Name: 마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 조직의 조직 투명화 및 형광 라벨링을 통한 대형 3차원 영상 기법을 신경과학 연구에 활용하는 방법을. 이 기술은 신피질의 세포 조직과 구조를 시각화하여 뉴런 기능 분석에 기여합니다.

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우리 감사 미 야와 키 아츠 시와 히로시 하 마 원고, 편집에 대 한 찰스 요코야마 AbScale 실험에 그들의 조언을 에리코 Ohshima 및 그들의 기술 지원에 대 한 미유키 Kishino. 이 작품은 과학적 연구에서 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의 남에 대 한 남 및 연구비 RIKEN에서 연구 자금에 의해 지원 되었다 (혁신적인 지역 "생체 Neurocircuitry"; 22115004)와 S.S. (25890023)입니다.

모든 실험 절차 RIKEN와 코 동물 실험 위원회 RIKEN 유전자 재조합 실험 안전 위원회에 의해 승인 되었고 RIKEN 뇌 과학의 동물 시설 기관 지침에 따라 수행 연구소입니다.
1입니다. 이미징 챔버의 준비
<ol><li>
영상 실19
	<ol>
<li>실리콘 고무 시트를 사용 하 여 다양 한 두께의 약 5 m m와 바닥 플레이트의 두께 챔버를 준비 합니다. 또한, 접시와 유리 하단 (그림 1A) 없이 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스페이서를 슬라이스
	<ol>
<li>스페이서 두께 0.5 m m (그림 1C)의 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 샘플을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 추적 프로그램 삽입
참고: 폰 (2.1) 또는 우량한 colliculus (2.2)에 주사를 합니다. 우량한 colliculus에 주입 하는 동안 시각 및 모터 지역 등 다양 한 뇌 영역에 폰 레이블 하위 대뇌 프로젝션 뉴런에 주입 시각적 영역에 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 라벨. 붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B. 대신 식 염 수 주입 제어 실험에 대 한 멸 균 상태 유지에 대 한 소독된 장비 및 에탄올으로 청소 플라스틱 장갑을 사용 합니다.
<ol><li>
성인 쥐의 주사는 폰으로 확인 합니다.
	<ol>
<li>붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B의 1 µ L를 그리기 (25 µ g / µ L PBS에) 26 G 해밀턴 주사기로.</li>
		<li>주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.</li>
		<li>Stereotaxic 악기에 퓰 레이 터의 도구 홀더에 주사기와 펌프를 배치 합니다. 조작자 12 ° 수직 축에서 뒤로 기울입니다.</li>
		<li>Intraperitoneally 나트륨 pentobarbital을 주입 하 여 남성 또는 여성 성인 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9) anesthetize (60 밀리 그램/kg 체중) 또는 isoflurane (2-3%)을 투여 하 여. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>Stereotaxic 악기에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>감염 방지 및 bregma 및 람다 표시 되도록 두 피의 10 m m를 잘라 면도날을 사용 하 여 머리를 조심 스럽게 제거. 1 %lidocaine 피 펫을 사용 하 여 0.1 mL를 관리 합니다. 있도록 bregma 및 람다 동일한 z 레벨 stereotaxic 악기에 떠 벌이의 수직 위치를 조정 하 여 머리의 각도 설정 합니다.</li>
		<li>주사기의 팁은 bregma 가까이 stereotaxic 악기에 슬라이딩 하 여 조작자의 위치를 조정 하 고 조작자의 위치를 기록 합니다. 조작자에 도구 홀더를 이동 하 여 주사기를 철회.</li>
		<li>조작자 이동 5.4 m m 뒤로 및 0.4 m m 옆. 팁은 두개골에 진입점 가까이 있도록 주사기를 사전. 주사기를 철회 하 고 진입점을 표시 합니다.</li>
		<li>표시 된 위치에서 약 1 m m의 직경을 가진 구멍을 드릴 합니다.</li>
		<li>팁 깊이 6.9 m m 보다는 bregma에 측정 하는 구멍을 통해 주사기 끝을 삽입.</li>
		<li>추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 1 µ L을 주입.</li>
		<li>두뇌에서 주사기를 제거 합니다.</li>
		<li>필요한 경우 microfibrillar hemostat 및 인스턴트 접착제의 작은 파편으로 노출 된 뇌를 커버.</li>
		<li>감염을 방지 하 고 두 피를 봉합 하는 피 펫 제공 하는 염 분을 사용 하 여 노출 된 뇌를 씻어.</li>
		<li>Stereotaxic 악기에서 마우스를 제거 합니다. 일반적으로 1 시간에 30 ˚C에 인큐베이터에 마 취에서 회복 하기 위해 마우스를 허용 합니다. 두지 마십시오 마우스 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 완전히 복구 되었습니다 후에 다른 동물의 회사를 마우스를 반환 합니다.</li>
		<li>3-7 일에 대 한 마우스를 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
성인 쥐의 우량한 colliculus에 주사를 확인 합니다.
	<ol>
<li>팁 직경 30-50 µ m의 유리 피 펫을 준비 합니다.</li>
		<li>플라스틱 튜브 (그림 2A)를 통해 해밀턴 주사기를 유리 피 펫을 연결 합니다.</li>
		<li>파라핀 액체 유리 피 펫, 플라스틱 튜브, 그리고 해밀턴 주사기를 채우십시오.</li>
		<li>주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.</li>
		<li>조작자에 유리 피 펫을 놓고 조작 수직 축 (그림 2B)에서 뒤로 60 ° 기울기.</li>
		<li>2.1.4–2.1.9을 수행 합니다. 조작자의 위치는 1.4 m m 후부, 람다를 0.5 m m 옆.</li>
		<li>두개골에 작은 플라스틱 파라핀 영화 장소 다음 그것에 추적 솔루션의 약 1 µ L를 넣어. 신속 하 게 사전 유리 피 펫 및 추적 솔루션의 적어도 0.5 µ L로 그것을 채우십시오.</li>
		<li>팁 깊이 뇌 표면에서 3.0 m m 유리 피 펫을 삽입 합니다.</li>
		<li>추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 0.5 µ L을 주입.</li>
		<li>두뇌에서 유리 피 펫을 제거 합니다.</li>
		<li>2.1.13–2.1.16을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 고정 및 트리밍
<ol><li>Sodium pentobarbital (60 밀리 그램/kg 체중) 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9, 또는 2 단계에서 설명한 대로 추적 프로그램 주입 없이 intraperitoneally 주입. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>0.9% 식 염 수와 마우스 transcardially20 perfusing에 의해 마우스를 고통 없이 안락사.</li>
