톨루이 블루 주변 신경 형태학의 평가 대 한 수 지에 포함 된 섹션의 얼룩

이 방법은 말초 신경의 형태 측정법이 무엇인지, 얼마나 많은 축삭이 존재하는지, 수초화 상태는 무엇인지, 섬유화 조직이 존재하는지와 같은 말초 신경 손상 및 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 기능을 고해상도로 시각화할 수 있다는 것입니다. 마취된 쥐를 해부 매트 위에 엎드린 자세로 놓는 것으로 시작합니다.

1-2%이소플루란으로 마취를 유지하기 위해 콧방울을 놓습니다. 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 동물에게 페달 인출 및 뒷발의 손바닥 반사 신경을 테스트합니다. 적절한 마취 깊이가 이루어지면 뒷다리의 털을 면도하고 면도 부위를 70% 에탄올로 살균합니다.

절개의 적절한 위치를 확인하기 위해 대퇴골을 촉진합니다. 대퇴골은 좌골 신경의 가장 접근하기 쉬운 부분의 근위부에 위치합니다. 무릎에서 대퇴근까지 뒷다리를 따라 피부를 2-3cm 절개한 후 이두박근과 대둔근 사이의 평면을 찾습니다.

그런 다음 현저절부 가위를 사용하여 기저에 있는 근막을 분리하고 기저에 있는 좌골 신경을 2-3cm 노출시킵니다. 견인기를 사용하여 두 근육 사이의 간격을 넓힙니다. 가는 집게와 홍채 가위를 사용하여 신경을 주위의 결합 조직으로부터 조심스럽게 분리하되, 신경을 압박하거나 절단하지 않도록 세심한 주의를 기울인다.

다음으로, 트럼프의 고정제로 노출된 신경을 덮고 10분 동안 그대로 두십시오. 필요한 경우 뒷다리 아래에 거즈를 놓아 각도를 개선하여 구멍에 더 많은 고정제를 추가할 수 있습니다. 10분 후에 정착액을 제거하고 이 단계를 두 번 더 반복합니다.

해부 현미경으로 미세한 해부 가위를 사용하여 양쪽의 좌골 신경을 자르고 신경이 늘어나거나 끼이지 않도록 합니다. 즉시 Trump's Fixative가 들어있는 15mL 튜브에 신경 절편을 넣고 일주일 동안 섭씨 4도에서 고정하고 48시간마다 고정제를 교체합니다. 고정 후 신경에 남아 있는 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거하고 날카로운 메스를 사용하여 신경을 약 5mm 길이의 부분으로 자릅니다.

신경 분절은 서로 다른 표지된 관으로 분리될 수 있습니다. 갓 조리한 2%오스뮴 테트록사이드에 신경 분절을 2시간 동안 담급니다. 에폭시 임베딩 키트를 사용하여 최종 임베딩 혼합물을 준비합니다.

에폭시 매립 매체를 DDSA 용액과 혼합하고 에폭시 매립 매체를 NMA 용액과 혼합합니다. 두 용액을 자석 교반기로 최소 20분 동안 혼합합니다. 사용 직전에 가속기 DPM을 솔루션 B에 결합한 다음 가속기의 최종 비율이 전체 볼륨의 1포인트 5에서 2% 사이가 되도록 솔루션 A와 결합합니다.

신경 분절을 1점 5밀리리터 튜브로 옮기고 PBS로 세척한 후 PBS를 아세톤과 증류수 농도를 각각 10분 동안 증가시킨 다음 100% 아세톤으로 각각 10분 동안 3회 교체하여 탈수 과정을 시작합니다. 한 가지 중요한 단계는 조직 탈수입니다. 물과 수지는 상호 작용하지 않으므로 조직에 남아 있는 물은 수지에 의해 침투되지 않아 조직학적 특성이 없는 부분에 구멍을 남깁니다.

