마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상
September 5th, 2018
여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.
이 방법은 신피질의 구조 및 기능 분석과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 뇌의 대규모 3차원 구조를 드러낼 수 있다는 것입니다. 이 방법은 신피질에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 척수와 같은 다른 신경계에도 적용할 수 있습니다.
성체 마우스의 폰즈에 추적자를 주입하려면 먼저 형광 표지된 콜레라 독소 서브유닛 B 1마이크로리터를 26게이지 Hamilton 주사기에 넣습니다. 주사기에 인젝터 펌프를 놓고 주사기와 펌프를 입체 기구의 매니퓰레이터의 도구 홀더에 놓습니다. 매니퓰레이터를 수직 축에서 뒤쪽으로 12도 기울입니다.
그런 다음 입체 기기에 마우스를 놓습니다. 면도날을 사용하여 털을 제거하여 감염을 예방한다. 그런 다음 브레그마와 람다가 보이도록 두피를 10mm 자릅니다.
피펫을 사용하여 0.1ml의 1% 리도카인을 투여합니다. 브레그마와 람다가 동일한 Z 레벨을 갖도록 입체 악기에서 마우스피스의 수직 위치를 조정하여 헤드의 각도를 설정합니다. 다음으로, 주사기의 끝이 브레그마에 가깝도록 매니퓰레이터를 입체 기구에 밀어 넣어 매니퓰레이터의 위치를 조정합니다.
매니퓰레이터의 위치를 기록합니다. 매니퓰레이터의 공구 홀더를 움직여 주사기를 집어넣습니다. 그런 다음 매니퓰레이터를 후방으로 5.4mm, 측면으로 0.4mm 이동합니다.
끝이 두개골의 진입점에 가까워지도록 주사기를 전진시킨 다음 주사기를 집어넣고 진입점을 표시합니다. 표시된 위치에서 약 1mm 직경의 구멍을 뚫습니다. 팁 깊이가 브레그마에서 측정된 깊이보다 6.9mm 더 크도록 구멍을 통해 주사기 팁을 삽입합니다.
그런 다음 펌프를 사용하여 분당 0.2마이크로리터의 트레이서를 주입합니다. 주사 후 뇌에서 주사기를 제거합니다. 필요한 경우, 노출된 뇌를 작은 미세섬유지혈제 조각과 순간 접착제로 덮습니다.
노출된 뇌를 식염수로 닦아 감염을 예방하고 두피를 봉합합니다. 그런 다음 입체 기기에서 마우스를 제거합니다. 마우스가 약 한 시간 동안 섭씨 30도의 인큐베이터에서 마취에서 회복될 때까지 기다립니다.
흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 마우스가 완전히 회복된 후 다른 동물과 함께 돌아가십시오. 뇌 조직을 채취하려면 가위를 사용하여 두개골을 노출시키도록 두피를 자른다.
그런 다음 가위를 사용하여 노출된 두개골의 정중선을 자릅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 두개골을 제거합니다. 브레그마와 람다의 위치를 표시해야 하는 경우 먼저 두개골의 한쪽 면을 제거합니다.
그런 다음 얇은 텅스텐 바늘을 브레그마와 람다 위치에서 뇌에 삽입한 다음 나머지 두개골을 제거합니다. 그런 다음 뇌 샘플을 비브라톰 플랫폼에 놓습니다. 실온에서 PBS로 최대 500마이크로미터 두께로 절단합니다.
이 절차에서는 슬라이스를 4ml의 Scale S0 용액이 들어 있는 5ml 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 부드럽게 흔들면서 12시간 동안 배양합니다. 12시간 후 피펫을 사용하여 튜브에서 용액을 제거하고 Scale A2 용액 4ml를 추가합니다.
슬라이스를 섭씨 37도에서 부드럽게 흔들어 36시간 동안 배양합니다. 36시간 후 튜브에서 용액을 제거하고 4ml의 Scale B4 용액을 추가합니다. 섭씨 37도에서 부드럽게 흔들면서 24시간 동안 배양합니다.
24시간 후 튜브에서 용액을 제거하고 Scale A2 용액 4ml를 추가합니다. 슬라이스를 섭씨 37도에서 부드럽게 흔들어 12시간 동안 배양합니다. 12시간 후 튜브에서 용액을 제거하고 PBS 4ml를 첨가합니다.
실온에서 부드럽게 흔들면서 6시간 동안 배양합니다. 그런 다음 2mm 플라스틱 튜브에 조각을 조심스럽게 제거합니다. 1ml의 AB Scale 용액에 1 차 항체를 넣고 섭씨 37도에서 48-72 시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
그런 다음 5ml 플라스틱 튜브에 조각을 조심스럽게 제거합니다. 4ml의 AB Scale 용액에 2시간 동안 배양하고 실온에서 2회 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 2ml 플라스틱 튜브에 조각을 조심스럽게 제거합니다.
AB Scale 용액 1ml에 형광 표지된 2차 항체를 넣고 섭씨 37도에서 48시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 4ml의 항체 Scale 용액이 들어 있는 5ml 플라스틱 튜브에 슬라이스를 조심스럽게 제거하고 실온에서 부드럽게 흔들면서 6시간 동안 배양합니다. 용액을 제거하고 AB Scale 용액 4ml를 넣고 실온에서 부드럽게 흔들어 2시간 동안 슬라이스를 배양합니다.
다음으로, 용액을 제거하고 4%PFA 4ml를 넣고 실온에서 부드럽게 흔들면서 슬라이스를 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 PBS 4ml를 넣고 실온에서 부드럽게 흔들면서 슬라이스를 1시간 동안 배양합니다. 용액을 제거하고 Scale S4 용액 4ml를 넣고 섭씨 37도에서 부드럽게 흔들면서 12시간 동안 슬라이스를 배양합니다.
