Name: 말 왼쪽된 회귀 후 두 신경 근처 헌 혈 줄기 세포의 신경 자극을 유도 주사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 학습하세요 말의 왼쪽 후두회신경 근처에 자가 근육 유래 줄기세포를 주사하는 최소침습 기법을. 전기 신경 자극기를 활용한 이 방법은 말의 후두신경병증 치료에 유망한 재생의학 접근법을 제공합니다.

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몽-르-Soie 말 연구 센터에 의해 연구 자금 되었습니다.

리 대학교의 동물의 윤리적 사용에 대 한 위원회 연구 프로토콜을 승인 했다.
1. 근육 Microbiopsy
<ol><li>육안 검사 및 촉진, 팔꿈치의 지점 및 어깨의 지점 사이 대략 중간 삼각 근 근육의 긴 머리에 샘플 사이트를 식별 합니다.</li>
	<li>약 2 x 2 cm2 전기 깎기와 영역을 클립. 클리핑된 영역 1 분 polyiodide 액체 비누와 알코올 압축 구성 된 수술 스크럽을 적용 합니다. 중심에는 잘린 및 소독에 25g 바늘으로 2 %lidocaine 솔루션의 1 mL를 피하 주사.</li>
	<li>항균 손 비누와 함께 손을 문질러. 멸 균 글러브에 넣어. 에 생 검 바늘과는 trocar를 멸 균 표면으로 일회용 살 균 드 레이프를 사용 합니다.</li>
	<li>그림 1b 및 1 c에서 같이 스프링 메커니즘을 당겨 반자동 14 G 생 검 바늘을 팔. 그것의 기계 장치를 생 검 바늘을 놓습니다. 메 마른 표면에 무장된 생 검 바늘을 놓습니다. 정 및 그림 1는에서 같이 한 obturator 이루어져 trocar 익숙한 얻을.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58023/58023fig1.jpg"> 그림 1 : 생 검 바늘 세트. 생 검 바늘 세트 구성 (a)는 정 맥 및 그것의 obturator 생 검 바늘 (위에서 아래로). 다른 패널 표시 생 검 바늘의 (b)에서 중립 하 고 (c) 무장 위치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58023/58023fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="5"><li>정 고는 obturator를 조립 하 여는 trocar를 준비 하 고 잠금된 위치에 그들을 유지. 이전 desensitized 존을 통해 피부에 수직으로 trocar를 소개 합니다. 어디는 trocar의 팁은 약 1.5 c m 위치에는 trocar를 미리 근육에 깊은. trocar를 꺼내, 해리는 obturator에서 정 하 고 메 마른 표면에는 obturator를 놓습니다.</li>
	<li>정 맥을 통해 무장된 생 검 바늘을 소개 합니다. 바늘과 근육에 피부 절 개를 통해 정을 소개 합니다. 바늘의 팁 삼 두 근 근육의 긴 머리의 중간에 위치에 바늘을 사전.</li>
	<li>생 검 바늘 놓고에 정 함께 생 검 바늘을 꺼내. 정에서 생 검 바늘을 당겨. 메 마른 표면에는 정을 남겨 주세요.</li>
	<li>한 손으로 봄을 당겨 다른 누른 생 검 바늘을 엽니다. 참고: 표본 생 검 바늘의 끝에 표시 됩니다.</li>
	<li>두 번째 사람의 도움으로 샘플 매체를 포함 하는 샘플 튜브를 엽니다. 19 G 피하 주사를 사용 하 여 생 검 바늘에서 작은 근육 조각을 제거. 샘플링 중에 근육 샘플을 놓습니다. 나사 모자와 튜브를 닫고 부드럽게 기울기 샘플 매체에 떠 있도록 2 배.</li>
	<li>생 검 바늘을 팔. 메 마른 표면에서 정 하 고 무장된 생 검 바늘과 캐 뉼 러를 재조 립. 무장된 바늘 및 앞에서 설명한 피부 절 개를 통해 정을 소개 합니다. 근육 조직의 약 20 mg을 샘플링 될 때까지 2-3 배 샘플 프로시저를 반복 합니다. 샘플링 튜브를 닫습니다. 부드럽게 튜브 2 차례 x 근육 조각 샘플링 매체와 함께 혼합.</li>
	<li>4 ~ 8 ° c.에 사이 일정 한 온도에서 실험실에 샘플 발송 참고: 실험실 다음 샘플을 처리 합니다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
	<li>절차는 잘 용납 하 고 샘플링 측면에 통증은 관찰 하지. 근육 통 샘플링 사이트에서의 경우, 적절 한 진통 치료를 관리 합니다.</li>
</ol>2입니다. 셀의 처리
참고:이 연구에 사용 된 줄기 세포 Ceusters 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 방법에 따라 준비 된 7. 그들의 기사는 또한 세포의 특성을 설명 합니다.
<ol><li>열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 (1000 IU/mL)의 5 mL의 20%를 추가 하 여, DF20, 특정 문화 매체를 준비 하 여 시작-스 (10000 µ g/mL), 고 암포 b (250 µ g/mL)는 상용의 500 mL 한 병에 2.5 mL 글루타민과 페 놀 레드 문화 매체입니다.</li>
	<li>24-멀티-잘 접시의 내부 16 우물의 각으로 DF20 문화 매체의 150 µ L를 붓는 다. 나머지 외부 우물에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) [염화 칼륨 (200 mg/L), 칼륨 인산 염 monophasic (200 mg/L), (8, 000 mg/L), 염화 나트륨 및 칼륨 인산 염 diphasic (2160 mg/L)]의 1 mL를 붓으십시오.</li>
	<li>린스 작은 근육 조각 PBS에 2 배. 메스와 집게의 도움으로 매우 작은 조각으로 그들을 분리 및 멀티 잘 접시의 각 내부-16 (메스 칼 날의 팁의 크기)의 작은 조각 장소.</li>
	<li>다음과 같은 조건에서 유지 하는 인큐베이터에서 다 잘 접시를 놓고: 37 ° C, 21% O2및 5% CO2. 거꾸로 현미경 매일 우물을 모니터링 하 고 밖으로 건조에서 세포를 방지 하기 위해 필요한 경우 DF20의 50 µ L를 추가. 참고: 약 10 일 후 있을 것입니다 충분 한 세포를 줄기 세포 격리 수 있도록 explant에서 성장. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
