Name: 병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 배우세요 마우스 비장세포를 이용하여 병원체 관련 분자 패턴이 분자 시계 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하는 방법을. 이 기법은 면역학과 생체 리듬 연구에 활용됩니다.

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이 작품에 의해 지원 되었다 하트포드의 대학에서 대학 예술과 과학의 학장의 사무실에서 교수 연구 보조금.

연구 기간 동안 동물 보호 및 치료 건강의 국가 학회 정책 준수, 기관 지침에 따라 되었고 하트포드의 대학 동물 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 동물의 유입
참고: 20 주 된 남성 B6129SF2/J 쥐 연구에 사용 됩니다.
<ol><li>쥐 라이트 12 h (표준 오버 헤드 화이트 빛)를 끌고가 다/어두운 12 h 주기 2 주 전에 실험에 대 한. 참고: 여기 zeitgeber 시간 (ZT) 0 해당 하에 조명과 ZT12 조명, 다른 모든 환경 요인 (즉, 음식, 물, 그리고 실내 온도)를 유지 하면서 지속적인 21.</li>
</ol>2. 악기, 문화 매체, 및 도전 매체 준비
<ol><li>압력솥 집게와가 위 해입니다. 알루미늄 호 일 및 고압에 두르고 현미경 슬라이드의 쌍을 바꿈.</li>
	<li>10%의 최종 농도에 소 태아 혈 청 (FBS)를 추가 하 여 RPMI 1640 배양을 준비 합니다. 다음 PAMPs 문화 매체에 추가 하 여 10 mL 50 mL 튜브에 도전 매체의 준비 (RPMI 10 %FBS); LPS (5 µ g/mL), ODN1826 (5 µ g/mL), Listeria monocytogenes 열 사망 (108 HKLM/mL), 또는 다른 PAMP 제안된 농도에.</li>
	<li>문화 매체와 도전 매체 물 욕조에 37 ° C에 따뜻하고 실 온에서 약 70 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.2) 계속.</li>
	<li>얼음에 10 mL 피 펫 및 50 mL 튜브를 피펫으로 원조를 사용 하 여 문화 매체의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>미생물 오염을 방지 하기 위해 비 커에가 위와 집게를 해 부의 100 mL 비 커와 장소 끝에 70% 에탄올의 약 30 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 버퍼 실내의 모든 1 ml (후드 연기) 10 µ L β-Mercaptoethanol을 추가 하 여 RNA 격리에 대 한 세포의 용 해 버퍼 준비. 필요한 (600 µ L 당 약 1 x 106 셀로 구성 된 샘플) 될 금액만 확인 합니다. 참고: 버퍼 실내의 RNA 추출 키트 실리 카 막에 RNA의 바인딩을 지 원하는 구성 요소입니다.</li>
</ol>3. Splenocyte 절연 및 도전
<ol><li>그들의 원래 감 금 소에 그들을 유지 하 고 계속 호흡 중지 후 1 분 CO2 를 공급 3 L/분의 유량에 케이지를 CO2 를 추가 하 여 마 취 법을 통해 특정 zeitgeber 시간에 마우스를 안락사.</li>
	<li>두개골의 기지에서 목의 양쪽에 엄지와 검지 손가락을 배치 하 여 자 궁 경부 전위를 통해 죽음을 확인 합니다. 또는 눌러 두개골의 기지에서 막대 (를 사용 하 여 다른 손) 신속 하 게 당기면 꼬리 또는 두개골22에서 자 궁 경부 척추의 분리를 일으킬 뒷 다리 사지의 기지.</li>
