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 화학물질 (NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM 플레이트 화학물질 (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2, 콜레스테롤, 스트렙토마이신)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (한천), Sigma (나머지)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>파라콰트 이염화물 수화물</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

꼬마 체: 낮은 악기와 작은 multicellular 유기 체를 정렬에 대 한 방법론

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

꼬마 선 충 (C. 선 충)은 기본 및 생물 의학 연구의 범위에 걸쳐 사용 되는 기초가 튼튼한 모델 유기 체. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 C. 선 충의 큰, 나이 일치 하는 인구를 유지 하는 저렴 하 고 효과적인 방법에 대 한 필요가 있다. 여기, 우리 기계적으로 정렬 및 청소 C. 선 충에 대 한 방법론을 제시. 우리의 목표는 동물의 균일 한 크기와 실험에 그들의 사용에 대 한 생활 단계를 비용 효과적, 효율적, 빠르고 간단한 프로세스입니다. 이 도구, 꼬마 체 사용 사용자 뚜껑 시스템을 일반적인 원뿔 실험실 튜브에 스레드 및 선 충 C. 신체 크기에 따라 정렬 합니다. 우리 또한 그 꼬마 체 효과적으로 동물에서에서 전송 하나의 문화 접시는 빠른 정렬, 동기화, 및 건강의 표시를 영향을 주지 않고 청소에 대 한 다른 허용 보여 운동 성 포함 하 고 스트레스를 유도할 수 있는 진 기자입니다. 이 접근 가능 하 고 혁신적인 도구 C. 선 충 인구를 유지 하기 위한 빠르고, 효율, 비-스트레스 옵션입니다.

꼬마 체 이루어져 있다 2 나사 모자, 짠된 나일론 monofilament 메쉬 간단한 세척 기술을 사용 하 여 생물의 라이브 인구를 추출 하는 데 사용, 원하는 개발 시대의 몸 직경 보다 작은 영역을 확보. 그것은 표준 원뿔 관에 부착 하 고 메쉬 스크린을 사용 하 여 기계적으로 동물 몸 직경, 튜브에 추가 유지 관리 및 실험 (예를 들어, 전송 또는 유전 수확)에 대 한 준비가 원하는 동물을 떠나 정렬. 꼬마 체 세척 부드러운 매뉴얼은 빠른, 60-100 mm 접시 당 약 5 분 및 유기 체는 망에서 쉽게 복구할.
비율에 따라 동물의 항복 꼬마 체 사용 꼬마 체의 백분율 수확량을 설정 ...

정렬 및의 인구 나이 일치의 청소에 대 한 방법론을 포함 하는 현재 프로토콜 꼬마 선 충. 그것은 연구에 대 한 선 충의 큰 실험적인 인구를 간단 하 고, 저렴 한, 그리고 효율적인 맞춤 도구를 사용 합니다.