	<li>Explants 셀의 후광 근육 주위 표시 됩니다 때, 근육 조직의 explant 삭제. 각 잘에서 EDTA를 포함 하는 트립 신 솔루션의 150 µ L를 사용 하 여 세포를 분리: 문화 매체를 폐기 1 mL의 PBS로 세포를 씻어, PBS, 삭제 하 고 37 ° c.에서 10 분의 최대 trypsin 솔루션 추가 중지는 trypsin의 행동, 세포 현 탁 액을 수확 하 고, 다음, 200 x g 37 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심을 문화 매체 추가 삭제는 상쾌한 고 균형된 소금 솔루션에 펠 릿을 중단.</li>
	<li>3 계층 (15%, 25%, 및 35%)의 불연속 밀도 그라데이션에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 원심 관 세포 현 탁 액 및 25 ° c.에 20 분 1250 x g 에서 불연속 밀도 그라데이션 솔루션을 포함 하 원심 분리기의 브레이크를 사용 하지 마십시오. 원심 분리 후 불연속 밀도 그라데이션 솔루션의 다른 레이어 사이 나타날 것 이다 다른 밀도와 셀 분수를 관찰 합니다.</li>
	<li>15와 25% 사이 분수와 함께 문화를 계속 합니다. 튜브에 그것을 전송 하 고 균형 잡힌된 소금물으로 씻어. 200 x g 37 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한. 계속 DF20의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 합니다. DF20의 6 mL와 함께 25 c m2의 표면을 가진 세포 배양 플라스 크, 프리 필. Prefilled 셀 문화 플라스 크로 셀을 전송 하 고 다음 조건으로 인큐베이터에 문화: 37 ° C, 21% O2및 5% CO2. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>세포는 거꾸로 한 현미경 아래 매일 모니터링 합니다. 필요한 경우 문화 매체를 변경 (오래 된 매체를 삭제 하 고 새로운 문화 매체의 6 mL을 추가). 문화 요리에서 셀 레이어 광학 현미경을 사용 하 여 미리 정의 된 배율에서 관찰 하 여 세포 합류를 결정 합니다. 셀에 의해 점유 되는 접시의 표면 예상. 모든 관찰 평가 합류 하 수에 대 한 고정된 현미경 배율에서 작동 합니다. 접시의 표면의 85%를 차지 하는 셀, 셀의 통과 함께 진행.</li>
	<li>셀 confluent 때 2.4 단계에서 설명한 대로 동일한 프로토콜 EDTA를 포함 하는 트립 신 솔루션을 사용 하 여 분리 합니다. 그런 다음 200 x g 37 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 상쾌한 삭제 하 고 셀에 DF20의 5 mL의 물의 resuspension 진행. DF20의 25 mL와 prefilled 175 cm2 의 셀 문화 플라스 크에 넣어. 다음과 같은 조건으로 인큐베이터에 플라스 크를 배치: 37 ° C, 21% O2및 5% CO2. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>세포는 거꾸로 한 현미경 아래 매일 모니터링 합니다. 필요한 경우 매체를 변경 (오래 된 매체를 삭제 하 고 새로운 매체의 30 mL을 추가). 셀 confluent 때 2.4 단계에서 설명한 대로 트립 신-EDTA를 사용 하 여 그들을 분리 합니다. 그런 다음 200 x g 37 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 삭제는 상쾌한 고 6 ml DF20의 세포를 중단. 6 175 cm2 플라스 크에 세포 현 탁 액의 장소 1 mL, 각각 prefilled DF20의 25 mL로 하 고 37 ° c (21% O2 , 5% CO2)와 함께 공동2 인큐베이터에서 문화.</li>
	<li>세포는 거꾸로 한 현미경 아래 매일 모니터링 합니다. 필요한 경우 매체를 변경 (오래 된 매체를 삭제 하 고 각 플라스 크에 새로운 매체의 30 mL을 추가). 셀 confluent 때 2.5 단계에서 설명한 대로 트립 신-EDTA를 사용 하 여 그들을 분리 합니다. 그들 원심 200 x g 37 ° C에서 삭제 각 단계에서 상쾌한 10 분 동안에 3 배.</li>
	<li>Bürker 챔버 및 가벼운 현미경의 도움으로 셀을 계산 합니다. 특정 cryopreservation 매체의 10 백만 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.</li>
	<li>Cryopreservation 매체의 1 mL에 1 x 107 셀의 치료 복용량에 deep-freeze와 그들의 사용까지 액체 질소의 증기 단계에서 그들을 저장 합니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>최종 사용에 대 한 드라이 아이스에 유리병에 셀 배.</li>
</ol>3입니다. 세포의 주입
참고: 두 사람이 줄기 세포의 주입을 수행 해야 합니다.
<ol><li>따뜻한 실내 온도를 점차적으로 세포 현 탁 액. 현 탁 액 2 mL 주사기로 발음.</li>
	<li>19 G 피하 주사 바늘으로 경 정 맥으로 detomidine 10 µ g/kg을 주입 하 여 말을 진정. 말의 특성 머리 아래로 위치에 의해 표시 되는 진정의 완전 한 효과 볼 수 5 분 기다립니다.</li>
	<li>그림 2와 같이 20 x 10 c m2 의 영역을 깎기로 말의 왼쪽된 후 두 지역에 클립. 다음, 클리핑된 영역에 polyiodide 비누와 알코올의 수술 스크럽을 적용 합니다.</li>
	<li>말의 왼쪽된 콧구멍을 통해 유연한 표준 비디오 내 시경 놓고는 nasopharynx 전진 합니다. Arytenoid 연골과는 후두개의 전체 보기를 얻을 때까지 내 시경의 위치를 조정 합니다. 내 시경이이 위치에 절차 동안 누른 연산자를 향해 비디오 내 시경 화면을 설정 합니다.</li>
