Name: 생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 학습하세요 Xenopus 올챙이를 이용한 후각 경로 기능 평가 방법으로 신경생물학 연구에서 생체 내 시냅스 터미널 역할을 규명합니다. 이 기술은 실시간 영상과 행동 분석을 통해 후각 정보 처리 메커니즘을 탐구합니다.

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이 작품은 엘 정부의 드 Economía y Competitividad (MINECO;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 SAF2015-63568-R)에 의해는 유럽 지역 개발 기금 (ERDF), M. G. F. Fuortes 기념 친교, 스티븐 W. Kuffler 친교 기금로 라와 아서 Colwin 부여 여름 연구 친교 기금에서 경쟁력 있는 연구 수상에 의해 cofunded Fischbach 친교 및 해양 생물학 연구소는 국가 Xenopus 리소스 RRID:SCR_013731 (나무 구멍, MA)이이 작품의 일부 실시 했다의 위대한 세대 기금. 우리는 또한 검색 프로그램 감사 / Generalitat 드 Catalunya 제도적 지원에 대 한. 앨 러 배 마 세라 Húnter 연구원 이다입니다.

모든 절차는 바르셀로나의 대학에서 동물 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
참고: X. tropicalis 및 X. laevis tadpoles 표준 방법13,14따라 reared 있습니다. 올챙이 물 물 역삼 여 상업 소금 ( 재료의 표참조)를 추가 하 여 준비가 되어 있습니다. 전도도 µS ∼700 및 ∼1, X. tropicalis 및 X. laevis tadpoles에 대 한 400 µS 각각 조정 됩니다. 애벌레는 자연 교배 또는 체 외 수정에14에 의해 얻어질 수 있다. 배아는 2 %L-시스테인 준비 0.1 x 마크의 수정 Ringers (MMR)에 dejellied. MMR (mM)에 포함 하는 1 x: 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7.8. 애벌레는 2-3 일 (단계 25) 후 올챙이 물 2 L 탱크 전송 됩니다. Tadpoles Nieuwkoop-페이 버 (NF) 기준15의 40 단계에 도달, 그들은 5 리터 탱크에 배치 하 고 10의 밀도 유지 동물/L. 온도 일정 하 게 유지 23-25 ° C와 18-20 ° C에서 X. tropicalis 및 X. laevis 에 대 한 tadpoles, 각각. NF 기준의 48-52 단계에서 발견 하는 동물 실험에 사용 됩니다.
1입니다. 후 각 신경의 transection
<ol><li>0.02%의 anesthetizing 솔루션 준비 실 온에서 올챙이 물 50 mL에 MS-222.</li>
	<li>수술 후 동물의 복구를 허용 하도록 물 올챙이와 작은 탱크 (1-2 패)을 준비 합니다.</li>
	<li>셀 루 로스 질적 필터 종이 (4 cm x 3 cm, 참조 테이블의 재료)의 직사각형 조각 잘라.</li>
	<li>0.02 %MS-222 솔루션에서 셀 룰 로스 질적 필터 종이의 2 개의 습식 및 해 범위에서 그들을 배치.</li>
	<li>탱크에서 한 올챙이 선택 하 고 anesthetizing 솔루션에 몰입할. 동물 2-4 분 이내 수영을 중지 하 고 핀셋을 사용 하 여 꼬리 수준에서 적용 하는 기계적 자극에 반응 하지 않습니다.</li>
	<li>
필터 종이 사각형 조각에 마 취 올챙이 놓습니다. 뇌 구조를 구상 될 수 있다 그래서 그것의 등 쪽 면이 위쪽으로, 동물을 놓습니다.
	<ol>
<li>욕실이 위 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 하나 또는 두 후 각 신경 (실시 하는 시험의 종류)에 따라 잘라. 신경 손상의 내부 통제를 필요로 하는 실험에 대 한 단일 신경 transect</li>
