Name: 다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 학습하세요 FLIPS 기법을 사용하여 단일 HIV-1 감염 세포에서 전체 길이 프로바이러스를 증폭하고 차세대 시퀀싱으로 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 잠복 HIV 저장고의 유전적 구성을 이해하는 데 필수적입니다.

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이 작업을 지원 했다 (1U19AI096109와 1UM1AI126611-01); 치료법을 찾을 Delaney 에이즈 연구 기업 (감히) 자선단체 에이즈 연구 (amfAR 108074-50-RGRL);는 재단에서 에이즈 퇴치 (ARCHE) 공동 연구 그랜트에 연구 컨소시엄 호주 센터 에이즈 및 간염 바이러스학 연구 (ACH2); UCSF GIVI 센터 에이즈 연구 (P30 AI027763); 그리고 호주 국가 건강과 의료 연구 위원회 (AAP1061681). 우리 박사 조이 라이, 웨스트 미드 연구소 도서관 준비 및 그의 시설 사용에 그의 훈련에 대 한 의학 연구에 대 한 게놈 시설 관리자와 Ramaciotti 센터 유전체학 (대학의 뉴 사우스 웨일즈, 시드니, 호주)에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 시퀀싱을 진행 하는 방법에 대 한 우리는 감사와 함께이 연구에 대 한 샘플을 기증 참가자 인정.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

튀기기 분석 결과 증폭 및 시퀀싱 단일, 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법입니다. 여러 요소 및 프로토콜에서 번호와 얻은 시퀀스의 품질에 영향을 주는 중요 한 단계 확인 되었습니다. 첫째, 세포 수와 세포 인구의 에이즈-1 감염 주파수 증폭 하는 proviruses의 수에 영향. 예를 들어 이전 간행물에서 약 절반 만큼 시퀀스는 같은 수의 순진한 CD4+ T에서 입수 했다 effector 메모리 CD4에 비해 셀+ T 세포. 이것은 순진한 세포는 일반적으로 이펙터 메모리 셀2보다는 낮은 감염 주파수를가지고 있기 때문 에입니다. 둘째, 세포 세포 DNA 추출 과정에서 손실의 아무 위험으로 게놈 DNA를 얻기 위해 열 기반 추출 방법 바람직합니다. 마지막으로, 어떤 PCR 기반 분석 결과와 마찬가지로 오염 예방이 중요 합니다. 분리 된 깨끗 한 영역 마스터 믹스, genomic DNA, 긍정적인 컨트롤, DNA 정제, 정량화, 및 라이브러리 준비 추가 처리를 준비 하기 위한 지정 해야 합니다. 이것은 여기에 제시 된 것과 같은 단일-사본을 분석 실험을 위해 특히 중요 하다입니다.
튀기기 분석 결과의 구현 처음 참가자 샘플 보다는 pNL4 3 플라스 미드와 같은 긍정적인 컨트롤 실행 포함 해야 합니다. 얻은 시퀀스가 플라스이 미드에 대 한 사용 가능한 참조 시퀀스에 비해 수 있습니다 이것은 모든 문제 해결 이전에 에이즈-1 긍정적인 세포의 사용에 대 한 허용 됩니다. 에이즈-1 긍정적인 세포를 사용 하는 경우 그것은 거의 아무 proviruses 증폭 됩니다 경우 에이즈-1 subtype (뇌관 넘겼습니다 하위 B에 대 한 설계) 및 세포 인구의 감염 빈도 고려 하는 것이 중요. 뇌관 시퀀스 수정/다른 하위에 맞게 재설계 될 수 있습니다. 또한, 긍정적인 통제를 포함 하는 잘 모든 PCR 수행에 포함 되어야 합니다.
튀기기는 SPS를 포함 하 여 이전 시퀀싱 분석의 한계를 극복 했다. 증폭 및 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처 시퀀싱을 통해 넘겼습니다 에이즈-1 proviruses의 잠재적인 복제 역량을 확인할 수 있습니다. 이것은 SPS 하위 게놈 영역만을 시퀀싱 하 고 따라서 시퀀스를 그대로 뇌관 바인딩 사이트 선택을 사용 하 여 이었다. 또한, 넘겼습니다 활용 하 여 여러 증폭 및 시퀀싱 뇌관, 이전 전장 시퀀싱 분석1,4에 의해 고용 되었다와 관련 된 한계 극복. NGS와 함께 HIV-1 LTR 영역을 대상으로 하는 PCR의 2 라운드를 통해 넘겼습니다 수와 필요한 뇌관의 복잡성을 줄입니다. 튀기기 적습니다 뇌관 불일치, 즉 결함이 있는 proviruses의 잘못 된 식별 및 인구 내의 몇 가지 proviruses을 증폭 하는 무 능력의 결과에 따라서 이다. 넘겼습니다 프로토콜 더 효율적 이며 또한 이전 방법 보다 시퀀싱의 높은 처리량에 대 한 수 있습니다.
결국, 화나게 하다 에이즈-1 proviruses의 유전적 구성을 결정 하는 기존 방법에 비해 이점이 있습니다. 그러나, 그것은 튀기기의 한계를 인정 하는 것이 중요입니다. 첫째, 넘겼습니다 분석 결과 하지 개발 되었습니다 잠재 HIV-1 저수지의 크기를 측정 하기 위한 도구로 넘겼습니다 세포 인구에 있는 모든 HIV-1 provirus 증폭 여부를 결정 하는 분석 완료 하지 않은. 튀기기는 대신 다른 세포 인구2사이 저수지의 구성의 상대 비교를 만들기 위한 유용 합니다. 둘째, 그대로 HIV-1 proviruses의 복제 능력 vivo에서 , 같은 분석 호 외. 수행 없이 확실 하 게 확인할 수 없는 4. 셋째, 화나게 하다 에이즈-1 proviruses의 통합 사이트를 확인 하도록 설계 되지 않았습니다.
넘겼습니다 프로토콜에 작은 변이 응용 프로그램을 늘릴 수 있습니다. 예를 들어 시퀀스 다른 수 뇌관 및 증폭 하 여 시퀀싱 여러 에이즈-1 하위에서 변경 합니다. 플라즈마 1 HIV virions의 시퀀싱 중첩된 PCR 이전 cDNA 합성의 추가 통해 가능 하다. 단일 분자 시퀀싱 방법의 미래 활용 드 노 보 어셈블리에 대 한 필요성을 제거 합니다.
통합된 HIV-1 proviruses의 유전자 시퀀싱 잠재 HIV-1 저수지의 우리의 이해를 증가 했다. 튀기기 elucidating 구성과 잠재 저수지의 미래 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 그러나, 뒤집기의 응용 프로그램은 저수지 넘어 확장할 수 있습니다. 미래 연구 넘겼습니다 CRISPR Cas 기술에 대 한 특정 목표를 결정 하거나 코딩의 식별에 사용할 수 및 비 코딩 영역 바이러스를 에이전트를 반전 하는 대기 시간을 더 응답 하 게 만들기. 바이러스 성 재결합 큰 내부 삭제의 접합 사이트를 보면 더 이해 될 수 있습니다.

