Name: 차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 배우세요 수정된 4C-seq 프로토콜을 사용하여 PCR 편향을 최소화하고 크로마틴 상호작용을 정확하게 포착하는 방법. 이 기법은 전사 조절 및 프로모터-인핸서 상호작용 연구에 필수적인 도구입니다.

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<ol><li>Dunham, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Hoffman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+chromatin+elements+from+ENCODE+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Chromosome+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter-centered+chromatin+interactions+provide+a+topological+basis+for+transcription+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation.</a> Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).</li>
<li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Van De Werken, H. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C+technology%3A+Protocols+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">4C technology: Protocols and data analysis.</a> Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).</li>
<li>Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Interrogation+of+3D+Genome+Topology+Using+Chromosome+Conformation+Capture+Coupled+to+High-Throughput+Sequencing+%284C-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Transcriptional+and+Post-Transcriptional+Gene+Expression+Regulation%22%5BJournal%5D)">Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq).</a> Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).</li>
<li>Matelot, M., Noordermeer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+High-Resolution+3D+Chromatin+Organization+Using+Circular+Chromosome+Conformation+Capture+%284C-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Polycomb+Group+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq).</a> Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).</li>
<li>Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Long-Range+Chromatin+Interactions+Using+the+Chromosome+Conformation+Capture+Sequencing+%284C-seq%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Regulatory+Networks%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method.</a> Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).</li>
<li>Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+circular+chromosome+conformation+capture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution circular chromosome conformation capture assay.</a> Nature. 3 (2), 303-313 (2008).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+digestion+monitors+facilitate+plasmid+construction+and+PCR+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning.</a> BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic4Cseq%3A+An+R%2FBioconductor+package+for+analyzing+4C-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).</li>
<li>Raviram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C-ker%3A+A+Method+to+Reproducibly+Identify+Genome-Wide+Interactions+Captured+by+4C-Seq+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments.</a> PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).</li>
<li>Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FourCSeq%3A+analysis+of+4C+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FourCSeq: analysis of 4C sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).</li>
<li>Williams, R. L. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li>
<li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li>
<li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li>
<li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787(2017).</li>
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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

4 C 결과 공개 이전에 알려지지 않은 규제 요소를 식별할 수 있는 chromatin 상호 작용 및/또는 대상 유전자 특정 생물 학적 컨텍스트24,,2526중요 한 가능성이 있습니다. 그러나, 기술적인 장애물은이 실험에서 얻은 데이터를 제한할 수 있습니다. 4 C 프로토콜에 서식 파일의 이상 증폭에서 형태소 분석 PCR 바이어스가 높습니다. 이 프로토콜 활용 정량 Pcr 증폭의 최적의 수 객관적인 방법에서 주기를 결정 하 여이 문제를 해결 합니다. 또한, 금지 다이제스트에 의해 증폭된 역 PCR 제품에서 미끼 시퀀스의 제거 수 두 가지 이유로 chromatin 상호 작용의 id를 촉진 한다. 첫째, 그것은 시퀀싱 할 물자에서 유익한 비 (미끼) 기본적인 쌍의 길이 줄일 수 있습니다. 둘째, 그리고 그 결과로, 그것은 가능성을 더 읽기 다양 한 시퀀스 (정확한 기본...