		<li>행동 실험에 대 한 후 각 전구에 도착 하는 모든 odorant 정보를 억제 하기 위해 두 신경 transect. 후 각 신경의 단면 효율 해 범위;에서 쉽게 관찰 될 수 있다 그러나, 착 색 또는 동물 위치 요인 제한 될 수 있습니다. 참고: (선택 사항) 절차의 타당성을 증명 하는 가장 좋은 방법은 사용 하 고 그들의 신 경계에 형광 기자를 표현 하는 유전자 변형 tadpoles (대표 결과 참조). 이 목표에 그것은 형광 (그림 1)를 갖춘 절 개 범위를 사용 해야 합니다. 야생-타입 동물을 사용할 수만 있다면 CM diI와 추적을 사용할 수 있습니다. CM-diI 코 캡슐에 0.3 M 자당에서 준비의 0.5 mg/mL 해결책 주입 프로토콜 2 (아래 참조)을 따릅니다. 준비 및 CM diI의 스토리지에 대 한 자세한 내용은 16 을 참조 하십시오. 주 구멍에서 염료의 누출을 최소화 해야 합니다. 이 목표를 사출 압력 및 micropipettes의 개통 수정할 필요가 있다. 嗅의 사 계층의 수준에서 형광 CM diI의 신청 후 분명 24 시간 된다. 현재 작업을 사용 하 여 CM diI로 그냥 인증 transection 절차; 그러나,이 방법은 또한 전통적인 조직학 절차를 사용 하 여 후 각 glomeruli의 형태학 정보를 얻기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구 탱크에 동물을 전송 합니다. Tadpoles는 일반 수영 동물의 ~ 1% 예상 된다 출혈의 존재에 대 한 주의 깊은 검사 수술 대상이 수행 ~ 10 분 이내 복구 해야 합니다.</li>
	<li>0.2 %MS-222 솔루션에 부상된 동물 안락사</li>
</ol>2. 형광 칼슘 지표와 후 각 수용 체 신경의 라벨
<ol><li>12%를 포함 하는 솔루션 준비 칼슘 녹색-1-dextran ( 재료의 표참조), 0.1% 트라이 톤 X-100, 1 mM NaCl17. 그것은 한 달 이내에 사용 하는 경우-80 ° C 또는-20 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>팁 채용 ~ 1-2 µ m (패치 클램프 실험을 위해 사용 하는 microelectrodes에 유사한 직경)와 유리 펫 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 microinjection에 대 한 준비 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>Microinjections의 볼륨 보정. 0.15-0.3의 주입 볼륨을 얻기 위하여 압력과 주입 시간을 조정, 증류수를 사용 하 여 µ L. 참고: 간단한 절차 1 µ L의 물으로 가득 피 펫을 빈 하는 데 필요한 펄스의 수를 계산에 구성 되어있습니다. 일반 매개 변수는 30 psi와 50 ms 주입 시간 압력.</li>
	<li>microinjector에는 피 펫을 놓고 ~ 2 µ L 칼슘 그린 1 dextran 솔루션의 함께 로드 합니다.</li>
	<li>준비 단계 1.1 1.6 올챙이.</li>
	<li>코 캡슐의 주요한 강에는 피 펫의 끝을 이동 합니다. 참고: 그림 2Xenopus 올챙이에서 후 각 통로의 위치를 설명 하 참조 하십시오.</li>
	<li>2.3에서 얻은 설정을 사용 하 여, 퍼프의 몇 가지를 제공 합니다. 코 캡슐에 염료 존재를 제한 합니다.</li>
	<li>올챙이 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 2-3 분 휴식, 건조를 피하고 동물의 더 꼬리 부분에 0.02 %MS-222 솔루션의 방울을 부 어 보자.</li>
	<li>복구 탱크에 동물을 전송 합니다. 참고: 그것은 정상적인 수영을 복구 한다 ~ 10 분 내에서 동물의 조작 부상을 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>0.2 %MS-222 솔루션을 사용 하 여 주입 후 정상적인 수영 동작 15 분을 복구 하지 tadpoles 안락사</li>
	<li>주입 후 당일 嗅의 사 계층의 수준에서 형광을 관찰 합니다.</li>
</ol>3. 연 접 응답의 라이브 이미징 Tadpoles의 준비
<ol><li>실험을 수행 하기 전에 24-48 h 코트 실리콘 탄성 중합체 (예: Sylgard)와 35 m m 직경의 4-6 접시. 탄성 중합체 생산은 일단은 올챙이 맞게 직사각형 잘 조작. 참고: X. tropicalis tadpoles NF 단계 48-52에서 발견에 대 한 일반적인 크기는 10 x 4mm입니다.</li>