장기 투여 치료 (미술)에 개인에 속하는 잠재 HIV-1 저수지의 유전 특성 이해는 통합된 proviruses의 대부분은 결함이 있는 복제 무능1 에 중요 한 되었습니다. , 2. 반전 녹음 방송 과정에서 오류 통합된 proviral 시퀀스에 소개 된다. 결함이 proviral 시퀀스를 생성 하는 몇 가지 메커니즘 등 오류 발생 hiv-1 역전사 효소3,4및 APOBEC 유도 hypermutation5,6스위칭 템플릿. 두 개의 최근 연구 에이즈-1 proviruses 장기 예술에 개인에서 고립의 약 5% 유전자 그대로, 그리고 잠재적으로 복제 유능한, 그리고 예술의 정지시 에이즈-1 플라스마 수준에 빠른 리바운드에 기여할 수 있습니다 나타났습니다. 1 , 2 , 7. 이전 연구 복제 유능한 HIV-1 proviruses 순진한 및 메모리 CD4 휴식 유지 확인+ T 세포 부분 집합 (를 포함 하 여 중앙, 전환 및 효과 기 기억 T 세포)의 중요성을 나타내는 이 대상으로 미래에 박멸 전략2,,89세포.
배포, 역학 및 잠재 HIV-1 저수지의 유지 보수에 초기 통찰력 유전자 hiv-1 게놈10 의 하위 게놈 영역을 특징 짓는 단일 proviral 시퀀싱 (SPS) 방법의 활용을 통해 달성 했다 11,,1213. SPS는 단일 감염 된 세포 내에서 단일 HIV-1 provirus 시퀀싱 수 다재 다능 한 도구입니다. 그러나, SPS는 그것만 뇌관 바인딩 사이트 내의 큰 삭제를 포함 하는 하위 게놈 영역 및 누락 proviruses 시퀀스 이후 proviruses의 복제 능력을 확인할 수 없습니다. 이전 연구는 SPS에 의해 복제 유능한 저수지의 크기를과 대 평가 설명 했다 13-에 17 배 그대로 하위 게놈 영역2를 선택적으로 시퀀싱을 통해.
SPS, 호 외. 의 한계를 해결 하기 위해 4 와 브루 너 외. 1 전장 HIV-1 proviruses 근처 시퀀스 분석 실험을 개발 했다. 이 결정 장기 예술에 개인 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한, 에이즈-1 proviruses의 주파수를 허용. 이 분석 실험 증폭 및 시퀀싱 (통해 생어 시퀀싱) 하위 게놈 영역을 다음 순서는 그대로 (결함)의 HIV-1 provirus를 조립 했다. 이 방법의 세 가지 한계는: 1) 여러 시퀀싱 뇌관의 사용 실수로 proviral 시퀀스에 결함을 도입의 위험을 증가, 2) 뇌관 불일치 증폭 되지 않을 수 있습니다 특정 proviruses의 그리고 3) 자주는 이러한 방법 전문적으로 전체 proviral 시퀀스를 확인할 수 없습니다.
기존 전장 HIV-1 proviral 시퀀싱 분석 실험의 한계를 극복 하기 위해 우리는 F펼-Length 나ndividual P Sroviral equencing (뒤집기) 분석 결과를 개발 했다. 튀기기는 차세대 시퀀싱 (NGS)-증폭 하 고 높은 처리량 및 효율적인 방식으로 전체 길이 (그대로 또는 결함) HIV-1 proviruses 근처 시퀀스 기반된 분석 결과. 넘겼습니다 활용; 뇌관의 수를 제한 하는 그것으로 이전 분석 실험, 이점을 제공 한다. 따라서, 그것은 불일치, proviruses의 인구를 제한할 수 있습니다 캡처 또는 실수로 바이러스 시퀀스에 결함을 소개 하는 뇌관의 기회를 줄인다. 군요 이전 분석 보다 적게 기술적으로 도전적인 또한 및 6 단계를 포함 한다: 1) 에이즈-1 감염의 세포 세포, 2) 증폭 중첩된 PCR 뇌관 특정 높은 보존에 대 한 사용 하 여 희석을 제한에서 수행을 통해 단일 HIV-1 proviruses HIV-1 5'과 3' U5 LTR 영역 (그림 1A), 3) 정화 및 증폭된 제품, 4의 정량화) NGS, 5에 대 한 증폭 된 proviruses의 도서관 준비) NGS, 6) 각 contigs를 시퀀스 proviruses의 드 노 보 조립 개별 provirus입니다.
튀기기에 의해 생성 된 시퀀스 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 (그림 1C)2인 그들을 식별 하는 제거의 엄격한 과정을 받을 수 있습니다. 유전자 그대로 proviruses 복제 무능 provirus의 세대에서 발생 하는 모든 알려진된 결함 부족 합니다. 이러한 결함 포함: 반전 시퀀스, 대형 내부 삭제, hypermutation/해로운 정지 codons, frameshifts, 또는 변이 5' 신호 또는 포장 결합 기증자 (MSD) 사이트.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> 그림 1: 전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 분석 결과에 중요 한 단계. (A) 5' 그리고 3' U5 LTR 지역 중첩된 PCR 통해 전체 길이 (불완전 하 고 그대로) HIV-1 proviruses 근처 증폭 튀기기에서 사용 뇌관 바인딩 사이트와 에이즈-1 DNA 게놈. (B) 레이아웃 잘 80 샘플 웰 스 (각 희석에 대 한 20 웰 스), 4 부정적인 제어 우물, 그리고 1 긍정적인 통제를 포함 하는 96-잘 PCR 격판덮개의. (C) 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한, 에이즈-1 proviruses를 식별 하는 데 사용 하는 제거의 과정. