Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

이 방법은 게놈의 초기 가닥 DNA, 선행 가닥 DNA, 지연 가닥 DNA에 얼마나 많은 리보뉴클레오티드가 통합되어 있는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 효모 게놈의 리보뉴클레아오티드 밀도에 관한 정량적 및 정성적 정보를 제공할 수 있지만 포유류 게놈과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 알칼리성 겔 전기영동은 전체 게놈 및 가닥 특이적 남부 블로팅에서 리보뉴클레오티드 통합에 대한 반 정량적 보기를 제공하여 특정 게놈 자리에서 더 큰 감도와 정량화를 가능하게 합니다.

이 절차를 시작하려면 새로 준비된 효모 게놈 DNA의 각 샘플에 6마이크로리터의 1몰 수산화칼륨을 추가하고 섭씨 55도에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 얼음 위에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 각 샘플에 4마이크로리터의 6-6 알칼리 DNA 로딩 버퍼를 추가합니다.

1%의 아가로스, 50밀리몰의 수산화나트륨 및 1밀리몰의 EDTA pH 8로 구성된 알칼리성 겔을 레인당 24마이크로리터의 DNA 샘플을 로드할 수 있는 빗으로 캐스팅합니다. 샘플 튜브를 간단히 스핀다운합니다. 각 샘플의 전체 24마이크로리터를 알칼리성 아가로스 겔에 로드합니다.

적절한 DNA 크기 마커를 포함합니다. 30 볼트에서 30 분 동안 전기 영동. 그런 다음 전압을 10볼트로 낮추고 18-20시간 동안 전기영동합니다.

다음 날에는 젤을 중화하십시오. 겔을 중화 완충액 1에 담그고 실온에서 45분 동안 부드럽게 저어주면서 배양합니다. 중화 완충액 혼합물을 새 완충액으로 교체합니다.

그리고 45분 더 배양합니다. DNA를 염색하려면 중화된 젤을 1-10000 희석된 sybr gold stain을 함유한 물 200ml에 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 담가둡니다. UV transilluminator를 사용하여 DNA를 시각화합니다.

알칼리성 젤에서 DNA는 모세관 활동에 의해 양전하를 띤 나일론 막으로 옮겨질 것입니다. 먼저 알칼리성 젤을 알칼리성 전달 버퍼에 15분 동안 실온에 담급니다. 다음으로, 나일론 멤브레인을 물에 짧게 적시고 알칼리성 전달 버퍼에 5분 동안 담가둡니다.

아가로스 젤 크기보다 약간 큰 유리 베이킹 접시에 100밀리리터 유리 비커 3개를 뒤집어 전송 플랫폼을 설정합니다. 유리 비커 위에 유리판을 놓습니다. 유리판 위에 3개의 MMCHR 크로마토그래피 용지 두 개를 크게 드레이프합니다.

크로마토그래피 종이 위에 알칼리성 전사 버퍼를 붓고 유리 접시를 반쯤 채웁니다. 5ml 유리 피펫을 사용하여 거품을 부드럽게 펴냅니다. 그 위에 아가로스 젤을 놓습니다.

다시 거품을 매끄럽게 만듭니다. 젤의 모든 가장자리를 파라필름으로 둘러쌉니다. 젤에 소량의 알칼리성 전달 버퍼를 붓습니다.

미리 담근 나일론 멤브레인을 젤 위에 놓고 거품을 매끄럽게 만듭니다. 아가로스 겔 크기로 자른 크로마토그래피 종이 두 장을 넣습니다. 멤브레인 위에 놓고 거품을 매끄럽게 펴십시오.

전사 샌드위치 위에 종이 타월을 많이 쌓고 종이 타월 위에 유리판을 조심스럽게 놓습니다. 상단에 무게가 있는 물체를 추가하고 밤새 실온에서 전송을 진행하십시오. 다음 날에는 전송 스택을 조심스럽게 분리하십시오.