유전자 발현에 대 한 규제 요소의 id 인간 게놈1,2의 80% 기능 활동을 포괄적으로 주석 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩) 프로젝트에 의해 촉진 되었습니다. 녹음 방송 요인 바인딩 vivo에서 , DNaseI 과민성 및 epigenetic 히스톤 DNA 메 틸 화 수정 개별 셀에 대 한 사이트의 식별 후보 규제의 기능 분석에 대 한 방법을 포장 대상 유전자 발현에 대 한 요소입니다. 이러한 결과와 무장, 우리 규제 요소와 유전자 간의 기능 상호 결정의 도전으로 직면 된다. 특히, 주어진된 대상 유전자와 그것의 enhancer(s) 사이 관계는 무엇 인가? 염색 질 구조 캡처 (3 C) 메서드는 직접 식별 물리적, 그리고 가능성이 기능, 상호 작용을 통해 관심 영역 및 시퀀스 고정된 chromatin3에에서 캡처된 이벤트를 통해 상호 작용 하는 후보 사이이 질문을 해결 . 그러나 Chromatin의 상호 작용에 대 한 우리의 이해 증가로, 그것은 분명 미리 후보 loci의 조사 유전자 증강 상호 작용의 완전 한 이해를 제공 하는 부족 한 것입니다. 예를 들어 인코딩 높은 처리량 염색체 구조 캡처 탄소 복사 (5 C) 방법을 사용 하는 인간 게놈 (1%, 파일럿 44 loci의 설정)의 작은 부분을 검사 하 고 보고는 loci의 복잡 한 상호. 유전자와 확인 된 상호 강화 평균 2-4 다른 상호 작용 파트너는 많은 수백 kilobases 선형 공간4에서 멀리 했다. 또한, 리튬은 외. 전체 게놈 발기인 상호 작용을 분석 하 여 RNA 중 합 효소 II 바인딩 사이트의 65 %chromatin 상호 작용에 참여 했다 발견 Chromatin 상호 작용 분석 쌍 끝 태그 시퀀싱 (ChIA 애완 동물)를 사용. 이러한 상호 작용 중 일부 결과 kilobases 게놈 거리 및 포함 하는, 평균,의 수백에 걸쳐 큰, 다중 유전자 복합물에 8-9 유전자 각5. 함께,이 발견 심문 chromatin 상호 작용에 대 한 편견된 전체 게놈 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 슈미트 외에 이러한 방법 중 일부를 검토 한다. 6.
Chromatin 구조 캡처 연구에 대 한 더 많은 최근 방법 관심6의 지역 상호 작용 하는 알 수 없는 시퀀스의 발견 다음-세대 시퀀싱 (Hi-C와 4 C-seq) 활성화와 결합. 특히, 다음-세대 시퀀싱 (4 C-seq) 원형 염색체 구조 캡처 loci 캡처된 chromatin에 인접에서 DNA 시퀀싱 하 여 공평한 방식으로7 의 시퀀스와 상호 작용을 식별 하기 위해 개발 되었다 합니다 3D 공간에 대 한 관심의 영역입니다. 간단히, chromatin의 기본 단백질 DNA 상호 작용, 제한 효소로 죽 습 및 상호 작용 loci (그림 1)의 생물학 관련 "엉 킴"을 잡으려고 희석 조건 이후 출혈을 보존 하기 위해 고정 됩니다. 따라서 두 번째 제한 효소로 DNA 분열을 추가 사용할 수 떠나는 단백질을 제거 하는 크로스 링크 반전 한다. 마지막 결 찰 상호 작용 loci의 작은 동그라미를 생성합니다. 관심사의 순서에 뇌관 다음 다운스트림 다음 세대 시퀀싱 다음 circularized 조각에서 알 수 없는 시퀀스의 증폭된 라이브러리를 생성 하는 데 사용 됩니다.
샘플 준비에 초점을 맞추고, 여기, 프로토콜은 기존 4 C-seq 방법8,9,10,,1112에 두 가지 주요 변경 합니다. 첫째, 정량 기반 메서드를 사용 하 여 실험적으로 결정 하 증폭의 최적의 수 4 C-seq 라이브러리 준비 단계 주기 따라서 PCR 바이어스 라이브러리-확대에서 형태소 분석에 대 한 가능성을 줄입니다. 둘째, 그것은 시퀀싱 악기에 의해 정확한 자료 호출을 방해 하 고, 따라서, 각 읽기에 독특한, 유익한 시퀀스를 극대화 하는 알려진된 "미끼" 시퀀스의 균일성을 줄이기 위해 노력에서 한 추가 제한 다이제스트 단계를 사용 합니다. 다른 프로토콜은 다른 미끼 시퀀스 또는 금지 사이트, 다른 실험실에 의해 달성 되지 않을 수 있습니다 실험의 많은 (12-15)8 4 C-seq 라이브러리를 풀링 하 여이 문제를 포위. 여기에 제시 된 수정 실험, 수가 적은 샘플, 또는 색인 풀링된 단일 차선으로 복제를 허용 합니다.