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td> 중첩 PCR Nonidet P 40 대체 용액에 <td>대해 5 mM로 희석</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td> Sigma <td>P9416</td><td></td><td>Proteinase</td></tr><tr><td>K 용액 (20 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 써모사이클러</td><td>Any 96 well thermocycler</td><td></td><td></td> 사용 가능</tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>PCR 뉴클레오티드 믹스, 10mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>초순수 H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>PCR1 및 PCR2 프라이머</td><td></td><td></td><td>탈염. (100 &micro; M) H2O</td></tr><tr><td>PCR 플레이트 96 웰, 하프 스커트, 단일 노치 코너, 투명</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' 접착제 씰링</td><td>BioRad</td><td></td><td>MSB1001 96웰 PCR 플레이트</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 감염성 분자 클론(pNL4-3)</td><td>을 밀봉하는 데 필요다음 시약은 NIH AIDS 시약 프로그램, Division of AIDS, NIAID, NIH를 통해 Dr. Malcolm Martin(Cat# 114)의 HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone(pNL4-3)을 얻었습니다.</td><td></td><td>105 copies/mL로 희석하고 양성 대조군</td></tr><tr><td>PCR 플레이트 스피너 또는 벤치탑 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr>로 사용 <tr><td>E-GEL 48 1% Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>Precast 1% 아가로스 겔(96웰 플레이트당 2개의 겔 사용). 임의의 1% 아가로스 젤로 대체할 수 있습니다. 에티듐 브로마이드가 함유되어 있습니다.</td></tr><tr><td>DirectLoad Wide Range DNA Marker</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>최대 10kb 범위의 모든 사다리를 대체할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Mother E-Base 장치</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>precast 48 well 1% 아가로스 겔 실행에 필요</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Gel 문서화 시스템</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>아가로스 겔을 포함하는 에티듐 브로마이드에 대한 모든 시각화 시스템을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>PlateMax Peelable Heat Sealing</td><td>Axygen</td><td>HS-200</td><td>장기 보관용 열 밀봉 필름</td></tr><tr><td>96웰 0.8mL 보관 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>마그네틱 비드 기반 PCR 정제에 필요한 0.8mL 96웰 플레이트</td></tr>, <tr><td>Agencourt AMPure XP(PCR 정제 키트)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>마그네틱 비드 기반 PCR 정제 키트. 다른 PCR 정제 키트는 여기(예: </em)로 대체할 수 있습니다> QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>에틸 알코올, Pure. 200 proof, 분자생물학용</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Microplate shaker</td><td></td><td></td><td>선택적</td></tr><tr><td>버퍼 EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>용리 버퍼</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>dsDNA 농도 측정을 위한 형광 기반 염색</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Nextera XT DNA 라이브러리 준비 키트에 필요</td></tr><tr><td>라이브러리 정량 키트 - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>다른 라이브러리 정량 키트로 대체 가능(예: JetSeq DNA 라이브러리 정량 Lo-Rox 키트(Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>자동 전기영동 시스템 . High Sensistivity DNA 키트,</td></tr><tr><td>High Sensistivty DNA 키트</td>, <td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq Platform</td>, <td>Illumina</td><td></td><td></td></tr>와 함께 사용</tbody></table>