	<li>1mm 아미노산 솔루션 tadpoles 위한 odorant 자극 역할 160 µ M의 100 mL를 준비 합니다. 솔루션에는 여러 가지 아미노산 혼합물 포함 될 수 있습니다: 메티오닌, 신, 히스티딘, 아르기닌, 리 진. 아미노산 (mM)에서 이루어진 Xenopus 벨의 솔루션에서을 희석: 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 포도 당, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7.8. 그 pH는 7.8에서 유지 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>아미노산 솔루션의 20 mL로 높은 저수지를 채우십시오. 폴 리 에틸렌과 저수지를 연결 튜브 28 G 모 세관 튜브를 코 캡슐 위에 배치 ( 재료의 표참조). 참고: 모 세관 튜브는 micromanipulator에 마운트되어 ( 재료의 표참조). 공기 방울 결 석 해야 관류 시스템에서.</li>
	<li>일시적인 정밀 솔레노이드 핀치 밸브 ( 재료의 표참조)의 트랜지스터-트랜지스터 논리 (TTL) 컨트롤을 사용 하 여 아미노산 솔루션 적용을 달성. 자극은 TTL 펄스 ( 재료의 표참조)을 생성 하는 데 사용 됩니다. TTL 펄스의 지속 시간을 변경 하 여 odorant 솔루션을 제공 하는 임시 정밀 검사 즉,., 0.1 ~ 1 s.</li>
	<li>Xenopus 벨의 솔루션의 100 mL에 다른 높은 저수지를 채우십시오.</li>
	<li>Anesthetize는 올챙이 고 해 범위 (단계 1.1 1.6)에서 그것을 배치.</li>
	<li>영상에는 올챙이 준비 합니다. 흰둥이 tadpoles 사용할 수 있는 경우 3.9 단계로 진행, 영상 (단계 3.8) 손상 melanocytes을 포함 하기 때문에 그렇지 않으면 嗅 위의 피부를 제거. 참고: 동물의 착 색에 따라 실험을 수행 하는 방법은 두 가지가 있습니다. 알 비 노 동물을 사용 하는 것이 바람직합니다. 알 비 노 변종 X. laevis 에 대 한 사용할 수 있으며 최근 흰둥이 X. tropicalis 라인 CRISPR Cas9 12 또는 TALENs18에 의해 생성 된.</li>
	<li>욕실이 위를 사용 하 여, 중앙 신경 시스템의 가장자리에 올챙이 피부에는 측면 절 개를 확인 합니다. 확인 컷 嗅 결코 tectum, 시 신경의 위치에 의해 쉽게 확인 될 수 있습니다의 위치를 도달 하는 고 수준에서 여야 한다.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 잘라 피부를 꼬 집 고 신 경계를 통해 그것을 끌어. 후 각 전구 위에 melanocytes의 부재에 의해 성공적인 제거를 확인 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 0.02 %MS-222 솔루션의 붓는 드랍 스에 의해 동물 촉촉한 유지.</li>
	<li>코팅된 접시의 우물에는 올챙이 배치 ( 재료의 표참조). 동물의 위 높은 진공 기름 코팅 유리 coverslip 넣어. 꼬리의 끝에 tectum의 상단을 충당 하기 위해 coverslip 위치.</li>
	<li>유지는 후 각 전구 및 placodes extracellular 매체에 노출. 움직이지는 올챙이 이미징 동안 유지. Xenopus 벨 solutioncontaining 100 µ M tubocurarine 페 트리 접시를 채워 ( 재료의 표참조) 근육 수축 방지 하기 위해. 참고: Tubocurarine 보다 6 개월 이상-80 ° C에서 aliquots에 저장 됩니다.</li>
	<li>똑바로 현미경 올챙이 들고 접시를 놓습니다. 동물을 위해 살아 있는 유지 하 Xenopus 벨의 솔루션의 지속적인 관류에 대 한 폴 리 에틸렌 튜브 ( 재료의 표참조)을 사용 하는 접시와 함께 Xenopus 벨의 솔루션을 포함 하는 저수지를 연결 &gt; 1 h. 참고: 미니 마그네틱 클램프 ( 재료의 표참조)는 매우 안정적으로 접시에 튜브를 연결 하는 유용 합니다. 관류와 흡입 튜브 ~ 180 ° 각도에 위치 해야 합니다.</li>