수지 침투의 경우 먼저 신경 분절을 임베딩 혼합물과 100% 아세톤의 일대일 혼합물에 30분 동안 배치합니다. 30분 후, 30분 동안 세그먼트를 임베딩 혼합물과 100% 아세톤의 2:1 혼합물로 옮깁니다. 신경 침포물을 실리콘 고무 임베딩 몰드에 놓고 신경 위에 수지를 부드럽게 첨가하여 기포를 피하면서 전체 신경 세그먼트를 덮도록 합니다.

수지를 섭씨 60도에서 하룻밤 동안 중합하도록 두십시오. 신경이 박혀 있는 수지 블록을 사다리꼴 면이 위를 향하도록 하여 초박 절편기 홀더에 넣습니다. 초박 절편기의 내시경을 통해 보는 동안 외날 칼날을 사용하여 신경 조직을 둘러싼 과도한 수지를 다듬습니다.

사산화오스뮴에 의해 짙게 염색되어 알아볼 수 있는 신경 분절의 세로 표면을 관통하지 마십시오. 초박 절편기에 일반 유리 칼을 사용하여 신경의 균일한 단면 표면을 노출시키기 위해 여러 단면을 만듭니다. 이 작업이 완료되면 실온에서 증류수를 채운 보트와 함께 유리 칼로 전환하고 초박 절기를 1-2미크론으로 조정하여 얇은 부분을 자릅니다.

금속 루프를 사용하여 유리 나이프 보트에서 떠 있는 얇은 부분을 유리 슬라이드의 탈이온수 한 방울로 옮깁니다. 또 다른 중요한 단계는 유리 나이프에서 슬라이드로 얇은 부분을 옮기는 동안입니다. 이 얇은 부분은 매우 약하여 부러지거나 접힐 수 있습니다.

단면화 후에는 슬라이드를 화염 위로 여러 번 통과시켜 슬라이드의 부분을 건조시키고 섹션이 과열되지 않도록 합니다. 슬라이드는 톨루이딘 블루로 즉시 염색되지 않는 경우 며칠 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 신경 부분을 염색하려면 플라스틱 피펫 또는 마이크로 피펫을 사용하여 신경 섹션 상단에 톨루이딘 블루 용액 한 방울을 추가합니다.

20-30초 후, 슬라이드를 탈이온수 병에 부드럽게 담그고 단면이 깨끗해질 때까지 3-4회 반복하여 초과분의 모든 톨루이딘 블루 용액을 헹굽니다. 슬라이드를 섭씨 60도에서 최소 15분 동안 건조하거나 실온에서 밤새 건조시킵니다. 건조 후 일반 장착 매체를 추가하고 커버 슬립으로 섹션을 덮습니다.

마지막으로, 광학 현미경으로 장착된 부분을 검사합니다. g-ratio를 계산하기 위해 상세 이미지에는 100X oil immersion lens를 사용하는 것이 좋습니다. 수지 배지에 삽입되고 톨루이딘 블루로 염색된 좌골 신경 절편은 10X에서 20X, 40X 및 60X로 배율이 증가할 때 최적의 해상도로 선명한 이미지를 보여주었습니다.

이 방법은 신경 구조를 보존하고 고해상도, 고배율 이미징을 가능하게 하여 B로 표시된 화살표로 표시된 축삭 직경의 비율인 g-ratio와 같은 여러 매개변수의 측정을 용이하게 합니다. A로 표시된 총 섬유 직경에 대한 다양한 요인으로 인해 신경의 부적절한 취급으로 인해 단면에 균열이 있는 것을 포함하여 최적의 말초 신경 절편이 아닌 것으로 이어질 수 있습니다. 불충분한 탈수로 인해 섹션에 구멍이 발생할 수도 있습니다. 절차에서 발생할 수 있는 또 다른 오류는 단면을 접는 것인데, 이는 단면을 유리 슬라이드로 이동하기 위해 접종 루프를 사용하여 해결할 수 있습니다.

이 절차에 따라 축삭 정량화와 같은 다른 방법을 수행하여 재생 신경의 재생 정도가 얼마인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경 형태 측정을 평가하기 위해 1-2미크론 말초 신경 절편을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.