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 hiv-1 proviruses 근처의 증폭

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Full-Length 개별 Proviral 시퀀싱 (뒤집기) 분석 결과 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함), 에이즈-1 proviruses 근처 시퀀싱 하도록 설계 된 효율적이 고 높은 처리량 방법입니다. 넘겼습니다 셀 인구 내의 통합된 에이즈-1의 유전자 구성의 결심을 허용 한다. 반전 녹음 방송, 큰 내부 삭제, 같은 기간 동안 발생 하는 에이즈-1 proviral 시퀀스 내에서 결함 식별을 통해 해로운 정지 codons/hypermutation, frameshift 돌연변이 및 cis 요소 행동 돌연변이/삭제 필요 virion 성숙에 대 한 뒤집기 통합된 proviruses 복제의를 식별할 수 있습니다. 에이즈-1 proviruses는 이러한 결함을 부족 하 고 따라서 잠재적으로 복제 유능한 식별을 넘겼습니다 분석 결과 활용할 수 있습니다. 넘겼습니다 프로토콜 포함: 에이즈-1 감염 된 세포의 세포 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처의 PCR 중첩 (에이즈-1 5를 타겟으로 하는 뇌관을 사용 하 여 ' 3 ' LTR), DNA 정제, 정량화, 도서관 준비 위한 차세대 시퀀싱 (NGS), NGS, 드 노 보 조립 proviral contigs 및 복제 유능한 proviruses 식별에 대 한 철폐의 간단한 과정. 뒤집기 순서를 설계 하는 전통적인 방법에 비해 장점이 통합 단일 proviral 시퀀싱 등 에이즈-1 proviruses을 제공 합니다. 넘겼습니다 증폭 및 결정, 되도록 복제 능력을 사용 하는 전체 길이 proviruses 근처 시퀀스 고 또한 적은 증폭 뇌관, 뇌관 불일치의 결과 방지를 사용 합니다. 그러나 튀기기 잠재 저수지 내 특히 통합된 HIV-1 proviruses의 유전 프리를 이해 하기 위한 유용한 도구입니다, 그리고, 그것의 사용 있는 통합된 에이즈-1의 유전자 조성은 필요한 모든 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다.