	<li>70% 에탄올과 종이 타월로 닦아 마우스 트렁크를 스프레이. 다시 하 고 그것의 오른쪽으로 약간 기울어진에 마우스를 놓습니다. 버려야 모피, 해 부를 사용 하 여가 위, 마우스의 왼쪽된 측면을 따라에 대 한 중간 앞, 뒤 다리 사이.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 복을 신중 하 게 만들 비장의 손상 수 없습니다 절 개. 집게로 비장을 제거 하 고 얼음에 문화 미디어의 약 10 mL를 포함 하는 살 균 50ml 튜브에 배치. 나머지 동물에 대 한 반복 합니다. 참고: 비장은 신장 콩의 색상 이며 길고 신장 보다 아첨.</li>
	<li>
문화 매체의 2 mL와 함께 한 비장 작은 멸 균 페 트리 접시에 전송.
	<ol>
<li>두 메 마른 서 리 낀된 슬라이드의 젖 빛된 부분 사이 그것을 연마 하 여 비장을 균질. 만약에 가능 하다 면, 계속 문제 및 셀 매체에 균질 화 과정.</li>
		<li>일단 철저 하 게, 40 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 튜브에는 splenocytes를 포함 하는 문화 매체의 2 개 mL를 피펫으로 무 균.</li>
		<li>나머지 spleens 문화 매체와 셀 멤브레인 두르고 슬라이드의 새로운 쌍, 50 mL 튜브를 사용 하 여 위의 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각각 10 mL/튜브의 전체 볼륨에 대 한 splenocytes를 포함 하는 50 mL 튜브의 감기 문화 매체의 8 mL를 추가 합니다. 당 밀리는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수를 결정 합니다.</li>
	<li>6 잘 배양 배지를 약 1 x 106 셀/잘을 추가 합니다. 셀 추가 실험을 위해 사용 되 고 다른 PAMPs의 번호에 해당 하는 컨트롤을 포함 하는 우물의 수를 잘 합니다. 각 우물에 문화 매체의 또는 도전 매체의 3 mL 3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>5% CO2 3 시간에서 37 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>잘 사용 하 여 1000 µ L 피펫으로 팁 P1000 micropipette에 연결 된 아래에서 세포를 다쳤어요. 15 mL 튜브에 동일한 1000 µ L 피펫으로 팁을 사용 하 여 셀을 포함 하는 매체를 전송 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 167 x g 에서 원심 분리를 통해 셀 작은 상쾌한을 제거 하 고 PBS의 5 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척.</li>
	<li>작은 셀 5 분 동안 167 x g 에서 두 번째 시간, 상쾌한, 제거 하 고 셀 펠 릿을 위하여 세포를 lyse 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L를 추가. 그런 다음 RNA 격리를 진행 합니다.</li>
</ol>4. RNA 분리 및 cDNA 합성
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 splenocytes에서 RNA를 분리 하 고 '옵션'에 열 DNA 소화를 수행.</li>
	<li>CDNA 합성 전에 cDNA 합성 키트의 농도 범위 내에서 최적의 RNA (최대 2 µ g) 인지 확인 하는 microvolume 분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 농도 결정 합니다.</li>
	<li>