	<li>Xenopus 벨의 솔루션 perfusing를 시작 합니다. 실험을 통해 요리 상수에서 솔루션의 수준을 유지 합니다. 지속적으로 혈관을 통해 혈액 순환을 관찰 하 여 올챙이 생존 능력을 평가 합니다.</li>
</ol>4. 라이브의 연 접 캘리포니아2 + 변화 후 각 Glomeruli Imaging
참고: 이미징 절차 넓은 필드 현미경 검사 법에 대 한 설명 하지만 수 있습니다 쉽게 적응 confocal 현미경 수집 설정을 조정 하 여. 이미징 방진 테이블에 장착 하는 직 립 현미경에 실시 한다.
<ol><li>낮은 확대 목적으로 올챙이 시각화 예 5 배.</li>
	<li>후 각 신경으로 90 ° 각도 형성 하는 1 개의 비 강 캡슐 상단 odorant 솔루션을 제공 하는 모 세관을 micromanipulator 축 이동 합니다. 후 각 전구 위에 odorant 솔루션의 흐름 왜곡 영상 소란 발생할 수 있기 때문에 피해 야 한다.</li>
	<li>Ipsilaterally는 높은 확대, 긴 작동 거리를 사용 하 여 (자극)에 따라 비 캡슐에 있는 후 각 전구 물 침수 목표 찾기: 60Xx, 0.9 없음</li>
	<li>형광 방출 눈으로 확인 합니다. 사 구조는 분명 (그림 2B) 해야 합니다.</li>
	<li>칼슘 이미징에 대 한 적합 한 카메라와 함께 라이브 수집을 수행 합니다. 일반적으로 256 x 256 또는 512 x 512 픽셀의 전체 후 각 전구를 포함 하는 상자를 정의 합니다. 설정 인수 프레임 속도 수집을 20-40 Hz. 기저 형광의 값은 채도의 ~ 20% 증가을 조정 한다. 5 s 비디오를 취득 합니다.</li>
	<li>영화를 시각화 합니다. 이미지 포커스, 운동 유물과 포화 픽셀을 포함 하는 지역의 부재를 확인 하십시오. 16-비트 카메라를 사용 하는 경우 5000-20000 거리의 사 영역의 일반적인 형광 값 이어야 한다. 이미징 조건에 최적의 경우 다음 단계를 진행 합니다. 이미지 품질을 향상 또는 이득 설정을 조정 하는 데 필요한 경우 4.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>시간 경과 수집 후 각 자극에 의해 되 살려 진 응답을 시작 합니다. 참고: 정확한 응용 프로그램 odorant 솔루션의 TTL 자극에 의해 제어 됩니다. 전형적인 실험 포함 4의 초기 기간 0.1에서 0.5 까지의 시간 자극 다음 s s와 6-10 s의 복구 기간.</li>
	<li>시간 간격에 대 한 odorants의 반복적인 stimulations 수행 &gt; 2 분 1-1.5 mL·min-1로 흐름 속도 설정. 이후 글로벌 관류에 모든 실험 중, 로컬로 적용된 아미노산 밖으로 세척 된다. 참고: 요리에서 솔루션의 볼륨 ~ 3 mL 이다.</li>
	<li>
이미지 분석
	<ol>
<li>응답의 검출<ol>
<li>ImageJ를 영화를 내보냅니다. 참고: 목표는 사 지역 자극에 응답의 존재를 감지 하 고.</li>
			<li>원시 일련의 δ/F0 영화를 형광 이미지를 변환 합니다. 다음과 같은 관계에 따라 기저 형광에 상대적인 변화를 측정: (F F0) /F0, F0 기준선 형광 레벨을 나타냅니다.</li>
			<li>자극 하는 동안 상 상속 형광 증가 보여주는 일대 관심 (ROI)의 지역 그리고 ROI 관리자 (그림 2E)에서 그들의 위치를 기록. 사 구조 없는 지역에 배경 형광 레벨을 검출 하는 투자 수익을 그립니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>응답 부 량이 고<ol>
<li>형광 이미지의 원시 순서로 정의 ROIs를 배치 합니다. 각 프레임에 대 한 선택한 ROIs의 평균 회색 값을 구할. 분석 프로그램에 가져온 값의 시퀀스를 전송 (예:., 이고르 프로).</li>
			<li>배경 형광을 빼기 고 각 ROI (그림 2F)에 대 한 δ/F0 변경 계산. ROIs 선택의 각 한 δ/F0 에 증가 플롯 합니다. (자극) 전에 기저 δ/F0 의 표준 편차를 계산 합니다. 참고: 긍정적인 반응은 자극은 기저 값의 2 표준 편차 보다 큰 경우 δ/F0 에서 증가 하는 동안 간주 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 후 각 기반 동작 분석 결과