튀기기 분석 결과 증폭 하 고 전장 HIV-1 proviruses 근처, 단일 시퀀스. 프로토콜 전체 길이 proviral 시퀀스 근처를 6 단계를 포함 한다. 이러한 단계를 포함: 세포의 용 해 감염 세포, 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses, DNA 정제 및 정량화, 라이브러리 준비, NGS, 시퀀싱의 중첩 된 PCR 및 드 노 보 의 조립 순서가 proviruses. 각 단계의 최종 검사점 전에 다음 단계 (예: 증폭 DNA, 순화 된 DNA, 시퀀싱 라이브러리 또는 시퀀스) 제품의 품질 평가 수 있다 여겨질 수 있다. 각 단계의 끝에서 수행 평가의 개요 그리고 예상된 된 결과 아래에 설명 된.
다음 중첩 된 PCR 증폭된 제품 1 %agarose 젤 (그림 3)에 실행 됩니다. PCR의 초기 품질은 부정적이 고 긍정적인 컨트롤의 검사에 의해 확인할 수 있습니다. 증폭된 제품을 포함 하는 부정적인 제어 우물 오염 나타내고 증폭된 제품의 결 석 긍정적인 제어 우물 부족 확대 표시 합니다. 다음, 웰 스 증폭된 제품을 포함 하는 시퀀싱에 대 한 선택 됩니다. 여러 증폭 된 proviruses의 혼합물을 포함 하는 우물을 피하기 위해, 웰 스만 증폭된 제품 끝점 희석에 실행을 포함 하는 시퀀싱에 대 한 간주 됩니다. 포아송 분포에 따라 끝점 희석 우물의 30%는 증폭 된 제품에 대 한 긍정적인 발견 된다. 이 희석, 80%는 이러한 웰 스 포함 단일 증폭된 provirus 기회. 여러 밴드 젤에 표시 됩니다 또한, 서로 다른 길이의 여러 증폭 된 proviruses를 포함 하는 우물이이 단계에서 구상 수 있다. 이 우물 (그림 3)을 시퀀싱 하지 선택 합니다.
증폭된 proviruses 시퀀싱에 대 한 선택의 정화, 따라 정량화 아무 proviral DNA 정화 단계 손실 됩니다 보장 합니다. 증폭된 provirus의 DNA 농도 경우 &lt; 0.2 ng / µ L, 접시는 순화 될 수 있다 PCR2에 나머지 샘플. 유사한 검사점 라이브러리 준비, 각 개별 라이브러리 계량은 다음 발생 합니다. 이렇게 하면 개별 proviruses 적절 하 게 조각, 태그 되었고 시퀀싱 전에 증폭. 개별 proviral 라이브러리는 4의 마지막 라이브러리 농도에 아데닌 금액에 풀링된 nM (또는 시퀀싱 공급자에 의해 지정 된 대로). 개별 proviral 라이브러리의 농도가 너무 낮은 경우, 시퀀싱 라이브러리 풀에서 제외 될 수 있습니다 또는 개별 라이브러리 다시 준비. 풀링된 라이브러리의 농도 대 한 최종 검사 확인 평균 조각 길이 함께 시퀀싱 전에 수행 됩니다.
품질 관리 단계 드 노 보 어셈블리 단계 최종 proviral contig을 조립 하는 데 사용 하는 읽기의 품질을 보장 하기 전에. 이러한 단계를 포함: 어댑터 시퀀스, 5'과 3' 뉴클레오티드, 엄격한 품질 제한, 정돈 하 고 무시 하는 짧은 읽기의 제거. CLC 유전체학 워크 벤치는 트리밍 낮은 품질 영역을 제거 하는 충분 한 결정 하 읽기 및 가이드 트리밍 설정, 그리고 후 초기 품질을 평가 하기 전에 사용할 수 있는 품질 관리 보고서를 제공할 수 있습니다. 또한, 노 보 드 어셈블리 조립된 contigs의 품질 평가 될 수 있다 충분 한 깊이 (&gt; 1000 X) 및 범위 (그림 4A)의 균일성. 혼합된 인구는 또한이 단계에서 확인할 수 있습니다. 반면 짧은 (큰 내부 삭제 포함)와 전체 길이 proviruses의 혼합물 고르지 의해 확인 될 수 있다 여러 전장 (~ 9 kb) proviruses의 혼합물의 40%, 보다 큰 주파수와 함께 여러 개의 Snp의 존재를 통해 식별 됩니다. 읽기 범위 (그림 4B) 같은 참가자에서 매핑 전체 참조를 다음.
응용 프로그램에 따라 최종 정렬 "r A: 언어 및 통계 컴퓨팅 환경"27패키지로 ggtree 사용할 수 있는 같은 도구를 사용 하 여 시각화 수 있습니다. 최근 연구에 넘겼습니다 순진한, 중앙, 과도, 및 이펙터 메모리 CD4에서에서 시퀀스 HIV-1 proviruses+ T 활용 세포 특정 하위 집합 높은 면을 식별 하는 목적으로 장기 예술에서 개인에서 분리 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 HIV-12비율 여기, 한 참가자 (참가자 2026)이이 연구의에서 고립 된 시퀀스의 시각적 표현 (그림 5) 제공 됩니다. 이 참가자 시퀀스의 대부분 (97%) 했다 결함, 이펙터 및 과도 메모리 CD4 그대로 시퀀스+ T 세포. 이 시각화 도구는 큰 내부 삭제 시퀀스 수와 게놈에 있는 그들의 위치를 표시 하는 데 유용 합니다. 그것은 수 있습니다 해로운 정지 codons, frameshift 돌연변이 및 삭제/돌연변이 엠 사이트 및/또는 포장 신호에는 시퀀스를 나타내기 위해 추가 주석을 답니다.
넘겼습니다 분석 실험의 한 응용 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 HIV-1 proviruses의 신분증입니다. 531 시퀀스 CD4에서 고립의 최근 연구에서+ T 세포 6 참가자 장기 예술에 26 (5%) 유전자 그대로 HIV-1 proviruses 했다 확인된2. 나머지 결함이 proviruses 포장 신호 또는 엠 사이트 (11%)에서 돌연변이에 그 반전 시퀀스 (6%), 대형 내부 삭제 (68%), 해로운 정지 codons/hypermutation (9%), frameshift 돌연변이 (1%), 및 결함을 포함 .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> 그림 2: 에이즈-1 proviruses의 de novo 어셈블리에 대 한 워크플로 개요. 워크플로의 주요 단계를 포함: 1) 시퀀스 읽기 2) 병합 겹치는 쌍, 3 품질 관리) 노 보 드 어셈블리 및 4) 매핑 되었으며 일치 건물 색된 빨강, 파랑, 녹색, 오렌지, 각각. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> 그림 3: 예제 agarose 젤 PCR의 증폭 HIV-1 proviruses. 웰 스 1, 2, 3, 6, 9 및 10 증폭된 HIV-1 proviruses 포함 되어 있습니다. 잘 10 포함 provirus 큰 내부 삭제와, 잘 2 포함 (혼합물), 다른 길이의 두 에이즈-1 proviruses의 공동 증폭 하 고 잘 12 긍정적인 컨트롤이 포함 되어 있습니다. 참고 % 증폭된 제품을 포함 하는 웰 스의 60%, 단일 서식 파일을 분리 하는 데 필요한 비율 위에 있는입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> 그림 4: 읽기 매핑 출력 예. (A) 예를 들어 단일 전체 길이 HIV-1 provirus의 증폭 때문도 보험 혜택을 보여주는. 드 노 보 어셈블리, 다음 모든 읽기 합의 시퀀스 조립된 contig에 매핑됩니다. 소프트웨어 플랫폼에는 충분 하 고도 범위에 대 한 검사 매핑된 읽기 수 있습니다. (B) 예를 들어 서로 다른 길이 (혼합물)의 두 에이즈-1 proviruses의 공동 확대를 보여주는. 혼합물을 확인 하려면 읽기는 전체 길이 (~ 9 kb) 참조 시퀀스 같은 참가자 로부터 매핑되고 매핑 검사를 읽고. 고르지 못한 보도의 혼합물을 나타냅니다. 이 그림은 Qiagen14에서 허가로 재생 된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> 그림 5: 예제 시각화 에이즈-1 proviral 시퀀스 CD4에서 격리의+ T 세포 장기 예술에 개인에서 하위 집합. 개별 HIV-1 proviral 시퀀스 가로선으로 표시 됩니다. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

