높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

이 방법은 생물 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 제브라피시를 사용하여 질병의 유전 모델을 생성하는 것과 같습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 고처리량 방법을 사용하여 유전자형을 조기에 식별할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 유전적 간질에 대한 제브라피시 모델을 사용하여 광범위한 연구를 가능하게 할 수 있지만 다른 유전 질환 모델 및 모든 유형의 돌연변이 연구에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개체는 유충 지느러미의 절개가 꼬리의 색소 갭 내에서 정확하게 수행되어야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 제브라피시 유충의 지느러미 깎기를 시작하기 전에 해부 표면을 준비하십시오.

9cm 페트리 접시 뚜껑의 내부 표면에 오토클레이브 테이프를 테이프로 붙이고 뚜껑을 실체 현미경 아래에 놓습니다. 피펫 팁의 끝을 2mm 직경으로 잘라 최소한의 응력으로 3dpf 유충을 수용할 수 있는 P1000 피펫 팁을 준비합니다. 수정 3-5일 후, 즉 dpf, 제브라피시 유충을 페트리 접시에 넣고 1x E3 배아 배지에 1.5밀리몰 트리카인을 마취합니다.

변형된 P1000 마이크로 피펫을 사용하여 제브라피시 유충을 집어 마취하고 페트리 접시 뚜껑에 있는 배치된 오토클레이브 테이프에 놓습니다. 유충을 둘러싼 과도한 트리카인 용액을 제거하십시오. 이 지역은 지느러미를 성공적으로 절단하고 집어올릴 수 있도록 가능한 한 건조해야 하지만 생존을 보장하기 위해 여전히 젖어 있어야 합니다.

지느러미 깎기 동안 출혈을 방지하고 유충의 생존을 보장하려면 색소 갭 내에서 절단이 발생해야 합니다. 이 이미지에서 표시된 것처럼 혈액 순환의 한계까지 원위부. 실체 현미경으로 작업하면서 마이크로 메스를 사용하여 꼬리 지느러미를 절단합니다.

절개 부위에서는 노토코드가 손상되지 않도록 꾸준하지만 부드러운 아래쪽 압력을 가합니다. 현미경으로 절편화된 지느러미를 시각화하고 마이크로 메스 블레이드 끝 위에 조각을 놓습니다. 지느러미가 들어 있는 마이크로 메스를 작은 여과지 조각의 표면에 놓습니다.

transection된 조직에 멜라닌 세포가 존재하기 때문에 지느러미는 작은 검은 점으로 나타납니다. 성공적인 DNA 추출을 위해서는 프로토콜을 계속하기 전에 여과지에서 지느러미의 위치를 표시하는 검은색 점을 관찰하는 것이 중요합니다. 가위와 핀셋을 사용하여 핀이 포함된 여과지를 25마이크로리터의 50밀리몰 수산화나트륨 용액이 들어 있는 96웰 PCR 플레이트의 웰로 옮깁니다.

다음으로, 평평한 바닥의 96웰 조직 배양 플레이트를 준비하고 PCR 플레이트의 라벨에 따라 웰에 번호를 매깁니다. 200마이크로리터의 새로운 e3 배아 배지로 채워진 변형된 P1000 피펫을 사용하여 부드러운 압력으로 제브라피시 유충을 조심스럽게 수집합니다. PCR 플레이트와 동일한 웰 번호의 96웰 플레이트에 유충을 분배합니다.

핀이 포함된 여과지가 용액에 잘 잠겨 있는지 확인하십시오. 각 절단 사이의 교차 오염을 방지하려면 70% 에탄올 용액에 담궈 마이크로 메스와 핀셋의 날을 청소하십시오. 깨끗한 종이 티슈나 물티슈로 칼날을 닦습니다.

모든 유충이 잘렸으면 유전자형이 확인될 때까지 섭씨 28도의 96웰 플레이트에 유충을 보관합니다. 핀 조각이 포함된 96웰 PCR 플레이트를 밀봉하고 1분 동안 1000배 G로 샘플을 원심분리하여 이 절차를 시작합니다. 모든 여과지가 수산화나트륨 용액에 잠겨 있는지 확인합니다.

조직 용해의 경우 열 순환기에서 섭씨 95도의 샘플로 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 10분 동안 섭씨 4도로 냉각합니다. 다음으로, 각 샘플에 6마이크로리터의 500밀리몰 트리스-HCL pH8.0을 추가합니다.

