Name: 높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 3일령 제브라피시 유충의 꼬리 지느러미 절제를 통한 고효율 유전형 분석 방법입니다. 이 기술은 유전성 질환 모델 연구에 필수적인 조기 유전형 식별을 가능하게 하며 생물의학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 드문 질병 모델과 메커니즘 (RDMM) 네트워크 (캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 및 게놈 캐나다에 의해 자금)을 감사 하 고 싶습니다. CK은 UROP 장학금 수상 (오타와의 대학)에 의해 지원 됩니다. DLJ는 Vanier 캐나다 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. IAP는 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 박사 후 펠로 십 수상에 의해 지원 됩니다. 저자는 유전학의 미국 협회 권한을 부여에 대 한이 프로토콜을 게시 하 고 페 냐에서 보충 그림 5의 적응을 사용 하 여 감사 외.

절차와 관련 된 동물 주제 승인 되며 동물 보호 지침에 따라 제공 캐나다 위원회에 의해 동물 관리 및 오타와의 대학에 동물 보호 위원회.
1입니다. 준비
<ol><li>그것의 내부 표면에 걸쳐 9 cm 배양 접시 뚜껑 압력솥 테이프로 녹화 하 여 해 부 표면 준비. 스테레오 현미경 위치.</li>
	<li>3-5 일 후 수정 (dpf)를 배치 zebrafish 애벌레는 페 트리에서 접시와 ˜1.5 m m Tricaine 1 x E3 배아 미디어 (5 m m NaCl, 0.17 m m KCl, 0.33 m m CaCl2, 0.33 m m MgSO4, pH 7.2)에서 anesthetize.</li>
	<li>최소한의 스트레스와 3 dpf 애벌레에 맞게 2 mm의 직경에 한 쌍의가 위 또는 면도날과 P1000 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li>
</ol>2. 지 느 러 미 클리핑 Zebrafish 애벌레의
<ol><li>수정된 P1000 micropipette를 사용 하 여 마 취 유 충을 선택 하 고 위치 고압 테이프에 zebrafish 애벌레 Petri 접시 뚜껑에 배치.</li>
	<li>애벌레는 micropipette를 사용 하 여 주변 초과 Tricaine 솔루션을 제거 합니다. 지역으로 하 여 성공적으로 섹션은 지 느 러 미를 선택 하지만 생존을 위해 아직도 젖은 건조 해야 한다.</li>
	<li>마이크로 메스, 섹션 윌 킨 슨 외16에 설명 된 대로 그림 1에 표시 된 대로 스테레오 현미경 아래 꼬리 지 느 러 미를 사용 하 여. 절 개를 하는 동안 사이트 내에서 안료 격차는 꼬리 지 느 러 미, 말 초 혈액 순환 (그림 1A)의 한계에의 꾸준한 하향 압력을 적용. notochord 손상 되지 않도록 부드러운 압력을 적용 합니다.</li>
	<li>현미경 sectioned 지 느 러 미를 시각화 하 고 microscalpel 블레이드 (그림 2A)의 팁 위에 조각 위치. 필터 종이의 작은 조각의 표면에 지 느 러 미를 포함 하는 microscalpel를 놓습니다. 참고: transected 조직에서 melanocytes의 존재로 인해이 단계 작은 블랙 스팟 (그림 2B)로 지 느 러 미의 시각화 수 있습니다.</li>
	<li>50mm 잘 (그림 2D) 당 NaOH 솔루션의 25 μ를 포함 하는 96-잘 PCR 플레이트에 지 느 러 미를 포함 하는 필터 종이 위와 핀셋 (그림 2C), 전송 사용 하.</li>
	<li>PCR 접시의 라벨에 따라 잘 번호 플랫-아래 96 잘 접시를 준비 합니다. 신선한 1 x E3 배아 미디어의 200 µ L로 가득 수정된 P1000 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 zebrafish 애벌레 부드러운 압력을 사용 하 여 수집 합니다. 같은 PCR 플레이트 (그림 2E)으로 잘 번호 96-잘 조직 문화 접시에 있는 애벌레를 분배.</li>
	<li>필터 종이 (그림 2F) 솔루션에 빠져들 잘는 다는 것을 확인 하십시오. Microscapel 70 %EtOH 솔루션으로 그것을 찍기 하 여 교차 오염을 방지 하기 위해 각 컷 사이 핀셋의 블레이드를 청소. 깨끗 한 종이 티슈/지우기와 블레이드를 닦아.</li>
	<li>2.1-2.7 단계를 반복 하 여 모든 배아 잘립니다 되었습니다.</li>
	<li>genotypes 발견 되었습니다 때까지 28 ° C에 96 잘 접시에 애벌레를 저장 합니다. 참고: 배아 미디어 프로토콜은 2 일 이내에 쉽게 완료 될 수 있다 때문에 바뀔 필요가 없습니다. 더 많은 시간이 필요한 경우 미디어 변경 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 게놈 DNA 추출
<ol><li>96-잘 PCR 접시와 원심 분리기 1000 x g 되도록 모든 필터 종이 1 분에 샘플 NaOH 솔루션 내에서 잠긴 인감.</li>
	<li>조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 냉각 5 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열.</li>
	<li>500 mM Tris HCl, pH 8.0 각 샘플의 6 μ를 추가 합니다. 와 동입니다.</li>
	<li>짧게 원심 1500 x g, 실 온에서 5 분에 접시.</li>
	<li>PCR 반응 당 DNA 상쾌한의 1.5 μ를 사용 합니다.</li>
	<li>표 1-2와 같이 유전자를 PCR는 애벌레를 준비 합니다. 참고:이 프로토콜은 두 응용 프로그램에 대 한 테스트 되었습니다: 다중 PCR 반응 agarose 젤9, heteroduplex 녹는 genotypes polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)17을 사용 하 여 공개 하는 분석 결과 (HMA)을 사용 하 여 유전자 형을 공개.</li>