참고: 분석 결과 수행 하기 위한 설치의 회로도 그림 3에 표시 됩니다.
<ol><li>1.57 m m 마약과 x 1.14 m m 아이디 튜브 6-잘 접시의 각의 위쪽 부분에 맞게 작은 구멍을 확인 합니다. 튜브를 삽입 하 고 에폭시 접착제를 사용 하 여 봉인 ( 재료의 표참조). 참고: 수정 된 접시 수 재사용 여러 번 증류수와 철저 한 세척 후.</li>
	<li>메티오닌, 신, 히스티딘, 아르기닌, 리 신 (자세한 내용은 3.2 단계 참조)를 포함 하는 아미노산 솔루션 50 mL를 준비 합니다. 농도 범위는 160 µ M에서 1 m m입니다. 높은 저수지에 솔루션의 20 mL를 배치 합니다.</li>
	<li>분석 결과 전에 적어도 12 h tadpoles 피드 하지 마십시오. 그들의 주택 탱크에서 6 tadpoles를가지고 고 odorants에 노출을 최소화 하기 위해 깨끗 한 올챙이 물 2 L에 넣어.</li>
	<li>백색 LED transilluminator (그림 3)에 수정된 6 웰 스 접시를 놓습니다.</li>
	<li>포함 하는 매니폴드를 사용 하 여 아미노산 솔루션 저수지를 관류 후미 커플 ( 재료의 표참조). 관류 시스템을 확인 하 고 공기 방울을 제거. 6 우물을 동시에 입력 합니다. ~ 30 odorant 솔루션의 ≥5 mL의 배달 있도록 저수지의 높이 조정 s. 참고: 각각 4 번 잘 더블 증류수 odorant 솔루션에 노출 후 씻어.</li>
	<li>각 채우기 올챙이 물 10ml와 잘. 장소 1 올챙이/음. 휴식을 &gt; 3 분.</li>
	<li>이미지 수집을 설정 합니다. ≥5 Hz. 연결 컴퓨터에 카메라에서 이미지를 취득할 수 있는 기존의 CCD 카메라를 사용 합니다. 여기, 선 소프트웨어에 의해 제어 하는 Zeiss MRC5 카메라를 사용 하지만 다른 동일한 구성을 사용할 수 있습니다. 프레임 속도를 증가 필요한 경우 픽셀 binning 적용 됩니다. 이미지는 전체 6-잘 접시를 표시 해야 합니다.</li>
	<li>시작 이미지 수집의 영화 포함 되도록 기저 (30 s), 자극 (25-35 s) 및 복구 (30-60 s) 기간.</li>
	<li>화상 후 6 웰 스 접시에서 탱크 동물을 반환 합니다.</li>
	<li>ImageJ 운동에 관련 된 여러 매개 변수를 제공 하는 wrMTrck19,20 같은 플러그인을 사용 하 여 영화를 분석 합니다.</li>
	<li>분석을 위해 이미지를 준비 하려면 먼저 35 x 35mm(그림 4)의 직사각형 ROI를 그려서 잘을 선택 합니다. 전체 시퀀스의 최대 투영을 계산 하 여 배경 이미지를 얻을. 그것은 올챙이 없이 잘의 이미지를 표시 한다.</li>
	<li>원시 영화에서 최대 투영을 뺍니다. 생성 된 32 비트 영화에 임계 처리를 수행 하 고 wrMTrck 플러그인 적용. 안정적으로 동물의 움직임을 추적 하는 WrMTrck 매개 변수를 조정 합니다. 얻은 전송 분석 프로그램으로 X, Y 좌표.</li>
	<li>사용 하 여 Xy 좌표를 다음 방정식을 적용 하 여 odorant 소스 (잘에서 관류 입구)에 유클리드 거리를 계산. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58028/58028eq1.jpg"> 여기서 운영 체제 냄새 소스 위치를 나타냅니다 하 고 태 드 주어진된 시간에 올챙이 위치를 나타냅니다. 자세한 내용은 그림 4를 참조 하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에 설명 합니다 생활에서 후 각 통로의 기능을 조사 하기 위해 유용한 기술 Xenopus tadpoles. 현재 프로토콜을 작동, 또는 Xenopus;에 접근이 그 실험실에 대 한 특히 유용 그러나, 그것은 또한 신경 재생 및 수리의 세포질과 분자 기초를 공부 하 고 그 연구에 대 한 흥미로운입니다. Xenopus 에서 얻은 결과 보존된 메커니즘을 식별 하기 위해 다른 척추 동물 모델에서 수집한 데이터와 결합할 수 있습니다. 설명 하는 방법을 유전자 변형된 Xenopus18,,2223 의 개발에서 유익 하 고, tadpoles24, 신 경계 질환의 실험 모델에 적용 되는 25.
<...