<table><tbody><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>CviQI</td><td>NEB</td><td>R0639S</td><td></td></tr><tr><td>DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>리더 설계</td></tr><tr><td>50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드, 메탄올 무함유</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>너트</td><td>VWR</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>JT Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 마이크로 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 산 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 히트 블록</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris-HCl</td><td>품질 생물학적</td><td>351-048-101</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>20 mg / mL 글리코겐</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 사이클러</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 플레이트</td><td>Thermo Fisher</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>PCR 스트립 튜브</td><td>MidSci</td><td>AVSST-FL</td><td></td></tr><tr><td>1 M 염화 마그네슘</td><td>품질 생물학</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레오톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 삼인산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>확장 긴 템플릿 PCR 시스템</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 믹스</td><td>열 Fisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>ROX</td><td>BioRad</td><td>172-5858</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Lucigen</td><td>ER0720</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td><td>Promega</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td></td></tr><tr><td>UltraSieve Agarose</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70054</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick 겔 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 id (4 c-seq)를 캡처

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

주어진된 대상 유전자에 대 한 규제 요소 식별 규제 요소 대상 유전자의 위치 및 효과 크기 가변성 때문는 상당한 기술에 도전 포즈. 존재의 bioinformatic 예측 및 보존된 전사 인자 바인딩 사이트를 사용 하 여 활성화 된 유전자 발현과 관련 된 근 후 성적인 수정의 기능 일부 진행이 했다. Chromatin 구조 캡처 연구 실제 chromatin 연락처 시퀀스 사이 고 심지어는 전체 게놈 안에서 발견 하는 우리의 능력을 혁명 있다. 원형 chromatin 구조 캡처 다음-세대 시퀀싱 (4 C-seq)과 함께 특히, 설계 관심 (관점)의 특정된 시퀀스에 대 한 가능한 모든 물리적 chromatin 상호 작용 발견 대상 유전자 또는 규제 등 증강입니다. 현재 4 C-seq 전략 직접 관점 내에서 시퀀스 하지만 수많은 요구와 동시에 유니폼의 기술 문제를 피하기 위해 시퀀스 수를 다양 한 관점 다음 세대 시퀀싱 플랫폼 호출 (영상) 기지. 실험의이 볼륨 많은 실험실에 대 한 실용적 되지 않을 수 있습니다. 여기, 우리는 추가 금지 효소 다이제스트 및 가능성을 완화 하 고 다양 한 시퀀스 읽기의 큰 캡처를 용이 하 게 설계 된 정량 기반 증폭 단계 통합 4 C-seq 프로토콜 수정된 접근 보고 PCR 편견, 각각. 우리의 수정 4 C 방법은 의무가 chromatin 아키텍처를 평가 하기 위한 표준 분자 생물학 실험실입니다.

기본 인간 keratinocytes 2-3 폐기 신생아 속하고에서 고립 되었다, 풀, 그리고 KSFM 보충에 교양 30 µ g/mL와 소 뇌 하 수 체 추출 물 0.26 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자, 그리고 0.09 m m 칼슘 염화 물 (CaCl2 ) 37 ° c, 5% 이산화탄소. 셀 두 플라스 크로 분할 했다 그리고 한 플라스 크 확산에서 72 h. 107 셀 각 1.2 m m의 최종 농도에 CaCl2 의 추가 의해 분화 되었다 인구 1% 고정 했다 keratinocyte 분화 실 온에서 10 분에 대 한 포름알데히드입니다. 별도로, K562 세포 보충 37 ° C, 5% 이산화탄소에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 RPMI에 성장 했다. 107 세포는 실 온에서 10 분 동안 1% 포름알데히드에 고정 했다.
<p class="jove_content" fo:keep-to...

