Name: 톨루이 블루 주변 신경 형태학의 평가 대 한 수 지에 포함 된 섹션의 얼룩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 톨루이딘 블루 염색을 이용한 1-2µm 수지 단면에서 말초신경 형태학을 평가하는 방법을. 쥐 좌골신경을 사용하여 축삭 수, 수초화 상태, 섬유화 조직을 고해상도로 분석할 수 있습니다.

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저자는 thankthe 젠킨스 현미경 시설 그들의 도움과 멤버 Bushman 실험실의 켈리 Roballo, 헤이든 진정한, Wupu Osimanjiang, Subash Dhunghana, 동물 보호에 대 한 와이오밍 대학에서 하 고 싶습니다. 이 게시가 되었습니다 기관 개발 상 수상 (IDeA는)에 의해 국립 과학 연구소에서의 일반 의료의 부여 # 2P20GM103432에서 건강의 국가 학회.

성인 Sprague Dawley 쥐가이 프로젝트에 사용 된 및 모든 절차 와이오밍 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1. 수술 및 생체 내 신경 고정
참고: 모든 자료와 장비가이 프로토콜에 대 한 공급 업체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
참고: vivo에서 신경 고정 조직을 보존 하 고 죽음의 시간과 신경의 컬렉션 간에 발생할 수 있는 구조적 성능 저하를 줄일 데 사용 됩니다. 조직의 고정 vivo에서 종종이 전조의 관류는 조직학, 신경 조직의 준비에 대 한 표준 연습 이다. 배치 하 고 원래의 장소에 고정을 위한 허용 주변 신경의 크기. 우리가 수집 및 조직 저하의 가능성으로 인해 안락사 후 조직의 정착을 권장 하지 않습니다.
<ol><li>2-3 %isoflurane 유도 챔버에 그것을 배치 하 여 전신 마 취에 대 한 쥐를 준비 다음 마 취 쥐 해 부 매트 위에 발생 하기 쉬운 위치에 놓고 isoflurane 마 취 코 콘을 통해의 1-2%에서 유지 합니다. 마 취의 적절 한 깊이 보장 하기 위해, 뒷 발에 페달 철수에 대 한 동물을 테스트 하 고는 법 눈으로 눈에서 종을 반사의 부재에 대 한 확인 합니다. 참고: 마 취 제의 복 주입 흡입된 isoflurane에 일반적으로 사용 되 대안 이다.</li>
	<li>좌 골 신경, 노출 하는 hind limb(s)의 머리를 면도 하 고 70% 에탄올과 면도 영역을 청소. 메스와가 위, 큰 trochanter까지 무릎에서 뒷 다리 따라 피부에 2-3cm 절 개를 하 게 어디 절 개의 적절 한 위치를 보장 하기 위해 살 균 메스를 사용 하 여 대 퇴 골의 촉진. 대 퇴 골은 그냥 근 좌 골 신경의 가장 접근 가능한 세그먼트에 위치 합니다. 비록이 아닌 생존 수술, 무 균 기법을 유지 합니다.</li>
	<li>피부 절 개 후, 팔 뚝 femoris 근육과 대 둔 근 근육 사이 비행기 찾아서 서가 위를 사용 하 여 기본 근 막 분리 및 밑줄 좌 골 신경의 2-3 cm를 노출 합니다. 좌 골 신경의 명확한 섹션 노출, 두 근육 (그림 1A) 사이의 격차를 확대 하는 견인을 사용 합니다. 좋은 집게와 아이리스가 위, 결합 조직, 압축 또는 신경을 잘라 큰 돌 주변에서 신경 분리 신중 하 게.</li>
	<li>충분 한 트럼프의 정착 액 (4% 포름알데히드, NaH2PO4·의 1.16 g 1 x PBS (인산 염 버퍼 식 염 수)에서 1%도 추가 100 mL 당 H2O) 포함 하는 신경을 커버 하 고 10 분 동안 앉게 하 노출된 신경 구멍으로. 더 많은 정착 액 캐비티에 추가할 수 있도록 각도 개선 하기 위해 필요한 장소 거 즈는 뒷 다리 아래 다리 경우. 10 분 후에 정착 액을 제거 하 고 두 번 이상이 단계를 반복.</li>