꼬마 체: 낮은 악기와 작은 Multicellular 유기 체를 정렬에 대 한 방법론

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

이 방법은 예쁜꼬마선충의 특정 발달 단계를 필요로 하는 분석법과 관련된 분자 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유전자 및 단백질 발현 수준의 분석과 같습니다. 이 기술의 장점은 신체 크기에 따라 많은 수의 예쁜꼬마선충을 정확하고 효율적으로 선택할 수 있다는 것이며, 이는 일반적으로 시간과 비용이 많이 드는 분석의 사용을 용이하게 합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 아치형 턴오버 단계를 수행할 수 없거나 솔루션 흐름을 메쉬 중앙에 유지하지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 세척 및 뒤집기 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 어떤 사람들은 텍스트의 특정 움직임을 해석하고 시각화하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.먼저 뚜껑이 있는 50mL 원뿔형 튜브 2개를 준비한 다음 계단식 드릴 비트를 사용하여 뚜껑 안쪽 립에서 중심을 제거합니다. 필요한 경우 파일을 사용하여 사포 또는 회전 도구를 사용하여 뚜껑의 가장자리와 상단을 청소하고 사포질합니다. 그런 다음 뚜껑의 직경보다 약간 작은 나일론 모노 필라멘트 짠 메쉬 디스크를 자릅니다.뚜껑의 윗면에 질감을 바르고 에탄올로 청소합니다. 뚜껑을 건조시킨 후 양쪽 뚜껑의 윗면에 시아노아크릴레이트 접착제를 바릅니다. 다음으로, 접착된 하나의 뚜껑에 모노필라멘트 메쉬 디스크를 놓습니다.메쉬 상단의 두 번째 뚜껑을 뒤집고 뚜껑을 함께 단단히 누릅니다. 접착제의 첫 번째 층이 건조된 후 뚜껑 사이의 바깥쪽 틈 주위에 시아노아크릴레이트 접착제를 넉넉하게 바르십시오. 다음으로, 필터에 각각의 메쉬 공극 크기로 레이블을 지정합니다.먼저, 라벨이 붙은 50mL 원뿔형 튜브 위에 체를 놓습니다. 그런 다음 물방울이 형성되고 합쳐져 필터 중앙에서 떨어질 때까지 체 중앙을 통해 식염수 용액을 피펫으로 주입합니다. M9 버퍼를 사용하여 오거 플레이트에서 C.elegans 개체군을 씻어낸 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 모노필라멘트 메쉬의 윗면에 웜이 포함된 버퍼를 옮깁니다.메쉬 중앙에서 작동하여 M9 버퍼로 필터를 헹구고 필요에 따라 이 헹굼 단계를 반복하여 모든 박테리아와 더 작은 벌레가 메쉬를 통과시킵니다. 다음으로, 새 50mL 원뿔형 튜브를 체 상단에 부착하면 이전에 수집된 웜이 메쉬의 기공보다 큰 새 튜브 내부를 향하게 됩니다. 폐기물 튜브를 제거하고 체를 빠르게 뒤집습니다.그런 다음 M9 버퍼가 있는 메쉬를 새 수집 튜브로 헹굽니다. 수집된 벌레가 약 1분 동안 가라앉을 때까지 기다린 다음 벌레 펠릿에서 완충 용액을 조심스럽게 흡입합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 NGM 플레이트에 벌레 방울을 만들고 건조시킵니다.마지막으로 역삼투압 물과 에탄올로 체를 헹굽니다. 체가 마르면 나중에 사용할 수 있도록 깨끗한 용기에 보관하십시오. 체가 처진 모양이 나타나면 버리십시오.이 프로토콜에서는 나이가 일치하는 예쁜꼬마선충 개체군을 분류하고 청소하기 위해 체가 구성되었습니다. 체 처리 그룹의 동물은 성인기 내내 정상적이고 자발적인 움직임 패턴을 보였습니다. 또한, pick 및 sieve 그룹은 인두 펌프 속도에서 유의한 차이를 보이지 않았습니다.체 그룹에 속한 동물들은 또한 실험일 중 어느 날의 모든 치료 그룹과 비교했을 때 전방 또는 후방 기계적 자극에 정상적으로 반응했다. 마지막으로, 치료 그룹의 생산력을 비교했습니다. 체의 사용은 Pick 처리 그룹과 비교할 때 자손의 수에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 이 기술을 완전히 익히면 10분 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 메쉬 영역의 중심에서 작동해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Caenorhabditis 체를 조립하고 적절하게 사용하여 신체 크기별로 벌레를 분류하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 전체 벌레를 온전한 세포의 FACS 또는 면역침전에 적합한 단일 세포 현탁액으로 해리하는 방법을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans의 단일 세포 해리: 살아있는 세포를 분리하는 방법

출처: 모건, E. 외 장내 미생물군 박테리아를 풍부하게 하기 위한 야생 선 충선충의 선택적 세척. J. Vis. Exp. (2021)이 영상은 야생 카에노르합딧 벌레에서 관심 있는 장내 박테리아를 분리하는 프로토콜을 시연합니다. 벌레는 먼저 굶주림을 주고 세척하여 표면과 장 내강에서 잔류 영양 박테리아를 제거하면서 표적 미생물을 보존합니다. 표면 세척과 여러 차례의 기어 다니는 단계를 거친 후, 벌레를 해부하여 관심 박테리아가 포함된 장을 추출한 후 수집하여 냉동하여 보관합니다.

장내 미생물 풍부화를 위한 카에노르합 딧 벌레의 선택적 세척

wormsorter 형광 기자의 표현에 따라 웜을 정렬하여 예쁜 꼬마 선충의 유전자 화면을 용이하게한다. 여기에서, 우리는 새로운 사용 설명 : GFP - 표현 병원체에 의한 식민지에 따라 정렬을, 우리는 면역 반응을 시작하기에 병원체의 인식의 불완전하게 이해 역할을 조사하기 위해 그것을 사용합니다.

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

야생 Caenorhabditis 선충은 많은 미생물과 연관됩니다, 종종 창 자 루멘에서 또는 창 자를 감염. 이 프로토콜은 도어 큐티클의 저항을 활용하여 내장을 식민지화하는 헤아릴 수없는 미생물을 풍부하게하는 방법을 자세히 설명합니다.

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

이 프로토콜은 필드의 천연 기판에서 살아있는 선충을 효율적으로 추출하는 방법을 간략하게 설명합니다.

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

이 프로토콜은 자아 Caenorhabditis 선충류의 대규모 생태 조사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 자연에서 수집 된 선충류와 관련된 생태 및 분자 데이터의 효율적인 조직 및 분석입니다.

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

본 프로토콜은 유전체학, 단백질체학, 마이크로바이옴 또는 기타 분석에 입력하기 위해 손으로 성인 Caenorhabditis elegans 선충으로부터 장을 분리하는 절차를 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 내장의 손 해부

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

학습하세요 Caenorhabditis elegans를 체형별로 정렬하고 세척하는 효율적인 방법을. 맞춤형 도구를 사용하여 분자생물학 실험에 필요한 특정 발달 단계의 선충을 정확하게 선택할 수 있습니다.

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