Xenopus tadpoles 신경 시스템의 정상적인 기능을 공부 하는 우수한 동물 모델을 구성 합니다. 투명성, 완전히 시퀀스 게놈1,2, 그리고 수술, electrophysiological 및 이미징 기법에 대 한 접근은 신경 기능 vivo에서3 조사 허용 Xenopus 애벌레의 독특한 속성 . 이 동물 모델의 여러 실험 가능성의 일부 올챙이 감각 및 모터 시스템4,,56에 수행 하는 철저 한 연구에 의해 설명 됩니다. 정보 처리 시 냅 스 수준에서의 여러 측면을 연구 하는 특히 적합된 신경 회로 Xenopus 올챙이 후 각 시스템7입니다. 첫째, 그것의 시 냅 스 연결은 잘 정의 된: 후 각 수용 체 신경 (ORNs) 후 각 전구에 프로젝트 및 냄새 지도 생성 하기 위해 glomeruli 내의 셀 mitral/술의 dendrites와 시 냅 스 연락처 설정. 둘째, 그것의 ORNs 후 각 경로8의 기능을 유지 하기 위해 전 생애에 걸쳐 신생에 의해 지속적으로 생성 됩니다. 그리고 셋째, 때문에 후 각 시스템 훌륭한 재생 능력을 보여줍니다, Xenopus tadpoles 수 있습니다 완전히 절제9후 그들의 후 각 전구를 개혁.
이 논문에서 우리 생활 tadpoles에 후 각 glomeruli의 이미징 행동 실험 연구 후 각 통로의 기능을 결합 하는 방법을 설명 합니다. 여기서 설명 하는 방법은 후 각 신경 transection10후 후 각 전구에 사 연결의 기능 회복을 공부 하 사용 되었다. Xenopus tadpoles에서 얻은 데이터는 척추 동물의 진화 후 각 처리 이므로 보존.
X. tropicalis 를 사용 하 여 설명 하는 방법 exemplified 하지만 그들은 X에서 쉽게 구현할 수 있습니다. laevis. 성인 X. laevis의 더 큰 크기에도 불구 하 고 두 종의 올챙이 단계 동안 현저 하 게 유사 하다. 주요 차이점은 게놈 수준에서 상주합니다. X. laevis allotetraploid 게놈 및 긴 생성 시간 (약 1 년)에 의해 주로 결정 가난한 유전자 추적성을 표시 합니다. 반대로, tropicalis 엑스는 더 짧은 생성 시간 (5-8 개월)와 2 중 게놈 유전자 수정 의무가. 대표적인 실험 동물 야생-타입 및 3 개의 다른 유전자 변형 라인에 대 한 설명 된다: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) 및 tubb2:GFP (X. laevis).
현재 작업에 설명 된 방법론 Xenopus 필드에 유전 진행 함께 고려 되어야 한다. 단순 하 고 쉬운 구현 기술 제시의 그들이 이미 설명된 돌연변이11, CRISPR-Cas9 기술12에 의해 생성 된 Xenopus 라인 평가 하는 데 특히 유용 합니다. 우리는 또한 수술 Xenopus tadpoles에 액세스할 모든 실험실에서 구현할 수 있는 후 각 신경 transect를 사용을 설명 합니다. 연 접 칼슘 응답을 평가 하는 데 사용 하는 접근 하 고 후 각 기반 동작 임에도 불구 하 고 적절 한 비용에 사용할 수 있는 특정 장비를 요구. 방법론 연구 그룹에서 그들의 사용을 촉진 하는 간단한 형태로 제시 하 고 개선을 구현 하거나 다른 기술, 즉, 조직학 또는 유전 접근에 협회에 의해 더 복잡 한 분석의 기초를 설정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>수족관용 소금(인스턴트 오션 솔트)</td><td>테크니플라스트</td><td>XPSIO25R</td><td></td></tr><tr><td>트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 #5(팁 0.025 x 0.005mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors(팁 0.015 x 0.015)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 질적 여과지</td><td>Fisher Scientific</td><td>WH3030917</td><td></td></tr><tr><td>X. laevis tubb2-GFP</td><td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td><td>NXR_0.0035</td><td></td></tr><tr><td>X.tropicalis NBT-GFP</td><td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-7001</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 그린 덱스트란, 칼륨 염, 10,000MW,</td> 미세주입용 음이온성 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 모세관</td> 서<td>터 기기</td><td>B100-75-10</td><td>O.D.=1.0mm, I.D.=0.75mm.</td></tr><tr><td>풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>파커 인스트루먼트</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 마이크로피펫</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>정립 현미경</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager-A1</td><td></td></tr><tr><td>Master-8 자극기</td><td>A.M.P.I.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>하마마츠</td><td>이미지 EM</td><td></td></tr><tr><td>솔레노이드 밸브</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>VC-6 6 채널 시스템</td><td></td></tr><tr><td>다우 코닝 고진공 그리스</td><td>VWR 과학</td><td>636082B</td><td></td></tr><tr><td>Tubocurarine 염산염</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T2379</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Zeiss</td><td>MRC-5 카메라</td><td>Zen에 의해 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>카메라 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>MVL8ML3</td><td>사용되는 카메라 모델에 적용해야 할 여러 가지 가능성이 있습니다</td></tr><tr><td>: 에폭시 수지</td><td>RS 구성 요소</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>매니 폴드</td>, <td>워너 악기</td><td>MP-6 관류 매니 폴드</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터, 솔루션의 현지 전달을위한 마이크로 매니퓰레이터</td>, <td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr>, <tr><td>미니 마그네틱 클램프</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>MAG-7, MAG-6</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0755</td><td>O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.</td></tr></tbody></table>