	<li>신경 자극 기의 부정적인 전극에 자극/주입 바늘을 연결 합니다. 바늘의 멸 균 상태를 유지 합니다. 신경 자극 기의 긍정적인 전극 잘린된 피부 영역에 붙어 전극 패치를 연결 합니다.</li>
	<li>주입 라인에 세포 현 탁 액을 포함 하는 주사기를 연결 하 고 시스템의 공기를 튜브 프리 필. 시스템의 볼륨을 기억 하 고 살 균 염 분 솔루션의 같은 볼륨으로 주사기를 준비.</li>
	<li>경우이 기술은 익숙하지 않은, 소독된 5 ~ 7 MHz 선형 초음파 변환기를 사용 하 여 관심 영역에서 해 부 구조를 시각화. 살 균 초음파 젤 커플링을 사용 하 여 이미지 품질을 증가. 후 두 및 후 두의 등 쪽 지역에서 실행 되는 혈관을 시각화.</li>
	<li>일단 익숙한 지역의 해부학, 후 두의 dorsolateral 부분으로 자극/주입 바늘을 소개 합니다. 후 두의 dorsolateral 부분에 접근, 신경 자극 기 2의 전류로 1 Hz 자극 모드에서 시작 mA.</li>
	<li>화면에 내 시경 보기를 관찰 하는 동안 바늘 회귀 후 두 신경의 위치 쪽으로 부드럽게 이동 합니다. 최대한 빨리 왼쪽된 arytenoid 연골의 납치 운동 비디오 화면에 표시 됩니다, 운동 장소에 바늘을 유지 하면서 사라질 때까지 전류를 줄일.</li>
	<li>바늘의 이상적인 위치를 식별 합니다. 0.5에서 모터 응답의 손실을 고려 신경에서 이상적인 거리로 mA. Arytenoid 연골 움직임 0.4 보다 낮은 전류에서 계속 하는 때 mA, 하지 셀, 그는 intraneuronal 주입 될 수 있습니다 주사 할.</li>
	<li>0.5 mA, 관찰에 모터 응답의 손실 107 자가 줄기 세포를 포함 하는 세포 현 탁 액을 주입 하 고 소금물 준비와 주입 라인을 플러시에서 3.6 단계. 이 주입 튜브에 세포 현 탁 액의 나머지를 삽입할 것입니다.</li>
	<li>세포의 주입 후 꺼내 바늘 및 내 시경.</li>
	<li>진정에서 복구 하는 말을 하자. 생 검 사이트 아니 더 이상의 치료가 필요 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서는 신경 자극 기반 접근 방식을 사용 하는 말에 회귀 후 두 신경 근육 파생 된 자가 줄기 세포의 성공적인 응용 프로그램을 설명 합니다. 주변 신경에 근접에 있는이 세포의 주입은 원래 근육 microbiopsy 견본으로 절연, 문화, 및 줄기 세포의 특성의 수확 전에 자세하게 설명 되어 있다. 전기 신경 자극과 신경의 전기 지역화 현재 연구를 위한 봉사 했다 고 회귀 후 두 신경에 직접적인 근접에서 중간 엽 줄기 세포를 주입 하는 데 사용 되었다. 모터 응답은 nasopharynx 통해 비디오 내 시경에 의해 감시 되었다. 바늘의 위치 과정, 다른 신경 자극 했다, 하는 경우 해당 운동 내 시경 화면에 표시 했다. 회귀 후 두 신경의 성공적인 자극 arytenoid 연골의 전형적인 납치 특징 이었다. 한 말, 현지 마 취 arytenoid 근육의 일시적인 마비를 유도 하 주입 했다. 신경에 근접에 있는 세포의 성공적인 이식 현재 연구에서 특히 테스트 되지 않았습니다, 비록 전기-지역화는 신경 및 낮은 전류에서 주입의 줄기 세포는 신경 근처 적용 된 입증 했다. 신경에는 injectate의 근접 추가 로컬 마 취의 주사에 의해 유도 된 성공적인 모터 블록에 의해 입증 되었다.
나머지 5 마리에서 12 분에 3에서 다양 한 성공적인 줄기 세포 주입 될 때까지 첫 번째 자극에서 시간 말 했다 약간 진정 절차 동안, 그들의 준수 한 전기 자극을 증가. 말의 아무도 언제 든 지 불리 한 반응을 보였다 자극의 기간을 나타내는 수 수 연장 좋은 바늘 위치를 얻기 위해 필요한 경우. 가파른 학습 곡선 경우 연산자는이 기술을 사용 하 여이 정기적으로 및 말의 많은 수에 다양 한 해부학와 관찰 될 것으로 예상 된다.
말은 일반적으로 비정상적인 호흡 소리를 선도 왼쪽된 arytenoid 연골의 마비의 다양 한 각도가 특징 이다 RLN에서 고통을 하 고 운동 옹 졸. 영향을 받는 신경의 조직학 밝혀 주변 신경 병16의 전형적인 병 변. 주변 신경 병은 말 초 신경 병 변 장애인된 감각, 움직임, 또는 장기 기능에 이르는 다양 한 종류를 설명 하는 데 사용 하는 용어. 원인은 매우 다양 하 고 당뇨병, 영양 결핍, 특정 약물으로 치료, 외상 성 부상, 허 혈, 또는 감염, 포함 될 수 있습니다 또는 그들이 idiopathic 될 수 있습니다. 원인에 관계 없이, 주변 neuropathies Wallerian 퇴보, 원심 axonopathy, 또는 단편 demyelination 같은 일반적인 histopathological 신호를 공유합니다. 그것은 보였다 중간 엽 줄기 세포 주변 신경 손상된의 관리; 그들의 재생에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 근본적인 메커니즘 잘 이해 되지 않는다. 전통적으로, 우리는 생각 중간 엽 줄기 세포 지방, 근육, 연골, 뼈 조직의 창시자로 차별화만 하지만 특정 조건 하에서 그들은 보였다 myocytes17, 이다18으로 차별화 하는 , 및 myelinating 세포 주변19 와 중앙 신 경계19의. 생체 외에서 문화 중 neuropeptides에 노출 신경 마커21,22를 표현 하는 세포로 중간 엽 줄기 세포의 분화를 부탁 합니다. 몇몇 vivo에서 학문은 신경 재생 및 좌 골 신경 상해10,23의 쥐 모델에서 기능 복구에 중간 엽 줄기 세포의 유익한 효과 설명 했다. 이것은 아마 조직-특정 셀24로 줄기 세포의 분화에 기여 하는 유리한 환경 조건에 의해 발생 합니다. 미래 연구 또한 RLN 영향을 말에 미리 차별화 된 셀의 관리에 대 한이 기법을 조사 해야 합니다.
우리의 지식 최선을이 그것으로 특정 치료를 주입 하기 위해 주변 신경을 지역화 하는 신경 자극의 사용을 설명 하는 첫 번째 보고서 이다. Neuropathic 고통 등 다양 한 종에서 다른 주변 신경 병 리 신경25,26에 근접에서 줄기 세포의 관리에 의해 치료 될 수 있습니다. 미래 연구는 임상 환자에 있는이 기술의 효과 테스트 하 고 마이그레이션 위험과 주입 된 세포의 분화의 가능성을 조사 해야 합니다.