</ol>4. 대체 게놈 추출 Chelating 수 지를 사용 하 여
<ol><li>96-잘 PCR 접시에 잘린된 지 느 러 미와 지를 추가 하 여 완료 단계 2.5 킬레이트 화 수 지 (스 티 렌-divinylbenzene 공중 합체 짝된 iminodiacetate 이온을 포함) 5%의 30 μ를 포함. 참고: 수 지의이 종류 주로 조직 세포와 신속 하 고 효율적인 방식으로18에서 PCR 준비 DNA의 준비에 대 한 사용 됩니다.</li>
	<li>단계 2.6-2.8로 표시 합니다.</li>
	<li>96-잘 PCR 접시를 봉인 하 고 모든 필터 종이 chelating 수 지 내에서 잠긴 ㄴ 다는 것을 확인 하는 예제를 간단히 원심.</li>
	<li>조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 15 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열. 참고:이 단계 동안 수 있습니다 세포와 세포질 분 대를 북극 수 지 구슬의 후속 바인딩 DNA와 RNA 해결책에 남아 있다.</li>
	<li>짧게 원심 작은 수 지 구슬 고 현 탁 액에서 DNA를 샘플.</li>
	<li>3.5-3.6 유전형 절차를 완료 하려면 단계를 따릅니다.</li>
</ol>5. 응용 프로그램 1: 다중 PCR Agarose 젤 분석 뒤
<ol><li>표 1, 다음 설정 다중 PCR 반응 homozygous 돌연변이, heterozygotes, WT 애벌레 사이 차별 활성화. 96-잘 열 cycler를 사용 하 여 표 3에 설명 된 사이클링 조건을 사용 하 여 PCR 반응을 수행. 참고: PCR 반응 또한 어떤 다른 기존의 PCR 열 cycler에서 수행할 수 있습니다. 이 예제에서는 페 냐, 그 외 여러분 에 의해 사용 되는 PCR 전략을 설명 합니다. aldh7a1 WT 및 같은 다중 반응에서 5 bp 삽입 돌연변이 체 대립 유전자를 확인 9 .</li>
	<li>1 물 나트륨 붕 산 염 버퍼에 1 %agarose 젤 준비 x GelRed. 참고: 나트륨 붕 산 염 버퍼 재고 x 20이 이루어집니다 10 M NaOH, ddH2O, 1800 mL 40 mL의 pH 8.5 붕의 76 g를 조정 하 고 다음 2 L 최종 볼륨 ddH2o.를 사용 하 여 완료</li>
	<li>1 x 나트륨 붕 산 염 버퍼 250 V에서 15 분 동안에 젤을 실행 합니다. 과정을 촉진 하기 위하여 가능 하다 면, 젤 시스템 샘플 로드 시간을 줄임으로써 더 높은 처리량 기능을 사용 하려면 멀티 채널 pipets와 호환 되는 사용 합니다.</li>
	<li>이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 자외선 (UV)에서 젤.</li>
</ol>6. 응용 프로그램 2: Heteroduplex 분석 결과 용 해
<ol><li>페이지 12% 젤 1.5 m m 간격 장치 격판덮개 15-샘플 빗을 사용 하 여 준비 합니다. 12.21 mL ddH2O, 트리 스/Borate/EDTA (TBE), 30% 아크릴 아 미드 10 mL, 250 μ x 10의 2.52 mL의 10% 염화 persulfate (AP)를 사용 하 여 두 페이지 젤 준비 및 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 μ. 1 x TBE 버퍼를 사용 하 여 (0.089 0.089 M 붕 산 및 0.002 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) M Tris HCl) 버퍼를 실행.</li>
	<li>5 분 동안 94 ° C에서 PCR 제품을 열.</li>
	<li>차가운 얼음에 또는 4 ° c.에서 10 분 동안 thermocycler 튜브</li>
	<li>PCR 견본 당 10 μ 분자량 마커의 8 μ를 로드 합니다.</li>
	<li>150 V 1 x TBE를 사용 하 여 수직 전기 시스템 1 h 또는 분자량 표식까지 거의 도달 유리 접시의 피트 라인에서 페이지를 실행 합니다.</li>
	<li>이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 UV 빛에서 젤.</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li>
<li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li>
<li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+epilepsy+research%3A+legacies+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410(2013).</li>
<li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li>
<li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28888969">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li>
<li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li>
<li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy%2C+behavioral+abnormalities%2C+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+%28STXBP1%29+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li>
<li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li>
<li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420(2014).</li>
<li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li>
<li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