이 방법은 HIV 프로 바이러스 및 다른 세포 모형의 유전 조성을 결정하는 것과 같은 HIV 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 특히 유전적으로 손상되지 않고 잠재적으로 복제 능력이있는 사람들을 식별합니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 HIV 감염 세포에서 거의 전체 길이 HIV 프로 바이러스를 증폭시킨 다음 다음 세대 염기서열에 의해 이것들을 순서화할 수 있다는 것입니다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 버퍼를 준비합니다. 세포 펠릿을 얻고 백만 세포당 100 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하십시오. 위아래로 파이프를 통해 섞는다.1시간 동안 섭씨 55도에서 열 사이클러에 배양한 다음 섭씨 85도를 15분 동안 추가하여 세포를 분해합니다. 단일 HIV-1 DNA 프로바이러스 증폭을 시작하려면 텍스트 프로토콜 중 하나에 나열된 바와 같이 첫 번째 라운드 PCR에 대한 시약을 혼합한다. 96 개의 잘 PCR 플레이트에 85 개의 우물에 38 마이크로 리터를 추가하고이 플레이트를 PCR 1로 레이블을 지정합니다.그 후, PCR 1 플레이트를 게놈 DNA의 첨가를 위해 지정된 명확한 영역으로 이동한다. 삼액염염을 사용하여 유전체 DNA를 1 대 3대 1대 81의 비율로 희석하여 각 희석제의 45마이크로리터를 준비하도록 합니다. 각 샘플에 희석된 게놈 DNA 2개와 각 음량 조절에 염산염 산염 2개를 첨가합니다.양수 컨트롤을 제외한 플레이트 전체를 잘 밀봉하십시오. 다음으로, 양수 제어의 추가를 위해 지정된 영역으로 이동합니다. 양수 제어의 마이크로리터 2개를 해당 우물에 추가한 다음 플레이트를 완전히 밀봉합니다.PCR 플레이트 스피너를 사용하여 잠시 PRC 1 플레이트를 회전시키고 우물 의 측면에서 잔류 내용을 당깁니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 열 사이클러에서 PCR 1 플레이트를 실행합니다. 다음으로, 테이블 1에 나열된 대로 PCR의 두 번째 라운드에 대한 시약을 혼합합니다.이 PCR 2 믹스의 28 마이크로 리터를 새로운 96 웰 PCR 플레이트의 85 우물에 추가합니다. 이 플레이트를 PCR 2로 레이블을 지정합니다. 플레이트 스피너를 사용하여 PCR 1 플레이트를 잠시 회전하여 우물 의 측면에서 잔류 내용을 당깁니다.이 접시의 각 웰에 80 개의 미트리스 염산염을 추가합니다. 그 후, 뮤틀리 채널 파이펫을 사용하여 PCR 1 플레이트의 각 웰에서 PCR 2 플레이트의 해당 우물로 두 개의 마이크로리터를 전송합니다. 투명 접착제 랩으로 PCR 2 플레이트를 밀봉합니다.플레이트 스피너에서 PCR 2 플레이트를 간단히 회전시합니다. 한편, PCR 1 플레이트를 영하 20도의 장기 보관용 열 밀봉 필름으로 밀봉하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 열 사이클러에서 PCR 2 플레이트를 실행합니다.그런 다음 잠시 PCR 2 플레이트를 회전하여 우물 의 측면에서 잔류 내용을 끌어 당깁니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 60 마이크로리터의 미산염을 추가합니다. 다음으로, 에티듐 브로마이드를 함유한 1% 아가로즈 젤을 잘 프리캐스트한 48개의 48개에 각각 15마이크로리터를 실행합니다.증폭된 제품과 대략적인 크기를 포함하는 우물을 식별하고 젤 이미지를 저장합니다. 그 후, 우물의 30% 이하가 증폭된 제품에 대해 긍정적이지 않은 희석을 결정합니다. 먼저 플레이트 스피너를 사용하여 PCR 2 플레이트를 잠시 회전시키고 우물 의 측면에서 잔류 내용을 당깁니다.증폭된 제품을 함유한 우물에서 40마이크로리터를 새로운 96웰 미디 플레이트의 해당 우물로 옮기. 다음으로 자기 사료 기반 정화 키트를 설정하여 마그네틱 구슬을 실온으로 가져와 80 %의 신선한 용액을 준비합니다. 구슬이 실온 소용돌이에 도달하면 철저히 재중단되었는지 확인합니다.멀티 채널 파이펫을 사용하여 미디 플레이트의 각 웰에 40 마이크로리터의 증폭 된 제품에 40 마이크로 리터의 구슬을 추가하십시오. 10번 위아래로 부드럽게 파이펫을 섞어 섞는다. 실온에서 5분간 배양하세요.그런 다음 접시를 자기 스탠드로 옮기고 2 분 동안 쉬게하십시오. 이 후, 제거하고 상체를 폐기합니다. 플레이트가 여전히 스탠드에 있는 동안 각 웰에 80% 에탄올 용액의 200마이크로리터를 추가하여 구슬을 씻으시다.