	<li>Perfusing 여 마우스20 수정 4 %paraformaldehyde (PFA) 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.5).</li>
	<li>
설명된20으로 두개골 폭로 위를 사용 하 여 두 피를 잘라.
	<ol>
<li>가 위를 사용 하 여 노출 된 두개골의 중간을 잘라. 집게를 사용 하 여 두개골을 제거 합니다.</li>
		<li>람다와 bregma의 위치를 표시 하는 것이 필요한 경우 먼저 두개골의 한 반구를 제거 합니다. 뇌에 남아 있는 두개골에 람다와 bregma의 위치에 두뇌에 얇은 텅스텐 바늘을 삽입 한 다음 나머지 해골을 제거. 참고: 뇌 수에 저장 PBS 4 ˚C에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 체 억제 뉴런의 얼룩을 수행 하려면 두뇌 샘플 조각으로 잘라.
	<ol>
<li>장소는 vibratome에 뇌 샘플입니다.</li>
		<li>실 온에서 PBS에 두께가 500 µ m까지 조각을 삭감 하 고 단계 5 (AbScale 방법)를 진행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>항 체 얼룩이 필요 하지 않은 경우, 트림 뇌 샘플을 차단 (최대 3 밀리미터 두꺼운) 면도날 (그림 3)를 사용 하 여 및 단계 4 (SeeDB 메서드)를 수행 하십시오. 참고: 두뇌 저장할 수 있습니다 PBS에 4 ° C에서 절단 또는 트리밍 후. SeeDB 메서드를 사용 하면 항 체 염색 법은 불필요 한 때 AbScale 방법 보다 적은 시간을 요구 하기 때문에 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 항 체 (SeeDB 메서드)를 얼룩 없이 지우기
<ol><li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 20% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 40% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 60% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 100% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80.2% (w/w)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 그것을 품 어. 참고: 샘플 변형 가능한 작게 유지을 신중 하 게 처리 합니다. 샘플 신속 하 게 불투명 될 수 있는 이상, 샘플을 품 어 하지 마십시오.</li>
	<li>80.2%과 당 솔루션 (그림 1B)으로 가득 이미징 약 실에 샘플을 포함 합니다. 필요한 경우 주변 고무 접착제의 작은 조각을 넣어 샘플을 수정. 챔버 너무 깊은 경우 샘플을 배치 하기 전에 챔버에는 바닥에 접시를 넣어.</li>
	<li>이미징 챔버에 유리 커버와 함께 페 트리 접시를 놓고 접시, 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 여기 파장 및 방출 필터 표 1에서 설명 합니다. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다.</li>
</ol>5. 항 체 (AbScale 방법) 얼룩을 지우기
<ol><li>표 2에 설명 된 대로 시 약을 준비 합니다.</li>
	<li>Sca/eS0 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 전송 하 고 37 ° C (그림 4B)에서 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 그들을 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 36 h에 대 한 슬라이스를 품 어</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 및 Sca/eB4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 슬라이스를 품 어</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.</li>
	<li>AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C (그림 4C)에서 48-72 시간의 1 mL에 1 차 항 체 (표 3)와 품 어.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 5 mL 플라스틱 튜브에 조각.</li>
	<li>AbScale 솔루션 2 번 부드러운 진동으로 실 온에서 2 h 4 mL에 품 어.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.</li>
	<li>붙일 표시 2 차 항 체 (테이블의 자료, 1: 100) AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C에서 48 h의 1 mL에 함께 품 어.</li>
	<li>조심 스럽게 AbScale 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 제거 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 AbScale 솔루션의 4 개 mL를 추가 2 h 2 시간 실 온에서 부드러운 흔들어 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 4%의 4 개 mL를 추가 PFA 고 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/e s 4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어</li>
	<li>유리 슬라이드에는 스페이서를 배치 하 고 슬라이스는 공백에 놓고 Sca/e s 4 솔루션 분할 영역을 담가. 커버 유리 (그림 1D)와 공백 인감.</li>
	<li>커버 글라스와 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다. 참고: 중요 한 라벨 바이어스의 부재를 확인 표면 부분에는 샘플의 깊은 부분 마찬가지로 표시 여부를 확인 하십시오. 참고: 테스트 항 체의 침투는 표 3에 설명 되어 있습니다.</li>
</ol>6. 셀 위치 결정
<ol><li>스캔된 된 이미지에서 각 위치에 대 한 3 차원 이미지 필터14 (그림 5A-5D)를 사용 하 여 상관 관계 값을 계산 합니다.</li>
	<li>상관 관계 값 (그림 5D)의 봉우리의 위치를 결정 합니다.</li>
	<li>찾을 셀 (그림 5E) 봉우리 이미지 조사.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 마우스 neocortical 레이어 5에에서 주요 세포 유형의 셀 형식 관련 조직의 대규모 3 차원 이미지를 얻기 위해 절차를 제시. 기존의 조각 얼룩에 비해, 메서드는 결정 하는 피 질의 3 차원 조직에 더 유용 합니다. 메서드를 사용 하는 더 넓은에서 이미지 수집 그리고 깊은 두뇌 지구 2 광자 현미경 전형적인 vivo에서 또는 전통적인 confocal 현미경 검사 법에 비해, 따라서 neocortical 휴대의 포괄적인 분석을 허용할 수 있다 조직입니다.
방법의 중요 한 단계는 항 체 침투 이다. 항 체의 하위 집합으로 두꺼운 표본 (표 3), 불 쌍 한 침투를 보여줍니다 그리고, 따라서, AbScale 방법에 사용할 수 없습니다. 이 연구에 사용 된 항 체와 균일 한 라벨을 얻기 위해 500 µ m 조각으로 두뇌를 잘라 하는 데 필요한 했다. 작은 항 체 파편, 예를 들어, 팹 F(ab'...