	<li>해 현미경을 사용 하 여 정밀한 해 부가 위, 스트레칭 또는 좌 골 신경 핀치를 하지를 사용 하 여 양쪽에서 신경 자르고 즉시 신경 섹션 변경 1 주일에 4 ° C에서 트럼프의 정착 제를 포함 하는 15 mL 튜브에 넣고는 정착 액 모든 48 h입니다.</li>
	<li>두지 마십시오 동물 무인 수술의 일부. 신경의 제거 후, 마 취하에 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사.</li>
</ol>2. 오스뮴 Tetroxide 치료 및 수 지 포함
<ol><li>고정 게시, 신중 하 게 모든 나머지 지방과 결합 조직 신경에서 제거 하 고 날카로운 메스를 사용 하 여 세그먼트 길이 (신경 세그먼트 구분 될 수 있으며 다른 튜브에 표시)에 약 5 mm 신경을 잘라. 신선한 2% 오스뮴 tetroxide 트럼프의 통 솔루션에 희석을 준비 하 고 유리 튜브에 계속. 시간이 짧은 기간에 대 한 플라스틱 튜브에 있을 수 있는 2 시간에 대 한 2% 오스뮴 tetroxide 신경 세그먼트를 담가. 참고: 일부 플라스틱 튜브 오스뮴 tetroxide 플라스틱 튜브에의 장기간된 보관 권장 하지 않습니다 그래서 솔루션, 어둡게 일으키는 오스뮴 tetroxide와 반응.</li>
	<li>매체 키트를 포함 하는 에폭시를 사용 하 여 최종 포함 수식을 준비:<ol>
<li>DDSA 솔루션 (dodecenylsuccinic 무수 물, 혼합물 A) 매체를 포함 하는 에폭시를 혼합 하 고 혼합 NMA 솔루션 (methylnadic 무수 물, 혼합물 B) 매체를 포함 하는 에폭시. A와 B는 자력으로 교 반에 의해 적어도 20 분을 섞어 두 혼합물을 하자.</li>
		<li>사용 직전 혼합 A와 B를 혼합 하 고 추가 가속기 DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) 혼합물의 총 볼륨의 1.5 ~ 2.0%의 비율에. Note DPM 30 솔루션 어두운 색상 및 취 성 되는 블록을 방지 하기 위해 정확 하 게 측정 되어야 한다. 모든 수 지 화학 물질이 독성; 피부 접촉 또는 흡입을 방지 하기 위해 여분의 주의 분리 했습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL 튜브를 사용 하 여 PBS 가진 신경 세그먼트를 세척 하 고 다른 아세톤/증 류 물 구절에 신경 세그먼트를 배치 하 여 탈수 과정을 시작: 30%, 60%, 90%, 10 분 각, 다음 3 시간 10 분 대 한 100% 아세톤에 농도.  Note는 에탄올 아세톤 대신 사용 될 수 있다.</li>
	<li>수 지 침투에 대 한 배치 최종 포함 혼합물의 1 개 부품의 혼합물에서 신경 세그먼트 및 최종 포함 혼합물의 2 개 부품의 혼합물 및 30 분 1 부분 100% 아세톤에서 30 분, 1 부분 100% 아세톤 및 장소 신경 세그먼트는 마지막에 30 분을 위한 혼합물을 포함 하는 마지막으로.</li>
	<li>실리콘 고무 금형 포함으로 신경 세그먼트를 넣어 (우리 x 7 mm 깊이 x 71 mm 폭 106 m m 길이 사용 하는, 크기 11 m m 길이 6 m m 폭 3 mm 깊이 x x 차단). 부드럽게 전체 신경 세그먼트를 커버 하 고 기포를 만들기 방지 하는 신경 위에 수 지를 추가 합니다. 60 ° C에서 하룻밤 유해를 수 지로 신경 세그먼트를 포함 하는 금형을 둡니다.</li>
</ol>3. Ultramicrotome에 의해 단면
<ol><li>유리 칼은 유리 칼 메이커 (그림 1B)를 사용 하 여 준비 하 고 보트 (그림 1C), 증 류 된 물에 떠 있는 신경 섹션을 수집 하는 데 사용 되는 유리 칼.</li>
	<li>포함 된 수 지 신경 블록을 사다리꼴 면이 위로 향하도록 ultramicrotome 홀더에 넣으십시오. 주변 신경 조직을 어떤 과잉 수 지 트림 ultramicrotome 범위를 사용 하 고 블록 사다리꼴 모양 얼굴 그리고 면도날 같은 단일 깨끗 블레이드를 사용 하 여 가능한 신경의 경도 표면에 가까이. 오스뮴 tetroxide에 의해 그것의 어두운 얼룩에 의해 인식할 수 있는 신경 세그먼트의 경도 표면을 침투 하지 않습니다. 참고: 과잉 수 지의 조정 구분 될 블레이드 성능 및 후속 단계에 절단을 개선 하는 수 지의 영역을 줄이는 것입니다.</li>