RLN 말 arytenoid 마비의 다양 한 각도 의해 특징에 상부 기도의 일반적인 병리학 이다. 후 두의 왼쪽은 가장 일반적으로 영향을 받습니다. 질병의 유행은 특정 말 인구에서 35%까지 도달할 수 있다. 여러 가설 병이이 질병의 병 인을 설명 하 려, 하지만 RLN의 정확한 원인은 불확실 하다. 병 리는 병 변과 demyelination 그러나 remyelination도 어느 정도의 회귀 후 두 신경의 원심 axonopathy로 설명 되어 있습니다. 이 axonopathy는 본질적인 후 두 근육과 부수적인 위축1,2의 denervation에 지도 한다. 이 병리학 천천히 진보적인 종종 이며 영향을 받는 측면3arytenoid 납치의 총 손실을 발생할 수 있습니다.
영향을 받는 말 운동 중 비정상적인 호흡 소리를 방출 하 고, 때때로, 더 심한 경우에 운동 옹 졸을 표시. 최종 진단 후 두 납치의 부분 또는 전체 손실1,2,4관찰 비 진정 서 말에 내 시경 검사에 의해 이루어집니다. 현재, 가장 일반적인 치료는 때때로 ventriculo cordectomy와 관련 된 진료 (일컬어 "타이-다시"), 이다. 비록 이러한 수술의 전반적인 성공률은 우수한5좋은 것으로 간주, 수술 후 합병증은 매우 일반적 이다. 가장 일반적인 합병증 납치의 점차적인 손실 이다. 바 넷 외. 6 말의 76% 이상에서 수술 후 첫 6 주 이내 납치의 적어도 1 개의 급료의 손실을 보고 했다. 족 실패, 기침, 고 기도 오염, 등의 다른 합병증은 또한 보고5.
비록 그들의 효율성에 대 한 연구는 여전히 부족 한 입증 된 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 10 년 이상에 대 한 말 의학 연구와 실천의 일부를 되었습니다. 말에 성인 중간 엽 줄기 세포의 2 개의 가장 일반적으로 착취 소스는 골 수 및 지방 조직7입니다. 모두 샘플링 기법 상대적으로 침략 하 고 세포의 충분 한 수에 항상 지도 하지 않는다. 최근, Ceusters 외. 7 보다 적게 침략 적 microbiopsy 기술에 의해 얻은 굴리는 근육 조직에서 파생 된 줄기 세포의 문화를 설명 합니다.
MSCs 자기 갱신, 자동 생성, multipotency, 및 차별화7,8할 수 있다. 지방, 뼈, 근육, 연골의 모든 mesoderm 혈통으로 차별 하는 그들의 능력은 지금 잘 설립된9. 그러나, 특정 한 환경 조건에서 그들은 신경, 이다, 그리고 말 초 신 경계 및 척수9,10myelinating 세포와 같은 비 엽 혈통으로 차별화할 수 있습니다. MSCs는 여러 신경 모델10,11에서 이미 사용 되어 왔습니다. 그들의 능력과 퇴 화 신경 조직의 영역으로 이동 하는 신경 세포를 다시 생성 조직 및 지역 관리11후 증명 되었습니다. 또한, MSCs에서 파생 된 Schwann 같은 셀 수 세포 파편을 제거 하 여 neurotrophic 요인 axonal 성장 및 remyelination9분 비 세포를 모집 하 고 있다.
이 연구의 목적은 건강 한 말에 왼쪽된 회귀 후 두 신경 근처 근육 파생 헌 줄기 세포의 신경 자극을 유도 주사의 기술을 설명 하는 것입니다. 일반적으로, 주사 바늘에 연결 된 신경 자극 기 그 지역12에 현지 마 취약을 적용 하려면 주변 신경의 전기 지역화에 사용 됩니다. 약한 직류 전류는 모터 응답을 유도 하기 위해 신경에 근접에서 제공 됩니다. 이 모터 응답을 생성 하는 기능 몇 가지 매개 변수, 바늘의 전도성 지역, 조직, 현재 적용, 펄스 기간 및 신경에 바늘에서 거리의 어떤 임피던스에 따라 다릅니다. 신경 자극 기 바늘은 바늘의 나머지 부분을 절연 하는 동안, 바늘의 끝에 매우 제한적인 전도성 영역 하도록 설계 되었습니다. 이 디자인은 신경을 정확 하 게 지역화에 도움이 됩니다. 현대 신경 자극 다양 한 조직의 임피던스에 적응 하 고 지속적인 암페어는 컴퓨터에 설정을 제공 합니다. 또한, 대부분의 기계 사용 0.1의 펄스 기간 s, 그렇게 력이 매개 변수는 현재 적용 되 고 바늘 거리. 바늘을 신경 거리와 모터 응답을 생성 하기 위해 현재 필요한 관계의 쿨롱 법칙에 의해 설명: E = kQ/r; 여기서 E 필요한 자극 충전, k는 쿨롱의 상수, Q는 최소한의 필요한 자극 충전 이며 r은 두 전극 사이의 거리. 신경의 전기-지역화에서 두 전극 사이의 거리는 바늘을 신경 거리12간주 됩니다. 전기 충전 바늘 신경 거리13의 역 광장의 규칙에 따라 없어져 요. 임상 연습 모터 0.5 mA는 매우 성공적인 신경 블록에 상관에서 자극 신경 및 낮은 전류에서 모터 신호 손실 사고 intraneuronal 주사 관리에서 사용자를 방지할 것 이다 나타났습니다. 이 연구의 목적은 제한 된 수의 말에 안전과이 기법의 타당성을 테스트 하는. 타당성과이 기술의 안전을 확인 하는 경우 영향을 받는 말을 쉽게 전송할 수 있습니다. 또한, 말 RLN 주변 퇴행 성 신경 통에 대 한 모델이 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>데토미딘(도미딘)&nbsp;</td><td>약국을 통해 판매</td>되는 <td>Dechra</td><td></td></tr><tr><td>리도카인 (Xylocaine)&nbsp;</td><td>약국을 통해 판매</td>되는 <td>Movianto</td><td></td></tr><tr><td>TOF Watch S (신경 자극기)</td><td>Alsevia</td><td>79950161</td><td></td></tr><tr><td>TSK Starcut (생검 바늘)</td><td>STSK 실험실</td><td>SAG - 14090C</td><td></td></tr><tr><td>전기자극 바늘&nbsp;</td><td>Pajunk</td><td>001185-79</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - F12 (배양 배지)</td><td>Lonza</td><td>LO BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>Life technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B (곰팡이)</td><td>Lonza</td><td>17-836E</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Lonza</td><td>LO BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>24-멀티웰 디쉬</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>LO BE10-508F</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17544502</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>T-25 cm&sup2; 플라스크</td><td>Nunclon</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>T-175 cm&sup2; 플라스크</td><td>Nunclon</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Cryostore CS5</td><td>Biolife 솔루션</td><td>205373</td><td></td></tr></tbody></table>