각 제조업체의 지침에 따라 역방향 전송 키트를 사용 하 여 샘플의 종합 cDNA. RNA의 10 µ L를 사용 하 여 각 20 µ L 총 반응 볼륨에서 샘플에 대 한. 반전 녹음 방송 (thermocycler 실행) 완료에 추가 20 μ H2O 각 반응에.
</li>
	<li>P10 또는 P20 micropipette 준비는 cDNA를 0.5 mL 튜브에는 몇 가지 컨트롤 샘플 (예를 들어, 5에서 10 µ L의 총 2 샘플 µ L)에서 mRNA를 풀을 사용 하 여 표준 커브를 생성 합니다.<ol>
<li>10 µ L 2 x 역전사 마스터 믹스를 추가 합니다.</li>
		<li>반전 녹음 방송의 완료에 표준 곡선에 대 한 희석 시리즈에 사용 시작 농도 ("1") 될 것입니다 반응 관에 H2O 10 µ L을 추가 합니다.</li>
		<li>P100 또는 P200 micropipette를 사용 하 여 지정 하는 10-1, 10-2, 10-3, 그리고 10-44 개의 0.5 mL 튜브에 물 45 µ L을 추가 하 여 10 희석 시리즈 (1 ~ 10-4)를 수행 합니다.<ol>
<li>P20 micropipettor, 아래로 pipetting으로 믹스를 사용 하 여 첫 번째 튜브 (10-1)에 "1" 시작 농도의 5 µ L를 추가, 여러 번 다음 튜브에 10-1 튜브에서 전송 5 µ L 지정 10-2 와 혼합.</li>
			<li>5 µ L 10-3 을 지정 하는 튜브에 10-2 관에서 P20 micropipette를 사용 하 여 전송 및 혼합. 5 µ L 10-4 지정 관에 10-3 관에서 P20 micropipettor를 사용 하 여 전송 및 혼합.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)
<ol><li>정량에 의해 mRNA 수준의 상대 정량을 확인 합니다. 내 실험에서 "정량-상대 표준 곡선" 및 "TaqMan" 화학을 선택. 변경 10 µ L. 반응 볼륨 플레이트 레이아웃 (예:대상 유전자, 표준 곡선, 기자, 등)에 관련 된 정보를 입력 합니다.</li>
	<li>0.5 µ L의 뇌관/조사 분석 결과, 유전자 표현 마스터 믹스의 5 µ L, H2O 2 µ L 및 2.5 포함 되도록 반응 준비 µ L의 cDNA (10-100 ng).<ol>
<li>반응, 표준 곡선에서 그들을 포함 하도록 확인 하 고 중복 계정을 2 추가 반응에서 각 반응이 수행 부정적인 컨트롤의 숫자에 의해 (cDNA)를 제외 하 고 위의 시 약의 각각 곱하여 마스터 믹스를 준비 대 한 pipetting 변화.</li>
		<li>피펫으로 7.5 µ L는 micropipette 또는 멀티 채널 피 펫 96-잘 반응 판에 미리 결정 된 우물에 준비 된 마스터 믹스의. 피펫으로 미지수 및 표준에 대 한 적절 한 우물에 cDNA의 2.5 µ L 및 2.5 µ L H2O 부정적인 제어 우물에의.</li>
		<li>다양 한 분자 시계 유전자에 대 한 입문서/조사 분석을 포함 하 고 또한 내 생 컨트롤 (예를 들어, β-말라)에 대 한 분석 결과 포함 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상대 식 값을 결정 하기 위해 각 복제에 대 한 상대적인 평균 수량을 계산 후, 각 샘플에 대 한 β-걸에 대 한 평균 상대 수량으로 대상 유전자에 대 한 평균 상대 수량 분할.</li>
</ol>6. 통계 분석
<ol><li>통계 분석 소프트웨어를 사용 하 여 열 통계 옵션 아래 프로그램으로 데이터를 입력 합니다. 일방통행 ANOVA Dunnett의 포스트 hoc 테스트 컨트롤 대 PAMP 도전 후 시계 유전자 발현의 의미 값 간의 차이 평가 하기 위해 선택 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 상관이 있다.