편집 도구는 정확 하 게 지난 돌연변이 제 브라에서 transgenes 소개 고용 되었다 유전자 년5,6,,78. 질병 zebrafish에 모델링을 수행할 때 초기 애벌레 또는 젊은 고기는 종종9,12,13,14을 관찰 하 게 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 설명 3 dpf 어린 애벌레의 유전형을 수 있도록 작은 zebrafish 애벌레 꼬리 생 검에서 PCR 준비 DNA 추출을 합니다. 특히 특별 게시물 유전형 하지 않을 때 가능한<sup class="xr...

제 브라 (Danio rerio) 척추 생물 치료 가설1,2,3의 전 임상 시험에 관해서는 뿐만 아니라 질병 조사에 대 한 모델으로 널리 이용 되는. 이 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아4DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 소설 유전자 변형, 유전자 기술 등 아연 손가락 nucleases (ZFN)5, 탈 같은 이펙터 Nucleases (TALENs)6,7는 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 편집의 증가 개발을 통해 (CRISPR)을 반복 하는 구조/CRISPR 관련 9 (Cas9) 시스템8, zebrafish는 실질적으로 여러 pathologic 조건의 이해를 향상 시킬 태세 이다. 이러한 기술을 모두 체세포 타겟된 녹아웃을 만드는 데는 그리고 zebrafish, 효율적으로 사악한 유전자에 생식 세포 동물8수정. 최근 문학에서 등이 간 질 및 대사 질환의 유전자 모델의 성공적인 개발 zebrafish3,,910,11,12 .
진전 zebrafish 게놈 편집, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 유전형 명백한 속도-제한 단계 되고있다. 특정 DNA 변이 예측된 게놈 편집 대상 사이트에 인접 한의 식별 프로토콜의 필수 단계입니다. 전통적으로, 지 느 러 미 클리핑에 의해 유전형 기법만 수행된에 청소년 이나 성인 zebrafish는 일반적으로. 그러나, 성인 기에 올리는 zebrafish 보낸 시간 (> 2 개월) 상당히 지연 연구에 있는 전진. 대부분의 경우, 성인 필수 유전자 (예를 들어, 질병 모델링에서) 또는 해로운 phenotypic 효과로 이어지는 이득의 기능 돌연변이의 녹아웃으로 얻을 수 없다. 또한, 여러 분석 실험 등 RNA 또는 대사 산물 추출, 애벌레의 풀링 요구 하 고 따라서 유일한 특별 게시물 유전형 기술을 사용할 수 있는 경우에 도전적 일 수 있다 genotypes의 사전 식별을 포함. 상기 예제 애벌레 유전형 기법을 정확 하 게 동시에 하 고 전체 복구 및 애벌레의 정상적인 발전의 중요성을 강조 표시 합니다. 초기 단계 zebrafish 유전형 표시 되지 않으면 현재 널리 이용 될; 이 애벌레 genotypes 유전형 실험12,,1314의 실행 전에 보다는 사후 유전형을 통해 식별 되는 질병 모델의 최근 간행물에 의해 반영 됩니다. 이 논문에서는, 애벌레 핀 클립 전략 이전 설립된 유전형 절차를 향상을 목표로 제공 됩니다.
과거에는, K 성분을 소화 유전자 형을 채용 하는 전략 라이브 zebrafish 애벌레 변수 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 효율15이어졌다. 더 최근 미세한 꼬리 생 검 기술은 더 유망한 결과16제공 게시, 비록 우리와 다른 그룹 하지 못했습니다 고효율와 저자에 의해 보고 된 DNA 복구를 재현. 윌 킨 슨 외 에 의해 설명 하는 프로토콜의 주요 좌절 16 PCR 튜브에 꼬리 조직의 전송 될 수 있습니다. 미세한 크기로 인해 fin 수집 및 pipetting으로 적절 하 게 제대로 되었음을 보장 하기 어렵다. 이 배리어를 해결 하기 위해 우리는 유전형 거의 1009라이브 zebrafish 애벌레의 큰 숫자에 대 한 향상 된 프로토콜을 개발 했습니다. microscalpel을 사용 하 여, 지 느 러 미 꼬리의 끝은 제거 하 고 필터 종이 조각에 배치. 조직을 포함 하는 필터 종이 쉽게 시각화 하 고 올바르게 PCR 튜브에 배치 수 있습니다. 게놈 DNA 추출 다음 다음 유전자 형 표본에 관심 영역의 PCR 증폭, 수행 됩니다. 이 방법의 장점은 높은 PCR 효율, 낮은 거짓 긍정적인 평가 낮은 사망률을 포함합니다. 또한, 많은 수의 배아의 유전형이이 프로토콜을 사용 하 여 가능 하다. 여기에 설명 된 프로토콜 지 느 러 미-클리핑 수백이 접근 및 genotyped 물고기와 2 일 이내 꼬리 재생의 정확한 식별을 사용 하 여 2-3 h 이내 애벌레의 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>페트리 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>96-well Tissue-culture plate</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR 플레이트</td><td>피셔</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>피셔</td><td>S25548A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스&nbsp;</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>피셔</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>5 % Chelex 100 나트륨 형태</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>비오튬</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마 알드리치</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 시스템</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1704508</tr><tr><td>30 % 아크릴아미드/비스 용액, 37.5: 1</td><td>바이오-라드&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1610158 GoTaq 그린 마스터 믹스, 2X</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>종이 와이프 (Kimwipes&reg; 일회용 와이퍼)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>1kb-plus 몰레실라 중량 마커&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유수&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 시스템 (고-스루풋 아가로스 젤 시스템)</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1704508</tr><tr><td>수직 젤 전기영동 시스템 Mini-PROTEAN Tetra Cell&nbsp;</td><td>바이오 라드&nbsp;</td><td></td><td></td>1658004</tr></tbody></table>

높은 처리량 dna 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf zebrafish 애벌레의 유전형