그런 다음 스페이서를 유리 슬라이드에 놓고 슬라이스를 스페이서에 놓고 슬라이스를 Scale S4 용액에 담그십시오. 커버 유리로 스페이서를 밀봉합니다. 커버 유리에 물을 약간 붓고 침수 장거리 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 또는 이광자 현미경을 사용하여 슬라이스를 이미지
화합니다.본 연구에서는 Tlx3-cre AI9 형질전환 마우스에서 tdTomato 발현에 의해 피질 투영 뉴런을 녹색으로 표시하고, 자홍색의 대뇌하 투영 뉴런을 생후 7주에 역행 추적자 CTB488을 폰에 주입하여 시각화했습니다. 이것은 피질 영역의 대략적인 위치를 보여주는 평면도입니다. 다음은 대뇌하 돌기 뉴런을 보여주는 CTB488 형광과 피질 돌기 뉴런을 보여주는 tdTomato 형광의 비스듬한 모습이며, 이것이 병합된 이미지입니다.
두 세포 유형의 세포체는 광범위한 뇌 영역에서 볼 수 있었고 광학 섹션은 주기적인 마이크로 기둥을 보여주었습니다. 이 이미지는 Crym-eGFP 마우스의 광학 섹션에서 eGFP 발현 대뇌하 돌기 뉴런의 세포체와 정점 수상돌기를 보여주며, 이 이미지는 항체 Scale 방법으로 C57 Black 6 마우스의 폰즈에 CTB488을 주입하여 녹색으로 표지된 파브알부민 발현 세포와 자홍색으로 표지된 대뇌하 투영 뉴런을 보여줍니다. 이 절차에 따라 대뇌 조직의 정량적 특성화와 같은 추가 질문에 답하기 위해 3D 이미지 처리와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
개발 후, 이 기술은 피질 생물학 분야의 연구자들이 쥐 뇌의 새로운 모듈식 조직을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
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개요
이 연구는 마우스 뇌 조직의 티슈 클리어링, 형광 라벨링, 대규모 이미징을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법론을 통해 연구자들은 신피질의 세포 유형의 3차원 구조를 시각화할 수 있으며, 이는 신피질의 구조와 기능에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 신경과학
- 조직 이미징
- 형광 라벨링
배경
- 신피질의 구조와 기능은 신경과학에서 기본적인 것입니다.
- 세포 구조를 이해하는 것은 주요 연구 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 이 기술은 척수와 같은 다른 신경계 영역으로 확장될 수 있습니다.
연구 목적
- 뇌 구조의 강화된 시각화를 위한 방법론을 개발합니다.
- 신피질 내 세포 유형의 구조를 조사합니다.
- 더 넓은 신경계 연구에 적용 가능한 틀을 제공합니다.
사용된 방법
- 콘포컬 또는 2광자 현미경을 사용한 대규모 이미징.
- 성숙한 마우스와 교간 등 특정 뇌 영역이 포함된 모델을 사용합니다.
- 프로토콜은 추적자 주입 및 조직 준비를 위한 절차적 단계를 상세히 설명합니다.
- Scale S0, A2, B4와 같은 용액에서의 배양 및 형광 항체의 사용은 중요한 단계였습니다.
주요 결과
- 이 방법은 마우스 뇌 조직에서 대규모의 3차원 구조를 보여줍니다.
- 피질 투영 뉴런 및 기타 세포 유형의 특정 라벨링이 달성되었습니다.
결론
- 이 연구는 신경 구조를 시각화하기 위한 강력한 방법을 보여줍니다.
- 연구 결과는 신피질의 구조와 그 기능을 이해하는 데 중요한 기여를 합니다.
- 이 방법론은 신경과학 연구의 다양한 응용에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding the three-dimensional cellular architecture of complex tissues like the neocortex supports target validation by revealing spatially resolved organization of neuronal subtypes. This mechanistic insight enables de-risking of therapeutic hypotheses through direct visualization of target engagement and network-level organization in disease-relevant systems. The method provides predictive confidence in preclinical models by linking anatomical organization to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping cell-type-specific microcolumn organization in the neocortex.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of neuronal subtypes and their spatial relationships.
- Predictive Value: Enhances target confidence by resolving periodic functional modules relevant to network-level drug effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving three-dimensional tissue architecture.
- Operational Value: Enables reproducible imaging workflows through standardized tissue clearing and labeling protocols.
- Scalability: Facilitates platform reuse across brain regions and complex tissues via motorized stage scanning and long-working-distance objectives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage organization insights to preclinical validation through disease-relevant system modeling.
- Mechanistic De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by visualizing target engagement across distributed neural networks.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural phenotypes with functional outputs for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing spatially resolved, quantitative anatomical data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-type-specific organization in intact tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible tissue preparation and quantitative fluorescence readouts.
- Analytics: Enables comparative analysis via three-dimensional imaging and cell counting across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving disease-relevant tissue architecture for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable to multiple brain regions and complex tissues beyond the neocortex.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct visualization of neuronal organization and microcolumn periodicity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined tissue clearing, labeling, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking anatomical phenotypes to functional outcomes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, tissue preparation, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to confocal or two-photon microscopes with large working distance objectives and motorized stages.
- Necessitates cross-team standardization for tissue clearing, antibody labeling, and imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse model systems such as spinal cord or human tissue surrogates.
- Limited by tissue size and optical penetration depth, which may restrict imaging of whole-brain samples without sectioning.