샘플을 소용돌이치십시오. 실온에서 5분 동안 1500배 G로 플레이트를 간단히 원심분리합니다. 이 방법을 사용하여 게놈 DNA를 추출하려면 앞에서 설명한 대로 핀을 자르되 잘린 핀이 있는 여과지를 30마이크로리터의 5% 킬레이트 수지가 들어 있는 96웰 PCR 플레이트의 웰에 추가합니다.

모든 핀 조각을 잘라낸 후 96웰 PCR 플레이트를 밀봉하고 샘플을 잠시 원심분리하여 모든 여과지가 킬레이트 수지에 잠겨 있는지 확인합니다. 열 순환기에서 샘플을 섭씨 95도에서 15분 동안 가열한 다음 섭씨 4도까지 10분 동안 냉각합니다. 샘플을 간단히 원심분리하여 수지 비드를 펠릿화하고 현탁액에서 DNA를 얻습니다.

multiplex PCR assay는 동형접합 돌연변이, 이형접합체 및 야생형 유충을 구별할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 PCR 반응을 설정합니다. 96-well thermal cycler에서 PCR 반응을 수행합니다.

붕산나트륨 완충액에 1% 아가로스 젤을 준비하고, 1x 젤 레드로 염색합니다. 프로세스를 용이하게 하기 위해 가능한 경우 멀티 채널 파이펫과 호환되는 겔 시스템을 사용하여 샘플 로딩 시간을 줄여 더 높은 처리량 기능을 가능하게 하십시오. 1x 붕산나트륨 버퍼에 250볼트에서 15분 동안 젤을 실행합니다.

서로 다른 유전자형을 구별할 수 있도록 자외선 아래에서 젤을 이미지화합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1.5mm 스페이서 플레이트와 15개의 샘플 빗을 사용하여 2개의 12% 폴리아크릴아미드 겔을 준비하여 이 분석을 시작합니다. 수직 전기영동 시스템과 1x TBE 버퍼를 러닝 버퍼로 사용합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR을 수행한 후 PCR 산물을 섭씨 94도에서 5분 동안 가열한 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 냉각합니다. PCR 샘플당 10마이크로리터, 8마이크로리터의 분자량 마커를 로드합니다. 150볼트에서 1시간 동안 또는 분자량 마커가 유리판의 풋 라인에 거의 도달할 때까지 젤을 실행합니다.

서로 다른 유전자형을 구별할 수 있도록 자외선 아래에서 젤을 이미지화합니다. 이 프로토콜은 이형접합 교배(heterozygous cross)의 자손의 유전자형(genotype)에 사용되었으며, 돌연변이 회장은 aldh7a1 유전자의 첫 번째 코팅 엑손(eagent)에 5개의 염기쌍 삽입을 가지고 있습니다. 야생형 및 돌연변이 회장의 PCR 증폭으로 예상되는 결과는 434 BP 앰플리콘입니다.

293 BP 띠는 돌연변이 회장의 증폭에서 발생하고, 195 BP 띠는 야생형 회장의 경우 얻어집니다. 1%아가로스 붕산나트륨 겔에 대한 PCR 반응을 분석한 결과, 2열과 6열에서 야생형 유전자형이, 3열, 4열, 5열에서 이형접합 유전자형이, 1열에서 동형접합 돌연변이 유전자형이 확인되었습니다. 헤테로듀플렉스 용융 분석법(heteroduplex melting assay)에 의해 유전형(genotype)된 다양한 돌연변이.

plpbp 유전자의 plpbpot101 및 plpbpot102 돌연변이 회장은 각각 프레임 시프트 및 조기 정지 코돈을 허용합니다. 변성 및 어닐링 후, 이형접합 동물의 PCR 단편에는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 쉽게 분리하고 시각화할 수 있는 이형이중 및 호모듀플렉스 DNA가 포함되어 있습니다. 복합 이형접합 돌연변이 유전자형은 2, 4, 8열에서, 이형접합 유전자형은 3, 6, 7, 9, 10열에서, 야생형 유전자형은 5열에서 확인되었습니다.

이 기술을 사용하여 96마리의 유충을 깎는 것은 제대로 수행되면 한 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 조직 추출을 위해 동일한 유전자형의 제브라피시 유충을 풀링하는 것과 같은 다른 방법을 수행하고 바이오마커 조사 및 질병 모델과 같은 추가 질문에 답하기 위해 주문할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 제브라피시의 질병 경로 생리학을 탐구하기 위한 대사성 간질 모델 분야의 연구를 위한 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 꼬리 지느러미의 미세 해부를 통해 3일 된 제브라피시 유충을 적절하게 유전자형을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.