생활 xenopus tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles 신경 시스템의 기능을 조사 하기 위해 독특한 플랫폼을 제공 합니다. 그들은 수많은 이미징 접근, electrophysiological 기법과 행동 분석에 대 한 접근 등 여러 실험 장점을 제공합니다. Xenopus 올챙이 후 각 시스템은 정상적인 개발 동안 또는 부상 후 개혁 시 냅 스의 기능을 조사 하는 특히 적합 합니다. 여기, 우리 생활에서 후 각 정보 처리를 평가 하는 방법론을 설명 Xenopus 애벌레. 우리는 후 각 기반 동작 분석으로 후 각 전구의 glomeruli에 연 접 칼슘 반응의 vivo에서 측량의 조합 개요. 메서드 후 각 신경 시 냅 스 연결의 rewiring 공부 transection 결합 될 수 있다. 실험은 중앙 신 경계 세포에서 GFP 기자 표현 야생-타입 및 유전자 변형 동물을 사용 하 여 표시 됩니다. 유전자 변형된 tadpoles를 설명 하는 방식의 응용 분자 기초 척추 동작을 정의 하는 분열에 대 한 유용할 수 있습니다.

이 문서에서는 Xenopus 올챙이 후 각 시스템의 기능 vivo에서 연구를 수행 하기 위해 두 가지 보완 방법의 조합 소개: 나) 생활의 glomeruli 이미징 연 접 캘리포니아2 + 하는 방법 변경 tadpoles는 형광 칼슘 표시기, 및 ii를 사용 하 여) 냄새 유도 행동 분석 결과 특정 waterborne odorants에 대 한 응답을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 접근 부상10후 후 각 처리의 복구를 평가 하기 위해 고용 되어, 이후 transecting 후 각 신경에 대 한 간단한 방법은 또한 설명 합니다.
후 각 경로의 transection Xenopus <stro...

