병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여

이 프로토콜 마우스 splenocytes를 사용 하 여 분자 시계 유전자 발현을 변경 하는 병원 체 관련 된 분자 패턴을 검색 하는 기술을 설명 합니다.

이 방법은 미생물 성분이 분자 시계를 어떻게 변화시키는지와 같은 면역학 및 시간생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행하기 쉽고, 분자 시계에 대한 다양한 미생물 성분의 영향을 평가하며, 재현성이 높다는 것입니다. 프로토콜을 시작하려면 RPMI 1640에 소 태아 혈청을 최종 농도 10%로 추가하여 배양 배지를 준비합니다.나열된 PAMP 배양 배지를 추가하여 50ml 튜브에서 테스트할 각 PAMPS에 대해 10ml의 챌린지 배지를 준비합니다.

미리 준비한 마우스 트렁크에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 닦습니다. 마우스를 오른쪽으로 약간 기울어진 뒤로 눕힙니다. 다음으로, 해부 가위를 사용하여 쥐의 왼쪽을 따라 앞다리와 뒷다리 사이의 중간 정도에서 털을 잘라냅니다.

겸자를 사용하여 복막을 잡고 비장을 손상시키지 않고 조심스럽게 절개합니다. 집게로 비장을 제거하고 얼음 위에 약 10ml의 배양 배지가 들어 있는 멸균 50ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 2ml의 배양 배지가 있는 비장을 작고 멸균된 페트리 접시에 옮깁니다.

두 개의 멸균 젖빛 슬라이드의 젖빛 부분 사이에서 비장을 분쇄하여 비장을 균질화합니다. 완전히 균질화되면 비장 세포를 포함하는 2ml의 배양 배지를 40미크론 나일론 세포 여과기를 통해 50ml 튜브에 피펫팅합니다. 비장 세포를 포함하는 50 밀리리터 튜브 각각에 8 밀리리터의 저온 배양 배지를 추가하여 튜브당 총 부피는 10 밀리리터입니다.

혈구계를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 결정합니다. 웰당 6번째 세포에 약 10배의 10을 6웰 배양 플레이트에 추가합니다. 세포를 추가한 후 3ml의 배양 배지 또는 3ml의 챌린지 배지를 세포에 추가합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 플레이트를 3시간 동안 배양합니다. P1000 마이크로피펫에 부착된 1, 000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 웰 바닥에서 세포를 긁어냅니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 세포가 포함된 배지를 15ml 튜브로 옮깁니다.

실온에서 5분 동안 167배 g으로 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 PBS 5ml로 세포 펠릿을 세척합니다. 5분 동안 167배 g으로 세포를 두 번째로 펠릿화한 후 상등액을 제거하고 600마이크로리터의 용해 완충액을 세포 펠렛에 추가합니다.

제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 비장 세포에서 RNA를 분리하고 선택적 온-컬럼 DNA 분해를 수행합니다. 제조업체의 지침에 따라 역전사 키트를 사용하여 각 샘플에 대해 cDNA를 합성합니다. 총 반응 부피가 20마이크로리터인 각 샘플에 대해 10마이크로리터의 RNA를 사용합니다.

몇 가지 대조군 샘플에서 mRNA를 0.5ml 튜브로 당겨 정량적 PCR을 수행할 때 표준 곡선에 사용할 cDNA를 준비합니다. 10마이크로리터의 2X 역전사효소 마스터 믹스를 추가합니다. 역전사가 완료되면 반응 튜브에 10마이크로리터의 물을 첨가하며, 이는 표준 곡선에 대한 희석 계열의 시작 농도 역할을 합니다.

4개의 0.5 밀리리터 튜브에 45마이크로리터의 물을 첨가하여 마이너스 10에 10, 마이너스 2에 10, 마이너스 3에 10, 마이너스 4에 10을 지정하여 10배 희석 시리즈를 수행합니다. P20 마이크로피펫터를 사용하여 시작 농도 1을 두 번째 튜브에 5마이크로리터, 마이너스 1에 10을 추가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음 10에서 마이너스 1 튜브까지 5마이크로리터를 10에서 마이너스 2 튜브로 지정된 튜브로 옮기고 혼합합니다.

P20 마이크로피펫을 사용하여 10에서 마이너스 2까지의 튜브에 5마이크로리터를 넣고 10에서 마이너스 3으로 지정된 튜브에 넣고 혼합합니다. 마지막으로, P20 마이크로파이펫터를 사용하여 10에서 마이너스 3 튜브까지 5마이크로리터를 10에서 마이너스 4로 지정된 튜브로 옮기고 혼합합니다. 0.5 마이크로리터의 프라이머 프로브 분석, 5 마이크로리터의 유전자 발현 마스터 믹스, 2 마이크로리터의 물 및 2.5 마이크로리터의 cDNA를 포함하도록 반응을 준비합니다.

RNA 샘플을 96웰 qPCR 플레이트에 피펫팅합니다. 다양한 molecular clock gene에 대한 프라이머 프로브 assay를 배양하고 endogenous control에 대한 assay를 포함시킨 후 qPCR 기계에 로드하여 mRNA 수준의 상대적 정량을 측정합니다. 실험 설정 내에서 정량 분석, 상대 표준 곡선 및 TaqMan 화학을 선택합니다.

다음으로 반응 부피를 10마이크로리터로 변경합니다. 플레이트 레이아웃에 관련 정보를 입력합니다. 분자 시계 유전자, clock, Per2, Dbp 및 Rev-erb alpha의 상대적 발현 수준을 평가하기 위해 분리된 RNA에서 qPCR을 수행했습니다.

PAMP 챌린지 후 clock 발현 수준은 대조 세포와 비교하여 크게 다르지 않았습니다. Per2 발현 수준은 LPS 및 ODN1826 문제가 있는 세포에서 도전받지 않은 대조군과 비교할 때 크게 증가했습니다. LPS는 mRNA 수준이 도전받지 않은 대조군보다 현저히 낮았기 때문에 Rev-erb 알파 발현을 변경하는 유일한 PAMP였습니다.

대조군과 비교할 때 각 PAMP에 대한 챌린지 후 Dbp에서 현저히 낮은 mRNA 수치가 관찰되었습니다. 이 절차에 따라 PAMP 이외의 분자를 사용하여 비장 세포의 분자 시계에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.