이 프로토콜 내에서 계량 하 여 유전자 발현을 결정 하는데 사용 되는 RNA의 순도 평가 microvolume 분 광 광도 계를 사용할 수 있습니다. 260에 자외선을 흡수 하는 핵 산 nm, 일반적으로 280에 빛을 흡수 하는 단백질 nm, 다른 잠재적인 오염 물질 RNA 추출 절차 (예, 페 놀) 동안 사용 되는 230에서 감지 하는 동안 nm. 따라서, () 비율 260/280에서 흡 광도 평가 하 여 nm (단백질 RNA) 및 260/230 nm (비 단백질 오염 물질에 RNA) RNA의 품질 평가 될 수 있다. 높은 품질 RNA는 단백질 오염을 나타내는 1.8-2.1, 더 낮은 비율으로 간 A260/280 비율. 순수한 RNA 샘플 2.0의 A260/230 비율이 있을 것 이다.
(즉, Per2, 시계, 레 브-erbα, 및 Dbp), 대상 유전자의 상대적 식을 결정할 때 생 제어 유전자 (유전자는 식에서 수준 차이가 없습...

생리학 및 행동의 거의 모든 측면에 대 한 24 시간 진동 총괄, 포유류, 마스터 클록은 시상 하 부1,2의 suprachiasmatic 핵 (SCN) 내에 있습니다. Organismal 수준에 생물학 과정을 통제, 이외 마스터 클록도 시체3,,45를 통해 주변 세포 시계를 동기화 합니다. 핵심 이루어져 있다 기간 (Per1-3), 신장의 (Cry1-2), Bmal1을 최소한 3 개의 맞물리는 transcriptional 변환 피드백 루프 분자 시계 기계 장치에 의하여 이루어져 있다, 하는 동안 그리고 시계 유전자6,7. 핵심 분자 시계의 정확한 타이밍을 유지, 게다가 일부 보조 시계 유전자 제품 (예, 레 브 erbα 및 Dbp) 또한 비 시계 유전자의 표현을 규제, 즉, 시계 제어 유전자 (CCGs)6 , 7.
기능성 분자 시계 다양 한 면역 조직 (예를 들어, 비장 및 림프절)8 셀 (예를 들어, B 세포, 수지상 세포, 대 식 세포)8,9에서 설명 했습니다. 이 세포를 감지 하 고 응답 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs), 수용 체 통행세 같이 (TLRs)10등 타고 난 면역 인식 수용 체를 통해 보존된 미생물 구성 요소. 날짜 하려면, 13 기능 TLRs는 설명, 세균성 세포 벽 구성 요소, flagellar 단백질, 핵 산 미생물10등 미생물 성분 인식 하는. PAMP, lipopolysaccharide (LPS), TLR4에 의해 인식 하는 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 organismal와 분자 수준에서 circadian 리듬 변경 표시 되었습니다. 예를 들어 vivo에서 LPS의 빛 같은 위상 지연 마우스11 활동에 의해 측정 된 유도 도전과 SCN에 간 현장에서 교 잡 그리고 양이 많은 PCR에 의해 결정으로 감소 된 시계 유전자 발현에 쥐12에서 각각. vivo에서 도전 LPS와, 후 인간의 말 초 혈액 백혈구13 및 피하 지방 조직14 의 분석 통해 정량 측정으로 여러 시계 유전자의 바꾸 인된 표현을 밝혔다. 마지막으로, 인간의 세포와도 마우스 복 막 대 식 세포의 LPS 도전 비보 전 시계 식 정량14측정으로 변경.
여기, 우리 PAMPs LPS, ODN1826 (를 포함 하는 합성 oligonucleotides CpG 모티브 unmethylated)의 영향을 평가 하기 위해 프로토콜 설명 및 열 죽 Listeria monocytogenes (HKLM)에 의해 인식 TLR4, TLR9, 그리고 TLR2, 각각,에 분자 시계 유전자 식 마우스 splenocytes에. 프로토콜에는 마우스 splenectomy splenocyte 격리 및 도전, RNA 추출, cDNA 합성, 정량 여러 시계 유전자의 표정을 평가 하 포함 되어 있습니다. 이 프로토콜 면역 세포와 아주 작은 동물의 많은 수의 적시 취득 또는 세포 조작, 다음 수 있는 비보 전 다양 한 PAMPs와 도전. 분자 시계 변조 면역 응답8,,1516의 다양 한 측면을 보여줘 왔다, 그러므로, 분자 시계의 대부분의 적절 한 시간에 따른 변형 자유로울 것는 면역 응답입니다. 또한, 이후 circadian 리듬의 붕괴는 심각한 병 리17,18,,1920으로 이어질 수 있습니다., 그것은 연구자 도전 splenocytes의 넓은 범위에 대 한 관심의 있을 수 있습니다. 분자 시계에 그들의 영향을 평가 하 고.