말 왼쪽된 회귀 후 두 신경 근처 헌 혈 줄기 세포의 신경 자극을 유도 주사

Nerve Stimulator-guided Injection of Autologous Stem Cells Near the Equine Left Recurrent Laryngeal Nerve

회귀 후 두 신경 (RLN)는 일반적으로 영향을 말 하 고 비정상적인 호흡 소리와 운동 옹 졸이 특징 이다. 회귀 후 두 신경 demyelination의 병 변을 보여줍니다. Demyelinated 신경 줄기 세포 적용의 장점은 다양 한 동물 모델에서 증명 되었습니다. 연구의 목표는 전기 신경 자극 기를 사용 하 여 건강 한 말에 타당성과 헌 근육 유래 중간 엽 줄기 세포의 왼쪽된 회귀 후 두 신경에 맞춰서 신경 주사의 안전 테스트를 했다.
근육에서 파생 된 줄기 세포 5 건강 Standardbred 말에서 삼 두 근 근육에서 반자동 14 G 생 검 바늘으로 근육 조직의 20 mg을 샘플링 하 여 얻을 수 있습니다. 후 두의 움직임은 모니터링 을 통해 위 기도 비디오 내 시경. 왼쪽된 회귀 후 두 신경 절연된 신경 차단 바늘 접근 이다. 신경 자극 적용, 2에서 시작 하는 엄마, 그리고 왼쪽된 arytenoid의 성공적인 납치 모니터링. 자극 강도 점진적으로 감소 하 고 있다. 모터 응답의 손실 0.5에서 관찰 되는 때 엄마, 107 헌 근육 파생 된 줄기 세포 주입. 시간 지점에 멀게 2 인의 시험관 치료 전에 주 1, 주 7, 그리고 세포의 주입 후 28 일에 말의 후 두 기능 점수. 6 말에 더 이상 바늘의 정확한 위치를 확인 하기 2 %lidocaine 1 mL 주입 됩니다. 이것은 왼쪽된 arytenoid 연골의 임시 마비.
이 연구는 회귀 후 두 신경 전기 신경 자극 기의 도움으로 접근 될 수 있다는 말에 의해 용납 신경의 전기 자극은 잘 증명을 한다. 후 두 기능의 수정 줄기 세포의 주입 후 말에서 관찰 되었다. 헌 근육 파생 된 중간 엽 줄기 세포의 말 RLN에서 고통에 맞춰서 신경 주사의 효과 설명 하기 위해 추가 연구를 실시 한다.