포유류 피 질 세포 유형, 각각 특정 유전자 표현 패턴, electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 수의 구성 및 기능을 vivo에서 1,2 3,,45,,67. 이러한 세포 유형 반복 구조로 구성 됩니다 여부 되었습니다 분명. 시각적인 방향 열과 somatosensory 배럴을 포함 하 여 대뇌 피 질의 열 구조, 반복 하지만 그들의 세포 조직 남아 불분명8,9. 이들은 특정 대뇌 피 질의 영역에 존재 하 고 뇌 전체 시스템을 않습니다.
Neocortical 계층 5, 뉴런의 대다수는 4 개의 주요 유형으로 분류 됩니다. 주요 유형의 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 흥분 성의 뉴런 프로젝트 폰, 척수, 및 우량한 colliculus 바꾸어 대상에 축 삭 그리고, 따라서,10주요 외피 출력 경로 나타냅니다. 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런 흥분 성의 뉴런의 다른 주요 유형10피 질 자극. 금지 신경 또한 두 개의 주요 클래스를 포함: parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 세포11.
최근 분석 나타냅니다 4 셀 유형 반복된 구조12,,1314로 구성 됩니다. 하위 대뇌 프로젝션 뉴런12,,1314 및 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14 직경 1-2 셀의 셀 타입 특정 microcolumns로 구성. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 정렬 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 microcolumns로 아니라 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14microcolumns. Microcolumns 스스로 형태는 6 각형 격자 배열14 와 마우스 뇌12,14 와 언어 somatosensory, 시각과 모터 분야를 포함 한 여러 피 질 지역에 있는지를 주기적으로 정렬 인간의 뇌는13의 지역입니다. 개별 microcolumn에 신경 동기화 된 활동을 전시 하 고 비슷한 감각 반응이14. 이러한 관측 레이어 5 셀 유형 반복 기능 모듈의 첫 번째 알려진된 뇌 전체 조직을 나타내는 microcolumn 격자 구조로 구성 나타냅니다.
Microcolumns 약 10 µ m의 반지름을가지고 있고 약 40 µ m의 공간 주기. 또한, microcolumns의 방향을 피14에서 그들의 위치에 따라 그들의 변화와 꼭대기 dendrites 평행 하다. 따라서, microcolumn 시스템은 마이크로 미터의 몇 수만의 전형적인 두께가 기존의 대뇌 피 질의 조각을 사용 하 여 분석 하기가 어렵습니다. 또한, 주기 분석 3 차원 데이터는 다양 한 뇌 영역, 그리고, 그러므로, confocal 현미경 검사 법의 일반적인 이미징 영역에서에서 또는 vivo에서 2 광자 영상 너무 좁고입니다.
최근, 기술 두꺼운 조직15,16를 개발 되었습니다. 여기는 microcolumn 시스템을 구성 하는 주요 셀 형식 마우스 neocortical 레이어 5에서에서의 대규모, 3 차원 이미지를 얻기 위해 이러한 방법을 응용 프로그램에 설명 합니다. Subcerebral 프로젝션 뉴런 역행 표시 또는 Crym egfp 유전자 변형 쥐12, 그리고 대뇌 피 질의 프로젝션 뉴런에는 레이블로 역행에 향상 된 녹색 형광 단백질의 식으로 표시 됩니다. 라벨 또는 Tlx3-cre/Ai9 마우스17에 tdTomato 식으로. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 immunohistochemistry에 의해 표시 됩니다. (깊은 뇌 참조) SeeDB 방법19 다른 실험 사용 된다 실험, 얼룩이 지는 항 체 (항 체 규모 S) AbScale 방법18 사용 됩니다. 이러한 방법은 기존의 이미징 방법의 위에서 언급 한 어려움을 극복 하 고 레이어 514의 정확한 세포 조직 공개.