<table><tbody><tr><td>서리 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ltrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>ODN1826</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-1826-1</td><td></td></tr><tr><td>HKLM</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-hklm</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-043</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104 또는 74106</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase 세트</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>Denville</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 분석 b-actin</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00607939_s1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 어세이 Per2</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00478113_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 어세이 Rev-erba</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00520708_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 어세이 Bmal1</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00500226_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 어세이 Dbp</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00497539_m1</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 기계 StepOnePlus</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>ThermoFisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96웰 반응 플레이트(0.1mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>통계 분석 소프트웨어</td><td>Prism 7.0a</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 splenocytes 사용 하 여

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

유전자 발현을 행동, circadian 리듬 생리학의 거의 모든 측면을 통제 한다. 여기, 우리 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826, 및 열 죽 Listeria monocytogenes 와 마우스 splenocytes 도전 circadian는 분자에 그들의 효과 검사 하는 방법론을 제시 시계입니다. 이전, 연구는 다양 한 모델 (예: 마우스, 쥐, 및 인간)의 구색에서 vivo에서 및 비보 전 접근을 사용 하 여 분자 시계에 LPS의 영향 검토에 집중 했다. 이 프로토콜에는 분리와 시계 유전자 식 후 도전 정량 PCR 통해 평가 하는 방법론으로 splenocytes, 도전 설명 합니다. 이 방법은 시계의 식 변경할 수 있는 다른 분자 뿐만 아니라 분자 시계에 미생물 구성 요소 뿐만 아니라 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 이렇게 애타게 떨어져 어떻게 PAMP 통행세 같이 수용 체 상호 작용에 영향을 미치는 시계 식의 분자 메커니즘을 활용 될 수 있습니다.

마우스 ZT13에 희생 했다, splenocytes 고립 된 비보 전 PAMPs LPS, ODN1826, 또는 HKLM 도전. 3 h 후 RNA 격리, 고 정량 시계, Per2, Dbp, 및 레 브 erbα 당된 컨트롤 셀에 비해 분자 시계 유전자의 상대 식 수준을 평가 하는 데 사용 되었다. PAMP 도전 후 시계 식 레벨 제어 셀 (그림 1A) 식 보다 크게 다른 되지 않았습니다. Per2 식 레벨 LPS와 ODN1826 당된 컨트롤 (그림 1B)에 비해 도전 셀에 크게 상승 했다. LPS는 mRNA 수준 당된 컨트롤 (그림 1<stron...

이 프로토콜 마우스 splenocytes를 사용 하 여 분자 시계 유전자 발현을 변경 하는 병원 체 관련 된 분자 패턴을 검색 하는 기술을 설명 합니다.