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) orthologues를 인간의 질병과 관련 된 것으로 알려진 유전자의 84%를 소유한 다. 또한, 이러한 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아에서 DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 최근 발전 도구를 편집 하는 유전자 돌연변이 제 브라에서 transgenes의 정확한 소개를 활성화는 합니다. 종종 zebrafish에 모델링 질병 해석 genotypes 알려지지 않은 경우에 도전적 일 수 있다 이른 죽음과 애벌레 고기 이끌어 낸다. 이 초기 신분의 genotypes 샘플 풀링 요구 하는 실험에 필요한, 진 식 또는 질량 분석 연구 등 이기도 합니다. 그러나, 광범위 한 genotypic 심사 사후 애벌레 또는 성인 zebrafish에만 수행 됩니다 대부분의 실험실에는 전통적인 방법에 의해 제한 됩니다. 우리는 72 h 후 수정 (hpf)로 빨리 달성 될 수 있는 라이브 zebrafish 애벌레에서 PCR 준비 genomic DNA의 분리 하는 방법에 적응 하 여이 문제를 해결. 이 시간 및 비용 효율적인 기술, 이전 게시 된 유전형 프로토콜에서 향상 된 미세한 핀 biopsies에서 genotypes 식별 수 있습니다. 지 느 러 미는 애벌레 개발에 신속 하 게 다시 생성 합니다. 연구원은 선택 하 고이 높은 처리량 PCR 기반 유전형 절차를 이용 하 여 성인 기에 원하는 genotypes을 올릴 수 있습니다.

protocoll의 효율성 유전형에 의해 입증 되었다 heterozygous 십자가의 자손 (aldh7a1+ ot100, aldh7a1+로 여기 표시) (그림 3A-C)9. Aldh7a1ot100돌연변이 체 대립 유전자에 frameshift와 손실의 기능 때문에 이른 정지 codon9zebrafish aldh7a1 유전자의 첫 번째 코딩 exon 5 기본적인 쌍 (bp) 삽입 합니다. 4 개의 뇌관 WT와 homozygous 돌연변이 (aldh7a1-/-) genotypes heterozygous (aldh7a...

Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

이 방법은 생물 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 제브라피시를 사용하여 질병의 유전 모델을 생성하는 것과 같습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 고처리량 방법을 사용하여 유전자형을 조기에 식별할 수 있다는 것입니다.이 방법은 유전적 간질에 대한 제브라피시 모델을 사용하여 광범위한 연구를 가능하게 할 수 있지만 다른 유전 질환 모델 및 모든 유형의 돌연변이 연구에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개체는 유충 지느러미의 절개가 꼬리의 색소 갭 내에서 정확하게 수행되어야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 제브라피시 유충의 지느러미 깎기를 시작하기 전에 해부 표면을 준비하십시오.9cm 페트리 접시 뚜껑의 내부 표면에 오토클레이브 테이프를 테이프로 붙이고 뚜껑을 실체 현미경 아래에 놓습니다. 피펫 팁의 끝을 2mm 직경으로 잘라 최소한의 응력으로 3dpf 유충을 수용할 수 있는 P1000 피펫 팁을 준비합니다. 수정 3-5일 후, 즉 dpf, 제브라피시 유충을 페트리 접시에 넣고 1x E3 배아 배지에 1.5밀리몰 트리카인을 마취합니다.변형된 P1000 마이크로 피펫을 사용하여 제브라피시 유충을 집어 마취하고 페트리 접시 뚜껑에 있는 배치된 오토클레이브 테이프에 놓습니다. 유충을 둘러싼 과도한 트리카인 용액을 제거하십시오. 이 지역은 지느러미를 성공적으로 절단하고 집어올릴 수 있도록 가능한 한 건조해야 하지만 생존을 보장하기 위해 여전히 젖어 있어야 합니다.지느러미 깎기 동안 출혈을 방지하고 유충의 생존을 보장하려면 색소 갭 내에서 절단이 발생해야 합니다. 이 이미지에서 표시된 것처럼 혈액 순환의 한계까지 원위부. 실체 현미경으로 작업하면서 마이크로 메스를 사용하여 꼬리 지느러미를 절단합니다.절개 부위에서는 노토코드가 손상되지 않도록 꾸준하지만 부드러운 아래쪽 압력을 가합니다. 현미경으로 절편화된 지느러미를 시각화하고 마이크로 메스 블레이드 끝 위에 조각을 놓습니다. 지느러미가 들어 있는 마이크로 메스를 작은 여과지 조각의 표면에 놓습니다.transection된 조직에 멜라닌 세포가 존재하기 때문에 지느러미는 작은 검은 점으로 나타납니다. 성공적인 DNA 추출을 위해서는 프로토콜을 계속하기 전에 여과지에서 지느러미의 위치를 표시하는 검은색 점을 관찰하는 것이 중요합니다. 가위와 핀셋을 사용하여 핀이 포함된 여과지를 25마이크로리터의 50밀리몰 수산화나트륨 용액이 들어 있는 96웰 PCR 플레이트의 웰로 옮깁니다.다음으로, 평평한 바닥의 96웰 조직 배양 플레이트를 준비하고 PCR 플레이트의 라벨에 따라 웰에 번호를 매깁니다. 200마이크로리터의 새로운 e3 배아 배지로 채워진 변형된 P1000 피펫을 사용하여 부드러운 압력으로 제브라피시 유충을 조심스럽게 수집합니다. PCR 플레이트와 동일한 웰 번호의 96웰 플레이트에 유충을 분배합니다.핀이 포함된 여과지가 용액에 잘 잠겨 있는지 확인하십시오. 각 절단 사이의 교차 오염을 방지하려면 70% 에탄올 용액에 담궈 마이크로 메스와 핀셋의 날을 청소하십시오. 깨끗한 종이 티슈나 물티슈로 칼날을 닦습니다.모든 유충이 잘렸으면 유전자형이 확인될 때까지 섭씨 28도의 96웰 플레이트에 유충을 보관합니다. 핀 조각이 포함된 96웰 PCR 플레이트를 밀봉하고 1분 동안 1000배 G로 샘플을 원심분리하여 이 절차를 시작합니다. 모든 여과지가 수산화나트륨 용액에 잠겨 있는지 확인합니다.조직 용해의 경우 열 순환기에서 섭씨 95도의 샘플로 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 10분 동안 섭씨 4도로 냉각합니다. 다음으로, 각 샘플에 6마이크로리터의 500밀리몰 트리스-HCL pH8.0을 추가합니다.샘플을 소용돌이치십시오. 실온에서 5분 동안 1500배 G로 플레이트를 간단히 원심분리합니다. 이 방법을 사용하여 게놈 DNA를 추출하려면 앞에서 설명한 대로 핀을 자르되 잘린 핀이 있는 여과지를 30마이크로리터의 5% 킬레이트 수지가 들어 있는 96웰 PCR 플레이트의 웰에 추가합니다.모든 핀 조각을 잘라낸 후 96웰 PCR 플레이트를 밀봉하고 샘플을 잠시 원심분리하여 모든 여과지가 킬레이트 수지에 잠겨 있는지 확인합니다. 