실온에서 30초 동안 배양한 다음 상체를 제거하고 폐기합니다. 에탄올을 첨가하는 것부터 상퍼를 버리는 것까지 이 세척 과정을 한 번 반복합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하면 과도한 에탄올이 제거됩니다.구슬을 15분 동안 건조시키세요. 이 후 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 각 웰에 용출 버퍼 30 마이크로리터를 넣고 10번 위아래로 부드럽게 파이펫을 섞습니다.실온에서 2분간 배양하세요. 접시를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 2분 동안 쉬게 합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여, 새로운 96 웰 PCR 플레이트의 해당 우물에 상체의 25 마이크로 리터를 전송합니다.다음으로, 스펙트럼 광계를 사용하여 각 증폭된 DNA 제품의 대략적인 농도를 결정하고 기록한다. 이중 좌초 된 DNA 정량화 키트를 설정하고 멸균 DNAs가없는 물에서 버퍼를 1 번 희석시. 완충제의 마이크로리터 99마이크로리터를 평평한 바닥 조직 배양 판에 적절한 수의 빈 우물에 넣습니다.그런 다음 3개의 빈 우물에 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 측정될 각 증폭 된 제품에 대해 버퍼를 포함하는 각 우물에 삼중 정제된 DNA의 마이크로 리터 1 개를 추가합니다. 람다 이중 좌초 DNA10 마이크로리터 당 두 나노 그램에서 10 주름을 희석하여 표준을 준비하기 위해 마이크로 리터 당 제로 나노 그램을 가리킵니다.각 이중 좌초 DNA 표준의 100 마이크로리터를 3개의 우물에 추가합니다. 버퍼로 꽃염료를 1~200개를 희석시다. 샘플, 빈 또는 표준이 포함된 각 웰에 100마이크로리터를 빠르게 추가하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.그 후, 빛과의 접촉을 피하기 위해 호일로 접시를 덮습니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 플로레스징 방출을 기록합니다. 기록된 측정을 사용하여 각 샘플에서 이중 좌초 된 DNA의 농도를 결정합니다.그런 다음 각 정제된 제품을 물로 희석하여 마이크로리터당 2나노그램의 제로포인트 농도로 희석합니다. 중첩 된 PCR에 따라 증폭 된 제품은 1 % 아가로즈 젤로 실행됩니다. PCR의 초기 품질은 컨트롤을 검사하여 결정할 수 있습니다.증폭된 제품을 포함하는 음의 제어가 오염을 나타내고 증폭된 제품 없이 양수 컨트롤이 충분하지 않은 것을 나타냅니다. 단일 증폭 된 프로 바이러스를 포함하는 엔드 포인트 희석에서 실행되는 우물만 시퀀싱을 위해 고려됩니다. 다른 길이의 여러 증폭 된 프로 바이러스를 포함하는 우물은이 단계에서 시각화 할 수 있지만, 시퀀싱을 위해 선택해서는 안됩니다.드 노보 어셈블리의 경우, 조립된 연속지의 품질은 충분한 깊이와 균일한 커버리지를 위해 평가될 수 있다. 혼합 된 인구는 또한 고르지 않은 범위의 존재에 의해이 단계에서 식별 될 수있다. 한 참가자로부터 격리된 시퀀스의 시각적 표현은 시퀀스의 97%가 결함이 있음을 나타냅니다.이펙터 및 과도 메모리 CD4 양성 T 셀에서 발견되는 온전한 서열. 이 절차를 시도하는 동안 제한 희석에서 얻은 증폭 된 제품만, 즉 우물의 30 % 이상이 양성이며 단일 프로 바이러스를 포함하고 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 증폭 된 제품은 HIV 프로 바이러스의 유전 적 구성을 결정하기 위해 서열화 될 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 유전적으로 손상되지 않은 HIV 프로바이러스 및 치료에 있는 환자에 있는 다른 세포 모형의 분포를 탐구하기 위하여 HIV의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다 유전적으로 손상되지 않고 잠재적으로 복제 유능한 proviruses 숨기는 곳에 결정하기 위하여. HIV 감염 된 세포와 함께 작업 하는 것은 위험 할 수 있으며 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 인증 된 실험실 작동이 절차를 수행 하는 동안 항상 취해야 하는 예방 조치.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