병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

이 방법은 미생물 성분이 분자 시계를 어떻게 변화시키는지와 같은 면역학 및 시간생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행하기 쉽고, 분자 시계에 대한 다양한 미생물 성분의 영향을 평가하며, 재현성이 높다는 것입니다. 프로토콜을 시작하려면 RPMI 1640에 소 태아 혈청을 최종 농도 10%로 추가하여 배양 배지를 준비합니다.나열된 PAMP 배양 배지를 추가하여 50ml 튜브에서 테스트할 각 PAMPS에 대해 10ml의 챌린지 배지를 준비합니다.미리 준비한 마우스 트렁크에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 닦습니다. 마우스를 오른쪽으로 약간 기울어진 뒤로 눕힙니다. 다음으로, 해부 가위를 사용하여 쥐의 왼쪽을 따라 앞다리와 뒷다리 사이의 중간 정도에서 털을 잘라냅니다.겸자를 사용하여 복막을 잡고 비장을 손상시키지 않고 조심스럽게 절개합니다. 집게로 비장을 제거하고 얼음 위에 약 10ml의 배양 배지가 들어 있는 멸균 50ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 2ml의 배양 배지가 있는 비장을 작고 멸균된 페트리 접시에 옮깁니다.두 개의 멸균 젖빛 슬라이드의 젖빛 부분 사이에서 비장을 분쇄하여 비장을 균질화합니다. 완전히 균질화되면 비장 세포를 포함하는 2ml의 배양 배지를 40미크론 나일론 세포 여과기를 통해 50ml 튜브에 피펫팅합니다. 비장 세포를 포함하는 50 밀리리터 튜브 각각에 8 밀리리터의 저온 배양 배지를 추가하여 튜브당 총 부피는 10 밀리리터입니다.혈구계를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 결정합니다. 웰당 6번째 세포에 약 10배의 10을 6웰 배양 플레이트에 추가합니다. 세포를 추가한 후 3ml의 배양 배지 또는 3ml의 챌린지 배지를 세포에 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 플레이트를 3시간 동안 배양합니다. P1000 마이크로피펫에 부착된 1, 000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 웰 바닥에서 세포를 긁어냅니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 세포가 포함된 배지를 15ml 튜브로 옮깁니다.실온에서 5분 동안 167배 g으로 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 PBS 5ml로 세포 펠릿을 세척합니다. 5분 동안 167배 g으로 세포를 두 번째로 펠릿화한 후 상등액을 제거하고 600마이크로리터의 용해 완충액을 세포 펠렛에 추가합니다.제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 비장 세포에서 RNA를 분리하고 선택적 온-컬럼 DNA 분해를 수행합니다. 제조업체의 지침에 따라 역전사 키트를 사용하여 각 샘플에 대해 cDNA를 합성합니다. 총 반응 부피가 20마이크로리터인 각 샘플에 대해 10마이크로리터의 RNA를 사용합니다.몇 가지 대조군 샘플에서 mRNA를 0.5ml 튜브로 당겨 정량적 PCR을 수행할 때 표준 곡선에 사용할 cDNA를 준비합니다. 10마이크로리터의 2X 역전사효소 마스터 믹스를 추가합니다. 역전사가 완료되면 반응 튜브에 10마이크로리터의 물을 첨가하며, 이는 표준 곡선에 대한 희석 계열의 시작 농도 역할을 합니다.4개의 0.5 밀리리터 튜브에 45마이크로리터의 물을 첨가하여 마이너스 10에 10, 마이너스 2에 10, 마이너스 3에 10, 마이너스 4에 10을 지정하여 10배 희석 시리즈를 수행합니다. P20 마이크로피펫터를 사용하여 시작 농도 1을 두 번째 튜브에 5마이크로리터, 마이너스 1에 10을 추가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음 10에서 마이너스 1 튜브까지 5마이크로리터를 10에서 마이너스 2 튜브로 지정된 튜브로 옮기고 혼합합니다.P20 마이크로피펫을 사용하여 10에서 마이너스 2까지의 튜브에 5마이크로리터를 넣고 10에서 마이너스 3으로 지정된 튜브에 넣고 혼합합니다. 마지막으로, P20 마이크로파이펫터를 사용하여 10에서 마이너스 3 튜브까지 5마이크로리터를 10에서 마이너스 4로 지정된 튜브로 옮기고 혼합합니다. 0.5 마이크로리터의 프라이머 프로브 분석, 5 마이크로리터의 유전자 발현 마스터 믹스, 2 마이크로리터의 물 및 2.5 마이크로리터의 cDNA를 포함하도록 반응을 준비합니다.RNA 샘플을 96웰 qPCR 플레이트에 피펫팅합니다. 다양한 molecular clock gene에 대한 프라이머 프로브 assay를 배양하고 endogenous control에 대한 assay를 포함시킨 후 qPCR 기계에 로드하여 mRNA 수준의 상대적 정량을 측정합니다. 실험 설정 내에서 정량 분석, 상대 표준 곡선 및 TaqMan 화학을 선택합니다.다음으로 반응 부피를 10마이크로리터로 변경합니다. 플레이트 레이아웃에 관련 정보를 입력합니다. 분자 시계 유전자, clock, Per2, Dbp 및 Rev-erb alpha의 상대적 발현 수준을 평가하기 위해 분리된 RNA에서 qPCR을 수행했습니다.PAMP 챌린지 후 clock 발현 수준은 대조 세포와 비교하여 크게 다르지 않았습니다. Per2 발현 수준은 LPS 및 ODN1826 문제가 있는 세포에서 도전받지 않은 대조군과 비교할 때 크게 증가했습니다. LPS는 mRNA 수준이 도전받지 않은 대조군보다 현저히 낮았기 때문에 Rev-erb 알파 발현을 변경하는 유일한 PAMP였습니다.대조군과 비교할 때 각 PAMP에 대한 챌린지 후 Dbp에서 현저히 낮은 mRNA 수치가 관찰되었습니다. 이 절차에 따라 PAMP 이외의 분자를 사용하여 비장 세포의 분자 시계에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