열 순환기에서 샘플을 섭씨 95도에서 15분 동안 가열한 다음 섭씨 4도까지 10분 동안 냉각합니다. 샘플을 간단히 원심분리하여 수지 비드를 펠릿화하고 현탁액에서 DNA를 얻습니다.multiplex PCR assay는 동형접합 돌연변이, 이형접합체 및 야생형 유충을 구별할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 PCR 반응을 설정합니다. 96-well thermal cycler에서 PCR 반응을 수행합니다.붕산나트륨 완충액에 1% 아가로스 젤을 준비하고, 1x 젤 레드로 염색합니다. 프로세스를 용이하게 하기 위해 가능한 경우 멀티 채널 파이펫과 호환되는 겔 시스템을 사용하여 샘플 로딩 시간을 줄여 더 높은 처리량 기능을 가능하게 하십시오. 1x 붕산나트륨 버퍼에 250볼트에서 15분 동안 젤을 실행합니다.서로 다른 유전자형을 구별할 수 있도록 자외선 아래에서 젤을 이미지화합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1.5mm 스페이서 플레이트와 15개의 샘플 빗을 사용하여 2개의 12% 폴리아크릴아미드 겔을 준비하여 이 분석을 시작합니다. 수직 전기영동 시스템과 1x TBE 버퍼를 러닝 버퍼로 사용합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR을 수행한 후 PCR 산물을 섭씨 94도에서 5분 동안 가열한 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 냉각합니다. PCR 샘플당 10마이크로리터, 8마이크로리터의 분자량 마커를 로드합니다. 150볼트에서 1시간 동안 또는 분자량 마커가 유리판의 풋 라인에 거의 도달할 때까지 젤을 실행합니다.서로 다른 유전자형을 구별할 수 있도록 자외선 아래에서 젤을 이미지화합니다. 이 프로토콜은 이형접합 교배(heterozygous cross)의 자손의 유전자형(genotype)에 사용되었으며, 돌연변이 회장은 aldh7a1 유전자의 첫 번째 코팅 엑손(eagent)에 5개의 염기쌍 삽입을 가지고 있습니다. 야생형 및 돌연변이 회장의 PCR 증폭으로 예상되는 결과는 434 BP 앰플리콘입니다.293 BP 띠는 돌연변이 회장의 증폭에서 발생하고, 195 BP 띠는 야생형 회장의 경우 얻어집니다. 1%아가로스 붕산나트륨 겔에 대한 PCR 반응을 분석한 결과, 2열과 6열에서 야생형 유전자형이, 3열, 4열, 5열에서 이형접합 유전자형이, 1열에서 동형접합 돌연변이 유전자형이 확인되었습니다. 헤테로듀플렉스 용융 분석법(heteroduplex melting assay)에 의해 유전형(genotype)된 다양한 돌연변이.plpbp 유전자의 plpbpot101 및 plpbpot102 돌연변이 회장은 각각 프레임 시프트 및 조기 정지 코돈을 허용합니다. 변성 및 어닐링 후, 이형접합 동물의 PCR 단편에는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 쉽게 분리하고 시각화할 수 있는 이형이중 및 호모듀플렉스 DNA가 포함되어 있습니다. 복합 이형접합 돌연변이 유전자형은 2, 4, 8열에서, 이형접합 유전자형은 3, 6, 7, 9, 10열에서, 야생형 유전자형은 5열에서 확인되었습니다.이 기술을 사용하여 96마리의 유충을 깎는 것은 제대로 수행되면 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 조직 추출을 위해 동일한 유전자형의 제브라피시 유충을 풀링하는 것과 같은 다른 방법을 수행하고 바이오마커 조사 및 질병 모델과 같은 추가 질문에 답하기 위해 주문할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 제브라피시의 질병 경로 생리학을 탐구하기 위한 대사성 간질 모델 분야의 연구를 위한 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 꼬리 지느러미의 미세 해부를 통해 3일 된 제브라피시 유충을 적절하게 유전자형을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 기사는 제브라피시 꼬리 클립에서 DNA를 추출하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 유전자형을 빠르고 효율적으로 분석하는 방법을 보여줍니다.