Xenopus tadpoles vivo에서 신경 시스템의 기능을 조사 하기 위해 독특한 플랫폼을 제공 합니다. 우리 생활에서 후 각 정보 처리를 평가 하는 방법론을 설명 Xenopus 애벌레 정상적인 양육 조건에서 또는 부상 후.

생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

이 방법은 사전 시냅스 말단이 생체 내에서 어떻게 작동하는지와 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 유용할 수 있습니다. 이 기술 세트의 주요 장점은 제노푸스 올챙이를 동물 모델로 사용하여 후각 경로의 기능을 어설프게 하는 무료 접근 법을 보여 준다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 나 자신, 베아트리체 테르니, 파올로 파치올라가 될 것입니다.0.02%MS2 22 마취용액에 셀룰로오스 질적 필터 용지 2개를 적시고 해부 범위 아래에 배치하여 담부 절차를 시작합니다. 그런 다음 탱크에서 올챙이를 선택하고 마취 용액 접시에 담가 두세요. 올챙이는 2~4분 이내에 수영을 중단해야 합니다.핀셋을 사용하여 꼬리 수준에 적용되는 기계적 자극에 대한 반응이 없기 때문에 적절한 마취를 확인하십시오. 마취된 올챙이를 필터 용지에 범위 아래에 놓습니다. 뇌 구조를 시각화할 수 있도록 등쪽면을 위쪽으로 향하여 동물을 배치합니다.행동 실험의 경우 베니 가위를 사용하여 두 신경을 모두 분리하여 후각 전구에 도착하는 모든 악취 정보를 억제하십시오. 칼슘 녹색 1 개의 덱스트린 용액의 두 마이크로 리터로 폴드 유리 파이펫을적재하고 마이크로 인젝터에 넣습니다. 필터 용지에 해부 현미경 아래에 마취 된 올챙이를 놓고 파이펫 끝을 비강 캡슐의 주요 캐비티로 이동하고 염료의 0.15 내지 0.3 마이크로 리터를 전달합니다.올챙이를 2~3분 동안 제자리에 두십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 0.02%MS2 22 용액을 건조를 피하기 위해 동물의 더 많은 코들 부분에 드립하십시오. 올챙이가 10 분 이내에 정상적인 수영을 회복해야하는 복구 탱크로 동물을 옮길 수 있습니다.주사 후 날에 후각 전구의 구체 층 의 수준에서 꽃집을 관찰하십시오. 먼저 후각 전구 위의 피부를 제거하여 이미징을 위해 마취 된 올챙이를 준비합니다. 베니 가위를 사용하여 후각 전구 의 수준에서 중추 신경계의 가장자리에 올챙이의 피부에 측면 절개를합니다.시신경의 위치에 의해 쉽게 식별 될 수있는 텍텀으로 절단을 연장하지 마십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 0.02%MS2 22 용액을 떨어 뜨린 다음 핀셋을 사용하여 절단 된 피부를 꼬집어 신경계 위로 당겨 동물을 촉촉하게 유지하십시오. 후각 전구 위에 멜라닌세포의 부재에 의해 성공적인 제거를 확인합니다.올챙이를 셀 가드 코팅 접시의 우물에 넣습니다. 높은 진공 그리스로 코팅된 유리 커버 슬립을 배치하여 텍텀의 상

functional-evaluation-of-olfactory-pathways-in-living-xenopus-tadpoles

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 invertebrate 후각 경로의 처음 세 단계에서 냄새 evoked 응답을 특징하는 세포 다중 단위 기록 기술의 변화를 보여줍니다. 이 기술은 쉽게뿐만 아니라 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 검토하도록 구성 할 수 있습니다.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

제노는 올챙이가 검은 색 / 흰색 탱크의 흰색 측면에서 수영을 선호 ​​laevis의. 이 동작은 자신의 비전에 의해 유도된다. 이 동작을 바탕으로, 우리는 올챙이의 시각 기능을 테스트 할 수있는 간단한 분석을 제시한다.

테스트 시각 기능에 대한 간단한 행동 분석<em&gt;는 Xenopus laevis의</em

마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

우리는 뉴런 형태와 시간 경과에 따른 발달을 시각화하기 위해 전기천공법과 후속 컨포칼 레이저 스캐닝 또는 다광자 현미경에 의한 후각 감각 뉴런의 생체 내 라벨링 프로토콜을 설명합니다.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는 생체

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

여기에서는 Xenopus laevis  의 후각구에서 온도 반응을 측정하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.후각 수용체 뉴런과 승모세포는 다르게 염색된 후 칼슘 변화가 기록되며, 이는 코에서 유도된 온도 강하에 대한 전구의 일부 신경망의 민감도를 반영합니다.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

이 프로토콜 분석 초파리 애벌레 동시 optogenetic 그것의 후 각 신경의 자극에 대 한 응답에서의 탐색 동작 합니다. 630 nm 파장의 빛은 빨간색 이동 채널 rhodopsin 표현 개별 후 각 신경 세포를 활성화 하는 데 사용 됩니다. 애벌레의 움직임이 동시에 추적 하 고 디지털 기록, 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

이 프로토콜은 후각 회로 어셈블리의 연구를 위한 안테나-뇌 explant 시스템의 해부 절차, 배양 조건 및 라이브 이미징을 기술한다.

초파리의 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 이미징 연구를위한 Explant 시스템

여기에서는 초파리 청소년 뇌에서 더듬이엽 시냅스 사구체의 후각 경험 의존적 리모델링을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다.

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period(어린 뇌 후각 감각 뉴런 시냅스 연결성의 경험 의존적 리모델링)

학습하세요 Xenopus 올챙이를 이용한 후각 경로 기능 평가 방법으로 신경생물학 연구에서 생체 내 시냅스 터미널 역할을 규명합니다. 이 기술은 실시간 영상과 행동 분석을 통해 후각 정보 처리 메커니즘을 탐구합니다.

생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가

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