	<li>ultramicrotome를 사용 하 여 여러 횡단면 일반 유리 칼을 사용 하 여 신경 직물의 일정 한 횡단면 표면 노출 하기에 충분 한 확인 합니다. 이 완료 되 면, 그의 보트는 상 온에서 증류수 가득 유리 칼으로 전환 하 고 얇은 섹션을 1-2 μ m ultramicrotome 조정 합니다.</li>
	<li>금속 루프 (그림 1D)를 사용 하 여 유리 슬라이드에 유리 칼 보트에서 이온된 물 한 방울 떠 있는 얇은 섹션을 전송. 섹션을 과열 하지 않도록 하는 몇 초 동안 화 염에 여러 번 전달 하 여 섹션을 포함 하는 슬라이드를 건조. 톨루이와 즉시 건조 섹션 블루 얼룩 또는 얼룩 전에 몇 일 동안 실내 온도에 저장. 참고: 섹션 수 있습니다 또한 건조 15 분 동안 60 ° C에서 따뜻한 접시를 사용 하 여. 느린 건조 과정 섹션 부드러운 게.</li>
</ol>4. 톨루이 블루 얼룩
<ol><li>2g의 나트륨 붕 산 염 이온을 제거 된 물 100 mL에 용 해 하 여 톨루이 블루의 1% 솔루션 준비 다음 톨루이 블루의 1 g을 추가 하 고 해산 때까지 휘저어. 필터 종이 사용 하 여 솔루션을 필터링 (기 공 크기: 11 µ m) 최대 2 주 동안 실내 온도에 불투명 한 병에 솔루션을 계속 하 고.</li>
	<li>플라스틱 피 펫 또는 마이크로 pipettor 사용 하, 신경 섹션 상단 톨루이 블루 솔루션의 한 방울을 추가 하 고 20-30 s에 대 한 둡니다.</li>
	<li>부드럽게 찍기 이온된 물 항아리에 슬라이드에 의해 초과 모든 톨루이 블루 솔루션에서 헹 구 고 섹션 분명 때까지 3-4 회 반복. 슬라이드에 15 분 또는 60 ° C에서 하룻밤 실 온에서 건조 하 고 섹션 coverslip 일반 설치 매체를 사용 하 여 커버. 탑재 된 슬라이드를 즉시 검사 하거나 상 온에서 저장 합니다.</li>
	<li>가벼운 현미경 검사. 100 X 기름 침수 렌즈 g-비율을 계산 하는 데 사용 하는 자세한 이미지에 대 한 것이 좋습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 관심 없음 충돌 선언 합니다.

주변 신경 손상 및 재생의 형태학 적 구조 시험 연구13의 빈번한 주제는. 이 프로토콜에서 우리 조직학 데이터 quantifications 쥐 좌 골 신경 조직 수 지 블록에 포함 된 및 톨루이 파랑 스테인드를 사용 하 여에 대 한 높은 품질의 이미지를 얻을 수 있는 단계를 설명 합니다. 이 기술은 신경 형태학 축 삭의 수, myelination, infiltrative 거리 조직의 존재와 건강 신경의 정도 측정 하 여 신경 재생 수 정량의 이미지를 제공 합니다. 이미지 표시 단면 손상 되지 않은 신경의 처리와 샘플, 동일한 단계 및 재료 부상된 신경에 적용 되는 신경 도관 또는 조직 이식, 재생성 제공 조직의 그 고정은 적절 한20, 21.
프로토콜의 모든 단계는 필수, 하는 동안 이러한 단계 중 일부를 가난한...

주변 신경 모터 또는 감각 축 삭1대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 의료 장애로 인 한 말 초 신경 결함 외상 중요 한 공중 위생 관심사를 대표 하 고 큰 경제적 파급 효과2,3. 주변 신경 상해의 결과 평가 하 고 신경 재생을 이해에 있는 전진에도 불구 하 고 전통적인 방법 신경 조직학 등 기법을 얼룩이 지는 질적 및 양적 평가 신경 건강에 필수적인 도구 으로 동물 모델 또는 삭제 인간의 조직에 터미널 결과 측정. 이것은 종종 morphometry 기능 신경 재생 않았거나 발생 하지 않은 이유를 밝힐 수 있다 주변 신경 기능의 electrophysiological 측정와 결합 됩니다.