유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

이 방법은 크로마티안 상호 작용의 역할과 같은 전사 조절 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심의 궤적에 대한 상호 작용의 상대적으로 편견 캡처를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 프로모터 증강 상호 작용에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 다른 유형의 크로마틴 상호 작용을 식별하기 위해 적용 될 수도 있습니다.일반적으로 이 메서드에 새로 사용되는 개인은 프로토콜에 대해 며칠이 걸리기 때문에 어려움을 겪고 있으며, 프라이머 설계에는 시행착오와 비정형 입문서 방향이 필요합니다. 선택의 세포에서 크로마틴 상호 작용을 보존하기 위해 1,000만 개의 세포당 PBS에 1%전자 현미경 등급 포름알데히드의 9.5 밀리리터를 추가하여 교차 연결합니다. 실온에서 10 분 동안 흔들면서 세포를 배양하십시오.반응 튜브를 얼음으로 옮기면 교차 연결 반응을 담금질하고 얼음 차가운 1 개의 어어 글리신을 0.125 어금니의 최종 농도에 추가하고 부드러운 반전으로 혼합하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 원심 분리 및 세척한 후, 0.5%SDS와 1개의 X 프로테아제 억제제로 5밀리머 EDTA의 125마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 10 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 배양.세포 리스가 완료되었는지 확인하려면 세포의 6 마이크로 리터와 현미경 슬라이드에 트라이팬 블루 6 마이크로 리터를 혼합하고 커버 슬립으로 덮습니다. 현미경으로 보면 용액 세포의 내부를 파란색으로 보고, 그리고 무언의 세포는 흰색으로 보입니다. 첫 번째 제한 소화를 위해 10X 제한 효소 완충제30마이크로리터와 20%트리톤 X-100의 27마이크로리터를 세포 현탁액에 추가하고 총 부피를 300 마이크로리터로 조절한다.15 마이크로리터 알리쿼트를 제거하고 섭씨 4도에 보관하여 소화되지 않은 컨트롤로 보관하십시오. 나머지 반응 혼합물에 200개의 제한 효소를 첨가한다. 900 RPM 교반을 가진 흔들리는 가열 블록에서 효소에 적합한 온도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 효소의 추가 200 단위를 추가하고 하룻밤이 배양을 계속. 15 마이크로리터 알리쿼트를 제거하고 섭씨 4도에 보관하여 소화 제어로 보관하십시오. 소화 효율을 결정하려면 소화되지 않고 소화되지 않은 각 컨트롤에 10 밀리머 트리스-HCl, pH 7.5의 82.5 마이크로리터를 추가합니다.단백질Ae K의 2.5 마이크로 리터를 추가하고 포름 알데히드 크로스 연결을 반전하기 위해 섭씨 65도에서 1 시간 동안 배양. 소화된 DNA를 분리하려면 페놀 클로로폼 100마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 잔류 단백질 오염을 제거하기 위해 몇 가지 빠른 반전으로 섞는다.16, 100 G의 원심분리기는 실온에서 5분 동안 제공됩니다. 원심 분리 후 수성 단계를 새로운 튜브로 옮긴다. 아세테이트 나트륨, 글리코겐, 100% 에탄올을 튜브에 넣고 반전으로 부드럽게 섞습니다.DNA를 침전시키기 위해 1 시간 동안 영하 80도에서 배양하십시오. 16, 100 G의 4도에서 20 분 동안 튜브원심분리하십시오. 상체를 제거한 다음 DNA 펠릿을 세척하기 위해 70%의 마이크로리터 500을 추가합니다.16, 100 G의 원심분리기는 실온에서 5분 동안 제공됩니다. 상류 공기를 제거 한 후 잔류 에탄올을 제거하기 위해 2 분 동안 실온에서 펠릿을 건조시키십시오. 50 마이크로리터 뉴클레아제 프리 워터에서 말린 펠릿을 다시 중단하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 QPCR에 의한 소화 효율을 결정한다.결찰을 준비하기 위해 65도에서 20분 동안 튜브를 배양하여 제한 효소를 가열하고 활성화합니다. 그런 다음 튜브의 내용을 50 밀리리터 원내 튜브로 전송하고 핵자유수, 10X 리게아제 완충제 및 T4 DNA 리갈아제를 첨가한다. 소용돌이에 의해 부드럽게 섞고, 하룻밤 사이에 섭씨 16도에서 배양하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 진행합니다.크로스 연결을 반대로하려면 단백질 AK의 15 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 65도에서 하룻밤 을 배양한다. 다음 날에는 RNase A의 마이크로리터 30기를 추가하고 섭씨 37도에서 45분만에 배양합니다. 크로마틴 절연을 계속하려면 페놀 클로로폼 7밀리리터를 추가하고 몇 가지 빠른 반전으로 섞습니다.3, 300 G의 실내 온도에서 15 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 원심분리 후 수성 상을 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고 핵아제 프리 워터, 3개의 어금니 나트륨 아세테이트, 글리코겐 및 100% 에탄올을 추가합니다. 내용내용을 혼합하고 1시간 동안 음수 섭씨 80도에서 배양합니다.인큐베이션 후, 20 분 동안 섭씨 4도에서 3, 900 G의 원심 분리. 상체를 제거한 다음 펠릿을 얼음 냉기 70%에탄올 10밀리리터로 씻으십시오. 3, 300 G의 원심분리기는 섭씨 4도에서 15분 동안.상체를 제거하고 실온에서 펠릿을 짧게 건조시다. 펠릿을 150 마이크로리터의 10 밀리머 트리-HCl pH 7.5에서 섭씨 37도에서 녹입니다. 음의 섭씨 20도에 저장하거나 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 두 번째 제한 소화, 결찰 및 DNA 정화를 계속합니다.DNA 정화에 따라, 역 PCR 프라이머와 사이버 및 ROX 염료를 사용하여 QPCR을 수행하여 텍스트에 설명된 바와 같이 알 수 없는 상호 작용 서열의 반전 PCR 증폭을 위한 증폭 주기의 수를 결정한다. 시퀀싱을 위해 DNA를 준비하려면 역 PCR의 정제 된 제품의 마이크로그램과 제한 효소 모니터를 소화하여 세 번째 제한 소화로 미끼 서열을 다듬습니다. 소화된 제한 효소 또는 RE 모니터를 예상 된 단편에 적합한 농도의 아가로즈 젤에 실행합니다.일단 소화 효율이 젤 전기포고에 의해 결정되면, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 역PCR 제품 정제 및 시퀀싱 라이브러리의 준비를 계속한다. 3차 제한 소화는 원형 염색체 확인 캡처의 차세대 시퀀싱을 위한 이 프로토콜에서 중요합니다. 이 소화는 크로마티안 어트랙션의 식별을 용이하게 할 수있는 미끼 시퀀스를 잘라.소화된 RE 모니터의 아가로즈 겔 전기포고는 역PCR 제품의 소화를 병렬로 나타내었다. 완료 된 4 개의 C 시퀀싱 읽기는 BWA 소프트웨어 패키지를 사용하여 인간 참조 게놈 hg38에 손질및 매핑되었습니다. 읽기의 대부분은 예상대로 힌디어III 사이트에 인접한 제한 사이트 힌디어III 또는 CviQ1I 사이트에 정렬합니다.이 절차를 시도하는 동안 세포가 lysed되고 염색체가 충분히 소화되는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 크로마티닌 면역 침전 또는 CHIP과 같은 다른 방법은 크로마틴 상호 작용에 관련된 전사 인자를 식별하는 것과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 크로마틴 분야의 연구원들이 물리적 규제 네트워크를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 논문은 염색체 외 원형 DNA(eccDNA)를 정제하기 위한 Circle-Seq라는 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법에는 컬럼 정제, 남아 있는 선형 염색체 DNA 제거, 롤링 서클 증폭 및 고처리량 염기서열분석이 포함됩니다. Circle-Seq는 진핵생물 eccDNA의 게놈 규모 스크리닝 및 게놈 불안정성 및 복제 수 변이 연구에 적용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