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp 형질전환 마우스</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre 형질전환 마우스</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-td토마토 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 고무 시트</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0.5mm 두께</td></tr><tr><td>실리콘 고무 시트</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1.0mm 두께</td></tr><tr><td>실리콘 고무 시트</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>3.0mm 두께</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소 소단위 B(재조합), Alexa Fluor 488 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소 소단위 B(재조합), Alexa Fluor 555 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소 서브유닛 B(재조합), Alexa Fluor 594 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소 서브유닛 B(재조합), Alexa Fluor 647 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton 주사기</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>주입기 펌프</td>KD <td>Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons 주입</td></tr><tr><td>주입기 펌프</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Superior colliculus injection</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>AstraZeneca</td><td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene microfibrillar hemostat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>외과 실크</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>UVP</td><td>HB-1000 하이브리드라이저</td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>전극 풀러</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 액체, 가벼운</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 바늘</td><td>Inter medical</td><td>&Phi; 0.1 *L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 플라스틱 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-thioglycerol</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fructose</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>이광자 현미경</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>침수 긴 작동 거리 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2mm</td><td></td></tr><tr><td>침수 긴 작동 거리 대물</td>렌즈 <td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3mm</td><td></td></tr><tr><td>전동 스테이지</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>필터</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>필터</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>필터</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 플라스틱 튜브</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 플라스틱 튜브</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>0030120094</tr><tr><td>우레아</td><td>Nacalai 테스크</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>Nacalai 테스크</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>시그마-알드리치</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-소르비톨</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>메틸-&베타;-사이클로덱스트린</td><td>도쿄 화학 공업</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;- 사이클로덱스트린</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸-L-하이드록시프롤린</td><td>스킨 에센셜 액티브</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td><td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsosbed Secondary 항체, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsobed Secondary 항체, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed secondary 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 항토끼 IgG (H+L) 고도로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>침수 장거리 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-Af460</td><td></td></tr><tr><td>안티 파브 알부민</td><td>시그마</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>안티 파브 알부민</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>안티 소마토스타틴</td><td>반도 연구소</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>안티 C-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