HIV tropism는 바이러스 봉투의 V3 지역에서 유추하실 수 있습니다. V3는 PCR은 RT - PCR 중첩, 합성을 사용하여 세중의에 증폭하고, bioinformatic 소프트웨어를 사용하여 해석됩니다. 낮은 g2P 점수 1 개 이상의 시퀀스 (S)와 함께 샘플이 아닌 R5 바이러스로 분류됩니다.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

플라즈마 및 시퀀싱에서 HIV - 1 RNA 수준을 Quantifying하면 단일 HIV - 1 검출 한계 (50-75 사본 / ML) 아래 바이러스성로드와 개인의 genomes가 어렵습니다. 여기 우리는 안정적으로 0.3 복사 / ML에 HIV - 1 RNA를 측정하고 매우 낮은 바이러스성로드와 샘플에서 단일 게놈 시퀀싱에 의해 바이러스 genomes를 증폭하는 방법을 실시간 PCR 분석을 사용하여 플라즈마 바이러스 RNA를 추출하고 계량하는 방법에 대해 설명합니다.

표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

항 레트로 바이러스 치료 (ART)를 실패한 HIV-1에 감염된 개인에 대한 약제 내성 검사는 미래의 치료법을 안내하고 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 높은 HIV의 유행하지만 자원 제한 설정에서 최적화 개인과 집단의 건강 결과는 궁극적으로 저렴하고 접근 약제 내성 유전자형과 해석 방법이 필요합니다.

자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

거의 동종발생 바이러스 간의 성장 경쟁은 상대적 복제 적합성을 결정하기 위한 민감한 측정을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 재조합 HIV-1 클론의 구축, 바이러스 전파 및 성장 경쟁, 민감하고 일관된 결과를 산출하도록 최적화된 분석 방법이 포함됩니다.

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

여기, 우리는 인간 세포에서 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 기반의 레트로 바이러스 벡터의 통합 사이트의 게놈 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명합니다.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

우리는 이전에 나노 기공 시퀀싱 플랫폼에서 앰플리코 기반 전체 게놈 우스투 바이러스 (USUV) 시퀀싱에 대한 프로토콜을 검증했습니다. 여기서, 보다 자세하게 사용되는 방법을 설명하고 나노기공 R10 유량 셀의 오차율을 결정한다.

전체 게놈 나노기공 시퀀싱 검증, 우스투 바이러스를 예로 사용

이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.

양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학

학습하세요 FLIPS 기법을 사용하여 단일 HIV-1 감염 세포에서 전체 길이 프로바이러스를 증폭하고 차세대 시퀀싱으로 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 잠복 HIV 저장고의 유전적 구성을 이해하는 데 필수적입니다.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

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