이 프로토콜 여러 모델 생물에서 녹음의 품질을 모니터링 하는 새로운 도구와 연구를 제공 합니다.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

CRISPR/sgRNA 라이브러리 질의 단백질 코딩 유전자에 적용 되었습니다. 그러나, 유전자 규칙에서 CTCF 경계의 기능을 밝히기 위해 sgRNA 라이브러리의 미개척 남아 있습니다. 여기, 우리는 HOX loci 특정 sgRNA 라이브러리 CTCF 경계 HOX loci의 기능을 명료 하 게 설명 합니다.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계

원형 RNA (circRNAs)는 단백질 사이 전사 규칙 그리고 중재 상호 작용에 있는 역할을 할 수 있는 비 코딩 RNA입니다. circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 구성을 위한 상이한 파라미터의 평가에 이어, RNase R 전처리와 함께 좌초된 총 RNA 라이브러리 제제를 활용한 프로토콜이 컴파일되고 여기에 제시된다.

RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

Hi-C 3.0은 포름알데히드 및 디숙신이미딜글루타레이트 가교결합제를 DpnII 및 DdeI 제한 효소의 칵테일과 결합하여 신호 대 잡음비와 염색질 상호 작용 감지의 분해능을 높이는 개선된 Hi-C 프로토콜입니다.

길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

여기에서는 학부 참여 및 학습에 중점을 두고 염색체 형태 캡처(3C) 기술의 적응을 자세히 제시합니다.

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.

희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations

CRISPR과 같은 기술의 주요 장벽은 중요한 유전자를 파괴할 수 있는 off-target 이벤트입니다. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing'(CIRCLE-seq)은 의도하지 않은 절단 부위를 식별하기 위해 고안된 기술입니다. 이 방법은 CRISPR-Cas9의 게놈 전체 활성을 높은 감도로 편향 없이 매핑합니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

배우세요 수정된 4C-seq 프로토콜을 사용하여 PCR 편향을 최소화하고 크로마틴 상호작용을 정확하게 포착하는 방법. 이 기법은 전사 조절 및 프로모터-인핸서 상호작용 연구에 필수적인 도구입니다.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

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