리 대학교의 동물의 윤리적 사용에 대 한 위원회 연구 프로토콜을 승인 했다. 몽-르-Soie 말 연구 센터에서 연구 말의 무리에서 6 말이이 연구에 포함 됐다. 첫 번째 말에서 회귀 후 두 신경 통해에 의해 지역화 되었습니다. 그림 2 에서는 후 두 신경 자극에 말의의 왼쪽된 dorsolateral 부분에 삽입 자극 바늘 사용 설정 합니다. 운동의 arytenoid 연골의 손실을 0.5에서 관찰 되는 때 mA, 2 %lidocaine 1 mL 주입. 이 높은 전류에서 이동의 부재와 왼쪽된 arytenoid의 일시적인 마비 귀착되는. 컨트롤 내 시경 검사, 24 시간 후, arytenoid 기능의 완전 한 회복을 계시 했다. 전체 프로토콜 성공적으로 5 말에 반복 되었다. 말의 근육 microbiopsy에 부정적인 반응을 보였다. 모든 말에 세포의 충분 한 수는 설정된 된 시간에서 성장 했다. 상부 기도 내 시경 로빈슨 외 에 따라 모든 5 마리와 나 II.1의 후 두 기능 점수에서 수행 되었다 14 결정 했다. 모든 말은 아주 잘 회귀 후 두 신경의 신경 자극을 용납. 아니 부작용 자극 또는 줄기 세포의 주입 후에 관찰 되었다.
모든 endoscopies 기록 하 고 두 눈을 멀게 임상 득점 했다. Wilcoxon 순위 분석15테스트 후 두 기능의 사전 주입 점수 및 줄기 세포 주입 후 1, 7, 28 일에 얻은 점수 사이 차이가 없었다. 표 1 요약 arytenoid 운동 자극 전류 및 줄기 세포의 주입에 바늘의 삽입에서 시간 뿐만 아니라 다른 시간 지점에서 모든 말의 후 두 점수 때 세포 주입 하는 곳.
현재 연구에 사용 된 세포에 따라 준비 했다 프로토콜 게시 이전7. 모든 분수에서 셀 고 수 있었다 trilineage 차별화를, CD90 및 CD44, CD45와 MHC II를 표현 하지 않았다 clonogenic 용량을 했다. 15-25% 분수의 세포 그들은 보여주 CD90 및 가장 큰 증식 능력의 최고의 표현 때문에 추가 처리를 위해 선택 되었습니다.
현재 연구의 목표는 하지 줄기 세포 응용 프로그램이 손상 된 말 초 신경 재생을 하지만 절차의 타당성을 테스트에에 있는 작은 회귀 후 두 신경에 줄기 세포 주입의 안전 평가의 효율성을 테스트 했다 l 건강 한 말의 수입니다. 5에서 내 시경 이미징에 기능 변경의 부재 말 주사 후 최대 28 일 및 4 5의 모든 임상 증상의 부재 목마 주사 타당성 및 절차의 안전 확인 후 최대 1 년. 한 말 연구에 비관련 이유를 위한 후속 기간에 안락사를 했다. 기술을 말의 작은 수에서 안전 증명, 비록 현재 연구에 포함 된 말의 수는 희귀 이벤트의 부재를 설명 하기 위해 너무 낮은.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>주입 하기 전에 점수</td>
			<td>주입 (분)을 시간</td>
			<td>전류 주입 (mA)에서</td>
			<td>하루 1 게시물 주사 점수</td>
			<td>하루 7 포스트 주입에 점수</td>
			<td>하루 28 포스트 주입에 점수</td>
		</tr>
<tr>
<td>말 1 (Standardbred, 마 레, 16 세)</td>
			<td>II.1</td>
			<td>12</td>
			<td>0.5</td>
			<td>난</td>
			<td>II.1</td>
			<td>II.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>말 2 (Standardbred, 마 레, 22 세)</td>
			<td>난</td>
			<td>3</td>
			<td>0.7</td>
			<td>난</td>
			<td>난</td>
			<td>난</td>
		</tr>
<tr>
<td>말 3 (Standardbred, 마 레, 11 세)</td>
			<td>II.1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.5</td>
			<td>II.2</td>
			<td>II.1</td>
			<td>II.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>말 4 (Standardbred, 마 레, 12 세)</td>
			<td>난</td>
			<td>7</td>
			<td>0.5</td>
			<td>난</td>
			<td>II.1</td>
			<td>난</td>
		</tr>
<tr>
<td>말 5 (Standardbred, 마 레, 10 세)</td>
			<td>난</td>
			<td>3</td>
			<td>0.7</td>
			<td>II.1</td>
			<td>난</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: Signalment laryngeal 기능 점수는 말. 이 표에서 주입, 낮은 전류 주입, 그리고 전과 5 건강 한 말의 후 두 점수 1, 7, 및 주입 후 28 일 헌 근육 유래 중간 엽 줄기 세포에의 하기 전에 모든 arytenoid 운동 자극의 시간 왼쪽된 후 두 재발 신경에 근접입니다. 말 #5 하루에 28 주입 후 이유로이 연구에 관련이 없는 컨트롤 사용할 수 있었습니다. 로빈슨 외. 에 의해 설명 된 점수를 점수 참조 14. 여기, 내가 두 arytenoid 연골의 움직임 했다 동기 및 대칭, 고 두 arytenoid 연골의 완전 한 납치를 얻을 수 있고 유지 점수. 점수 II.1 의미 arytenoid 연골의 움직임은 비동기 또는 특정 시간;에 비대칭 수 있습니다 그러나, 두 arytenoid 연골의 완전 한 납치 획득 하 고 유지 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58023/58023fig2.jpg"> 그림 2 : 줄기 세포의 주입 중 설정. 신경 자극 바늘은 후 두의 왼쪽에 소개 되 고 왼쪽된 회귀 후 두 신경으로 지시. 신경 자극 기 0.8에서 설정 된 mA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58023/58023fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리는 전기 신경 자극 기의 도움으로 회귀 후 두 신경에 근접에 있는 헌 근육 파생 된 줄기 세포를 주입 하는 프로토콜을 제시. 이 새로운 기술은 말 회귀 후 두 신경 병의 치료에 유용 될 수 있습니다.