출처: 마덴스파허, J. H. 및 페슬러, M. B. 쥐에서 실험적 세균성 폐렴을 유도하고 표현형을 구분하는 비침습적이고 기술적으로 비집약적인 방법. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 감염된 쥐의 비장 내 박테리아 부하를 정량화하여 감염의 심각성을 평가하는 과정을 보여줍니다. 균질화된 비장은 연속적으로 희석되어 도판을 하여 총 박테리아 부하를 측정합니다. 그 결과 얻은 데이터는 전신 조직 내 숙주-병원체 상호작용에 대한 통찰을 제공합니다.

감염 연구를 위한 쥐 비장 내 박테리아 부하 평가

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

bm12 림프구가 C57BL/6 수용자로 이식되는 것은 전신 홍반성 루푸스의 확립된 모델입니다. 여기에서는 이 모델을 사용하여 질병을 시작하는 방법과 유세포 분석을 통해 T 여포 보조 세포, 생식 중심 B 세포 및 형질 세포를 특성화하는 방법을 설명합니다.

C57BL / 6 마​​우스의 전신 홍 반성 루푸스의 BM12 유도 성 모델 (SLE)

여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

이 프로토콜에서는 조직 문화 supernatants 자극된 마우스 splenocytes 다중 구슬 기반된 immunoassay 플랫폼 및 교류 cytometer 사용 하 여에서 수집에 동시에 여러 cytokine 목표의 정량화를 설명 합니다.

Cytokine Profiling Immunoassay Cytometric 구슬-기반 플랫폼을 사용 하 여 자극된 마우스 Splenocytes의 다중화

이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

MALT1 타고 난 면역을 조절 하지만 병이 정의 남아 어떻게이 발생 합니다. 우리는 타고 난 신호 통행세 같이 또는 C 형 lectin 같이 수용 체의, MALT1 골수성 cytokines의 생산 조절 시연 다운스트림 다운스트림 MALT1의 기여를 푸는 선택적 MALT1 paracaspase 억제제 MLT-827 사용 C-타입 lectin 같이 수용 체의 선택적으로.

골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

여기서, 우리는 뮤린 이차 림프기관에서 사이토카인 인터페론 감마를 분비하는 세포의 내부 국소화를 가시화하는 간단한 공초점 이미징 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 다양한 조직에서 다른 사이토카인의 시각화를 위해 확장될 수 있다.

리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

배우세요 마우스 비장세포를 이용하여 병원체 관련 분자 패턴이 분자 시계 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하는 방법을. 이 기법은 면역학과 생체 리듬 연구에 활용됩니다.

병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여

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