포유류 피 질 흥분 성의 억제 신경, 각각 특정 electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 종류의 구성 그리고 vivo에서 기능, 하지만 그들의 기본 기능과 해 부 조직 세포에서 네트워크 규모를 제대로 이해 하 고 있습니다. 여기 우리는 대뇌 피 질의 세포 조직의 조사에 대 한 두뇌의 큰 영역에 걸쳐 붙일 표시 된 신경 세포의 3 차원 영상에 대 한 메서드를 설명합니다. 특정 유형의 신경 형광 퇴행 성 신경 추적기의 주입 또는 유전자 변형 쥐에 형광 단백질의 식에 의해 표시 됩니다. 블록 뇌 샘플, 예, 반구, 고정 후 준비, 청소 방법, 조직으로 투명 하 게 만들 있으며 형광 immunolabeling는 특정 종류의 세포를 받게. 큰 지역 대형 작업 거리 목표 및 자동화 한 단계 또는 두 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 검색 합니다. 이 메서드는 마우스 피 질에는 셀 형식 관련 microcolumn 기능 모듈의 주기적인 조직을 해결할 수 있습니다. 절차는 다른 복잡 한 조직과 다양 한 뇌 영역에 3 차원 세포 구조의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.

우리 /Ai9 유전자 변형 마우스 Tlx3-cre에 tdTomato의 식으로 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런을 표시 하 고 하위 대뇌 프로젝션 뉴런은 폰으로 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 시각. 두뇌의 왼쪽된 반구 SeeDB 메서드를 복종 되었다 및 물 침수 긴 작동 거리 목표를 갖춘 2 광자 현미경을 사용 하 여 스캔 (25 X, N.A. 1.1 작동 거리 2 m m)와 전동된 스테이지. 401 이미지의 스택 (512 x 512 픽셀; 픽셀 크기 = 0.99 µ m) z-단계 = 2.8 µ m 각 30 검색 위치에서 얻은. 두 종류의 세포 세포 시체 뇌 영역 (그림 6), 그리고 정기 microcolumns (그림 7A)를 보여 광학 섹션의 넓은 범위에 보였다. 또한, Crym egfp 마우스 (C57B...