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent ...

이 방법은 말초 신경병증의 줄기 세포 기지를 둔 처리에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다, 특히 말 재발성 후두 신경병증을 위해. 이 기술의 주요 장점은 줄기 세포 수확이 최소 침습적이며 주사 방법이 다른 말초 신경 병증으로 옮겨질 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 줄기 세포가 주입의 앞에 관심있는 그밖 세포로 분화될 수 있기 때문에, 그밖 세포 모형의 그밖 연구 결과로 확장합니다.이 방법의 시각적 데모는 후두 운동의 비디오 내시경 제어 및 신경 자극기 기술의 조작을 배우기 어려울 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 팔꿈치의 지점과 어깨의 점 사이의 중간선에 대한 육안 검사 및 심포션에 의해 삼두근 근육의 긴 머리에 샘플 사이트를 식별합니다. 전기 클리퍼를 사용하여 약 2센티미터 면적을 면도하고 폴리 요오드 액체 비누와 알코올 압축으로 구성된 수술 용 스크럽을 노출 된 피부에 1 분 동안 적용하십시오.25 게이지 바늘을 사용하여, 피하 2%리도카인 용액의 1밀리리터를 소독 부위의 중앙에 주입한다. 깨끗한 항균 핸드 비누로 소독하고 멸균 장갑을 착용한 후 일회용 멸균 드레이프에 반자동 14 게이지 생검 바늘을 놓고 스프링 메커니즘을 당겨 바늘을 무장시합니다. 칸누라와 외운을 잠긴 자세로 조립하여 트로카를 형성하고, 약 1.5센티미터의 둔감한 피부를 통해 수직으로 트로카르를 도입한다.그런 다음 트로카를 제거하고 외설을 멸균 커튼에 놓습니다. 캐뉼라를 통해 바늘을 소개합니다. 다음으로, 바늘의 끝이 삼두근 근육의 긴 머리 의 중간에 될 때까지, 근육에 피부 절개를 통해 바늘과 캐뉼라를 소개합니다.그런 다음 생검 바늘을 풀어 주면 바늘과 캐뉼라를 함께 근육에서 꺼내 캐뉼라에서 제거합니다. 다른 손으로 바늘을 들고 있는 동안 한 손으로 스프링을 당기고, 생검 바늘의 끝에서 표본이 보일 때까지 당깁니다. 조수의 도움으로, 샘플 매체를 포함하는 샘플 튜브를 열고, 샘플링 매체로 생검 바늘에서 작은 근육 조각을 전송하는 19 게이지 피하 바늘을 사용합니다.나사 캡으로 튜브를 닫고 튜브를 두 번 부드럽게 기울여 샘플이 매체에 떠 있는지 확인합니다. 그런 다음 생검 바늘을 다시 무장시키고 약 20 밀리그램의 근육 조직을 획득할 때까지 2~3개의 샘플을 더 수집하기 위해 피부 절개를 통해 캐뉼라를 다시 도입한다. 세포를 주입하려면, 실온에 세포 현탁액을 따뜻하게 한 후, 2 밀리리터 주사기로 세포의 1 밀리리터를 흡인하고 말이 전체 진정제를 나타내는 헤드 다운 위치에 있는지 확인합니다.다음으로, 왼쪽 후두 부위에 20센티미터 의 면적을 클립하고, 노출 된 부위에 폴리 요오드 비누와 알코올의 외과 스크럽을 적용합니다. 말의 왼쪽 암흑을 통해 나소공스를 향해 유연한 표준 비디오 내시경을 배치하고, 아티노이드 연골과 후두계의 전체 보기가 얻어지날 때까지 내시경의 위치를 조정한다. 자극 주사 바늘을 신경 자극기의 음극에 연결합니다.셀 서스펜션을 함유한 주사기를 주입 선에 연결하고 튜브를 미리 채우고 시스템에서 공기를 플러시합니다. 신경 자극기의 양극을 노출된 피부 부위에 달라붙는 전극 패치에 연결합니다. 튜브의 미리 채워진 부피와 동일한 멸균 식염수 용액의 부피로 주사기를 적재하고 후두의 등측측면을 향해 자극 주사 바늘을 도입하고, 한 Hertz 자극 모드에서 신경 자극기를 시작하여, 후두의 측측면에 접근하는 동안 2밀리암페어의 전류를 가진다.바늘을 재발성 후두 신경쪽으로 부드럽게 움직입니다. 왼쪽 아리티노이드 연골의 납치 운동이 보이자마자 바늘을 제자리에 유지하면서 움직임이 사라질 때까지 전류를 줄입니다. 0.5 밀리암페어에서 모터 반응의 손실이 관찰되면, 바늘 위치를 유지하고, 자가 줄기 세포의 1 밀리리터를 주입하고, 미리 준비된 식염수의 전체 부피가 뒤따릅니다.이 과정에서 바늘을 안정적으로 유지하며, 신경에 대한 거리가 모터 반응을 일으키고 바늘의 작은 움직임을 생성하는 전류에 의해 조절되기 때문에 반응의 급격한 손실을 생성할 수 있다. 그런 다음 바늘과 내시경을 제거하고 말이 모니터링을 통해 회복되도록 합니다. 이전 연구에서는, 어떤 불리 한 반응 샘플링 도중 또는 후에 관찰 되지 않은, 어떤 염증 동안 또는 줄기 세포의 주입 후 관찰 되지 않았습니다.또한, 후두 기능의 전사 점수와 줄기세포 주입 후 1일, 7, 28일에 얻어진 점수 사이의 차이가 없다. 이 절차를 시도하는 동안 줄기 세포 수집 절차는 비침습적이며 짧은 시간에 엄청난 수의 자가 중간 엽 줄기 세포의 배양을 허용한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 사전 분화 된 세포의 주입 과 같은 다른 방법은 슈완 세포가 신경의 결정에 기여할 가능성이 더 높은지에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.개발 후, 이 기술은 재생 의학의 연구원들이 말 재발성 후두 신경 병증에서 줄기 세포 사용을 탐구하는 길을 열었습니다.