멤브레인을 실온의 중화 완충액 2에 15분 동안 담급니다. UV 크로스 링커를 사용하여 DNA를 하전된 나일론 멤브레인에 가교 결합시킵니다. 자동 크로스 링크 설정을 사용합니다.

혼성화 절차를 시작하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 방사성 표지된 프로브를 준비합니다. 젖은 멤브레인을 혼성화 튜브에 넣고 갓 준비한 혼성화 완충액 25ml를 추가합니다. 섭씨 65도의 혼성화 오븐에서 1-2시간 동안 교대로 배양합니다.

용액을 조심스럽게 붓고 25ml의 혼성화 버퍼와 프로브를 추가합니다. 섭씨 65도에서 16-18시간 동안 교대로 배양합니다. 다음으로 용액을 방사성 폐기물 용기에 붓습니다.

인산염 STS 세척 용액 1을 혼성화 튜브에 넣고 실온에서 5분 동안 회전합니다. 이러한 방식으로 인산염 STS 세척 용액 1회를 사용하여 각각 5분씩 5회 세척합니다. 인산염 STS 세척액 1회로 5회 세척 후 인산염 STS 세척액 2회, 15분씩 65°C에서 교대로 멤브레인을 2회 세척합니다.

핀셋을 사용하여 혼성화 튜브에서 멤브레인을 제거하고 멤브레인을 열린 플라스틱 슬리브 프로텍터에 넣습니다. 덮고 이미징 플레이트에 노출시킵니다. 필요한 경우 다른 프로브로 블롯을 벗겨내고 다시 프로브합니다.

스트립하려면 멤브레인을 25ml의 50% 포름아미드 2XSSPE 용액으로 덮고 섭씨 65도에서 2시간 동안 배양합니다. 용액을 방사성 폐기물 용기에 붓습니다. 혼성튜브에 인산염 STS 세척액 2호를 넣고 섭씨 65도에서 15분 동안 회전합니다.

앞서 설명한 바와 같이 prehybridization 및 hybridization을 수행하기 전에 신호가 없는지 확인하기 위해 geiger counter로 멤브레인을 확인하십시오. 이 겔 이미지에는 수산화칼륨 유무에 관계없이 처리된 효모 게놈 DNA가 있으며, RNH2가 결핍된 세포가 게놈에 더 많은 리보뉴클레오티드를 보유하고 있음을 보여줍니다. 중합효소 2의 M644L 변이체는 리보뉴클레오티드를 통합하는 능력을 감소시키는 반면, M644G 돌연변이는 야생형 중합효소보다 더 많은 리보뉴클레오티드를 통합합니다.

알칼리성 아가로스 겔은 가닥 특이적 서던 블롯 분석으로 추가로 프로브할 수 있습니다. 이 예에서 프로브는 두 개의 반대 방향으로 ARS306 가까이에 삽입된 URA3 리포터 유전자 내의 초기 선행 DNA 가닥에 어닐링됩니다. 초기 선행 가닥 특이적 프로브를 사용한 서던 블로팅의 대표적인 결과는 리보뉴클레오티드 및 야생형 균주 및 리보뉴클레오티드 통합에 난잡한 중합효소 알파, 델타 및 엡실론의 변이체를 발현하는 균주에서 리보뉴클레오티드 및 초기 선행 가닥 DNA의 알칼리 절단으로 인한 DNA 단편화 패턴을 보여줍니다.

이 그래프는 남쪽 블롯에서 각 차선의 합계의 분수로 방사성 신호의 정량화를 보여줍니다. 절차를 시도하는 동안 항상 잠금 얼굴 세포에서 새로 분리된 DNA를 사용해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 DNA 복구 분야의 연구자들이 복제 DNA 중합효소에 의해 리보뉴클레오티드가 통합된 밀도와 가닥을 정량화할 수 있는 길을 열었습니다.

이 절차에 따라 게놈 내 리보뉴클레오티드의 위치와 같은 추가 질문에 답하기 위해 가수화 말단 염기서열분석 또는 HydEn-seq와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 방사성 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 작업대와 장비의 오염을 방지하기 위해 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.