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

이 방법은 신피질의 구조 및 기능 분석과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 뇌의 대규모 3차원 구조를 드러낼 수 있다는 것입니다. 이 방법은 신피질에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 척수와 같은 다른 신경계에도 적용할 수 있습니다.성체 마우스의 폰즈에 추적자를 주입하려면 먼저 형광 표지된 콜레라 독소 서브유닛 B 1마이크로리터를 26게이지 Hamilton 주사기에 넣습니다. 주사기에 인젝터 펌프를 놓고 주사기와 펌프를 입체 기구의 매니퓰레이터의 도구 홀더에 놓습니다. 매니퓰레이터를 수직 축에서 뒤쪽으로 12도 기울입니다.그런 다음 입체 기기에 마우스를 놓습니다. 면도날을 사용하여 털을 제거하여 감염을 예방한다. 그런 다음 브레그마와 람다가 보이도록 두피를 10mm 자릅니다.피펫을 사용하여 0.1ml의 1% 리도카인을 투여합니다. 브레그마와 람다가 동일한 Z 레벨을 갖도록 입체 악기에서 마우스피스의 수직 위치를 조정하여 헤드의 각도를 설정합니다. 다음으로, 주사기의 끝이 브레그마에 가깝도록 매니퓰레이터를 입체 기구에 밀어 넣어 매니퓰레이터의 위치를 조정합니다.매니퓰레이터의 위치를 기록합니다. 매니퓰레이터의 공구 홀더를 움직여 주사기를 집어넣습니다. 그런 다음 매니퓰레이터를 후방으로 5.4mm, 측면으로 0.4mm 이동합니다.끝이 두개골의 진입점에 가까워지도록 주사기를 전진시킨 다음 주사기를 집어넣고 진입점을 표시합니다. 표시된 위치에서 약 1mm 직경의 구멍을 뚫습니다. 팁 깊이가 브레그마에서 측정된 깊이보다 6.9mm 더 크도록 구멍을 통해 주사기 팁을 삽입합니다.그런 다음 펌프를 사용하여 분당 0.2마이크로리터의 트레이서를 주입합니다. 주사 후 뇌에서 주사기를 제거합니다. 필요한 경우, 노출된 뇌를 작은 미세섬유지혈제 조각과 순간 접착제로 덮습니다.노출된 뇌를 식염수로 닦아 감염을 예방하고 두피를 봉합합니다. 그런 다음 입체 기기에서 마우스를 제거합니다. 마우스가 약 한 시간 동안 섭씨 30도의 인큐베이터에서 마취에서 회복될 때까지 기다립니다.흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 마우스가 완전히 회복된 후 다른 동물과 함께 돌아가십시오. 뇌 조직을 채취하려면 가위를 사용하여 두개골을 노출시키도록 두피를 자른다.그런 다음 가위를 사용하여 노출된 두개골의 정중선을 자릅니다. 그런 다음 집게를

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스를 네크로 텍스에 삽입 마우스 오른쪽 단추로 각도 마이크로 일반적으로 통에 발견 관점 여러 피질 레이어의 깊은 화상을 허용합니다. 원 - mm 마이크로는 다양한 현장의 전망 (~ 900 μm의)와 돌기 쪽이를 해결하기 위해 충분한 공간 해상도를 제공합니다. 우리는 계층 V의 연결 이미지와 마이크로를 사용하여 neocortical 혈관 영상을 보여줍니다.

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

이 문서에서 우리는 높은 해상도, 형광 표지 된 마우스의 뇌의 미세 뇌 해부학과, 재구성하는 전체 실험 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜은 샘플 준비 및 청소, 영상, 데이터 후 처리 및 다중 스케일의 시각화를 위해 설치 표본이 포함되어 있습니다.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

여기서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 대규모 Ca 2+ 영상을 수행하는 절차를 제시합니다. 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 헤드 장착 현미경을 사용하여 수백 개의 활성 세포를 동시에 관찰 할 수 있습니다.

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석

이 연구는 생체 외 샘플에서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)과 조영제를 결합하여 신생아 마우스 뇌의 고해상도 이미지를 얻는 단계를 설명합니다. 우리는 이러한 이미지에서 뇌 크기와 모양을 정량화하기 위한 기본 형태 분석을 설명합니다.

Micro-CT 영상 및 생쥐 신생아 뇌의 형태 분석

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 마우스 뇌 조직의 조직 투명화 및 형광 라벨링을 통한 대형 3차원 영상 기법을 신경과학 연구에 활용하는 방법을. 이 기술은 신피질의 세포 조직과 구조를 시각화하여 뉴런 기능 분석에 기여합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

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