nerve-stimulator-guided-injection-autologous-stem-cells-near-equine

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

신경 전구체 이식은 보호 및 / 또는 척수 상해 (SCI)과 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS)에 분실 / 역기능 자궁 phrenic 모터 뉴런을 교체 유망 전략이다. 우리는 ALS와 SCI의 쥐 모델에서 자궁 경부 척수 복부 혼까지 셀 전송을위한 프로토콜을 제공합니다.

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식

이 비디오에서는 돼지 모델에서 갑상선 수술 중 신경을 모니터링하기 위해 미주신경에 자동 주기적 자극 전극을 설치하는 절차를 보여줍니다. 이는 수술 중 표적 신경을 올바르게 식별하는 데 도움이 됩니다.

Automated Periodic Stimulation Electrode Installation: 돼지 모델의 미주신경에 자동 자극 장치를 외과적으로 이식하는 기술

출처: Andreatta, RD et. al., 삼투압 펌프 또는 직접 근육 주사를 사용한 피하 뉴로트로핀 4 주입은 노화된 쥐 후두 근육을 향상시킵니다. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 노화 관련 신경차단 및 신경근 접합부 감소에 의해 영향을 받는 후두 근육 기능을 회복하기 위해 노령 쥐 모델에 뉴로트로핀 4(NTF4) 주입을 보여줍니다. NTF4는 신경 재생을 유발하고 신경근 접합부 형성을 촉진하여 후두 기능 장애에 대한 치료 가능성을 강조합니다.

노령 쥐의 후두 신경 재생을 위한 뉴로트로핀 4 주입

후각 ensheathing 세포 (OECs)는 기본 후각 신경 세포의 성장을 허용 신경 능선 세포입니다. 이 특정 속성은 세포 이식에 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에서 후두 신경 손상 모델에서 OECs의 사용을 기반 셀룰러 이식 모델을 제시한다.

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

여기에서 우리는 쥐 노화 후두 근육을 재구성하기 위해 전신적으로 그리고 직접적으로 뉴로 트로 핀 4 (NTF4)의 사용을 기술하는 프로토콜을 제시합니다.

삼투압 펌프 또는 직접적인 근육 주사를 이용한 피하 뉴로트로핀 4 주입으로 노화 후두 근육 강화

이 연구 돼지 모델에서 갑 상선 수술의 내부 작용 신경 모니터링의 표준 프로토콜을 개발 하는 것을 목표로. 여기, 우리는 일반 마 취, 전극의 다른 종류를 비교 하 고 정상적이 고 부상 재발 후 두 신경의 electrophysiological 특성 조사를 설명 하는 프로토콜을 제시.

돼지 모델에서 갑 상선 수술의 내부 작용 신경 모니터링

우리는 신경 수리 인공적인 신경 도관을 사용 하 여 자 궁 경부 교감 신경 절 차단의 효과 평가 합니다. 남성 비글 개 했다 각 이식 한 인공 신경 왼쪽 열 등 한 치조 신경; 10 m m 간격에 걸쳐 왼쪽된 자 궁 경부 교감 신경 절의 주입에 의해 차단 되었다 측면 thoracotomy 통해 99.5% 에탄올.

에탄올을 이용한 자 궁 경부 교감 신경 절 블록 응용 프로그램 사용 하 여 인공 신경 개 열 등 한 치조 신경 재생 촉진을 위한

여기서 제시된 것은 유발되고 자발적인 근전도 전위내의 생체 내 연대순 기록을 위한 이식형 시스템의 제조를 위한 프로토콜이다. 이 시스템은 신경 손상 다음 후두 근육의 회안의 조사에 적용됩니다.

만성 생체 내 근전도를 위한 이식형 시스템

여기에서는 두개골 거근 장뇨근(LAL)의 생체 내 전기천공법(in vivo electroporation)과 탈질법(denervation)을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차를 통해 신경근 시냅스의 재생에서 근육 유래 단백질의 잠재적 역할을 연구할 수 있습니다.

In Vivo Electroporation과 Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle의 단기 신경 재생이 결합되었습니다.

우리는 쥐에서 직접 미주신경 주사를 위한 프로토콜을 제시하여 주사 후 합병증 없이 신경으로 직접 약물을 전달할 수 있도록 합니다. 이 방법은 자율신경계 조작과 관련된 전임상 신경학적 연구에 적용됩니다. 필요한 수정을 통해 쥐 및 다른 종의 다른 신경에 대한 직접 신경 주입에 사용할 수 있습니다.

쥐를 위한 직접 미주신경 주사 프로토콜

이 기사에서는 29G x 88mm 바늘을 사용하여 심근경색의 쥐 모델에서 심초음파 유도 심근내 주사를 위한 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 기술은 경색 주위 부위에 직접 치료제를 강력하고 정확하며 재현 가능한 전달을 보장합니다.

심근경색의 쥐 모델에서 표적적이고 신뢰할 수 있는 심근내 줄기세포 전달을 위한 심초음파 유도 주사

학습하세요 말의 왼쪽 후두회신경 근처에 자가 근육 유래 줄기세포를 주사하는 최소침습 기법을. 전기 신경 자극기를 활용한 이 방법은 말의 후두신경병증 치료에 유망한 재생의학 접근법을 제공합니다.

말 왼쪽된 회귀 후 두 신경 근처 헌 혈 줄기 세포의 신경 자극을 유도 주사

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