테일 클립에서 DNA 추출: 제브라피시 유전형 분석에 사용되는 방법

고해상도 용융 분석 (르마)와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형에 신속하고 효율적인 방법으로 보여줍니다.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

Zebrafish 최근 연구 개발 하는 동안 DNA 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 사용 되었다. 여기 상세한 프로필 복제 타이밍에 zebrafish 태아를 사용 하기 위한 프로토콜. 이 프로토콜 돌연변이, 개별 세포 유형, 질병 모델, 그리고 다른 종에서 복제 타이밍을 공부 하기 쉽게 적응 될 수 있다.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

여기, 우리 디자인 하 고 서식 파일, 높은 처리량 zebrafish 태아 96 잘 접시에 배열에 대 한 같은 서식 파일의 사용에 자세한 절차 뒤 개 zebrafish 태아 조작 프로토콜을 제시.

3 차원 (3D)-배열 하는 높은 처리량 Zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄

유전자 편집 기술은 연구원이 상대적으로 쉽게 유전자 기능을 조사하기 위해 제브라피시 돌연변이를 생성할 수 있게 했습니다. 여기서, 우리는 제브라피시에서 의 회동 배아 하노티핑 및 정량화 신호를 수행하는 가이드를 제공한다. 이러한 편견없는 접근 방식은 situ 하이브리드화를 기반으로 한 현상별 분석에서 더 높은 정확도를 제공합니다.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

이 연구는 무료 소프트웨어(tpsDigs2, MorphoJ, PAST)를 사용하여 제브라피시 유생의 얼굴 구조 변화를 측정하기 위한 두개안면 연골 형태를 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.

형태 측정 분석: 제브라피시에서 두개안면 형태 정량화를 위한 분석 소프트웨어 툴박스

배우세요 3일령 제브라피시 유충의 꼬리 지느러미 절제를 통한 고효율 유전형 분석 방법입니다. 이 기술은 유전성 질환 모델 연구에 필수적인 조기 유전형 식별을 가능하게 하며 생물의학 연구에 활용됩니다.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

더 많은 동영상 탐색