톨루이 블루 이미징 myelinated 신경 섬유, 높은 품질을 제공 하는 전문적인 방법 포함 수 지 주변 신경 반 얇은 섹션의 얼룩이 지 고 신경 구조4,5,6의 상세한 이미지를 지우기 . 톨루이 블루 acidophilic metachromatic 얼룩, 18567, 윌리엄 헨리 Perkin에 의해 발견 이며 여러 의료 응용 프로그램8에서 사용 되었습니다. 톨루이 블루 스테인드 주변 신경 섹션 수 지 포함 신경 세그먼트에서 얻은 신경 구조의 명확한 시각화 수 있습니다. Myelin 칼 집 구조 시각화 오스뮴 tetroxide 후 고정4,9를 사용 하 여 향상 될 수 있습니다. 오스뮴 tetroxide은 독성 산화 제와 지질 통 에이전트 지질에 이중 결합 상호 작용 starkly 정의 된 지질이 풍부한 myelin 칼 집10인. 그러나, 오스뮴 tetroxide 독성, 비싼, 더 이상 외피 신경 세그먼트의 필요 이며 항상 사용 되지 않습니다.
주변 신경 형태학;의 시각화에 대 한 처리 및 얼룩의 대체 방법은 개발 되었다 파라핀, 극저온 단면, 에폭시 수 지에 포함 된 신경 단면 다음 톨루이 파랑 얼룩 또는 phenylenediamine 솔루션 주변 신경 재생 11,12의 형태학 적 변화를 측정 하는 데 사용 되었습니다. . 이러한 각 메서드는 그들의 이점 및 수율 필수 데이터 축 삭, 수 초 두께, 축 삭 직경 및 myelinated 섬유 직경 (g 비율) 11,,1314,15 축 삭 직경의 수에 .
수 지 포함이 프로토콜의 기본 구분은 그것 신경의 조직학 품질을 유지 하면서 1-2 μ m 두께 횡단면 때문에 수 지의 경도 얻기 용이 합니다. 이러한 얇은 섹션 포함, 파라핀에서 얻은 4-5 μ m 두께 섹션 반대로 주변 신경 축 삭 myelination, g-비율, 수 없는 등의 보다 정확한 정량화에 대 한 높은 해상도 섹션 제공 두꺼운 섹션16에서 얻은. 극저온 단면 1-2 µ m 섹션을 얻기 위해 사용할 수 있는, 그것은 우리의 경험 그것은 수많은 큰 균열 없이 섹션을 얻기 위해 더 어려운 되었습니다. 같은 금이 섹션 축 삭의 수 및 myelination의 측면의 부정확 한 계산을 발생할 수 있습니다.
톨루이 블루17얼룩, 뿐만 아니라 방법18 과 Masson의 trichrome 얼룩4 얼룩은 또한 신경 축 삭 표시를 사용할 수 있습니다. 그러나 반면 톨루이 블루 얼룩 지우기 myelin 칼 집 이미지 그리고 쉽게 중 되며 오신 또는 Masson의 trichrome 보였다 희미 한 myelin 칼 집 및 인식할 수 없는 구조, 스테인드 수 지 쥐 중간 신경 섹션의 포함을 사용 하 여 정량된4수 있습니다. 몇 가지 한계에도 불구 하 고 톨루이 블루 얼룩 포함 된 수 지의 주변 신경 신경 형태학의 고해상도 이미지는 필요한 경우 사용할 수 있는 유용한 기술입니다.
수 지를 포함에 대 한 주요 단점은 그것은 시간이 많이 걸리는 이며 파라핀 및 냉동된 임베디드 섹션 기술에 비해 항 원 복구의 어려움으로 인해 같은 조직의 immunostaining에 대 한 허용 하지 않습니다. 따라서, 일반적으로 수 지-톨루이 블루 얼룩에 대 한 포함을 통해 처리 되는 immunostaining에 대 한 동일한 조직 활용 수 아니다. 비록 하지 immunohistochemistry 바란다면 여기, 사용 수 지에 포함 된 섹션, 글리콜 메타 크 릴 산 수 지를 포함의 사용 허용 immunohistochemistry 조직 섹션에서 수행할 수 있지만 그것은 상대적으로 비싼19. 이 고정 후 직접 별도 세그먼트, 수 지를 포함에 대 한 일부 및 immunostaining에 대 한 다른 사람으로 말 초 신경 절단 하 여 다소 완화 될 수 있습니다.
톨루이 블루 수 지 얼룩이 지기의 과정으로 가장 histopathological 분석, 나눌 수 있습니다 5 단계, 고정, 탈수를 포함 하 여, 포함, 단면, 그리고20얼룩으로 주변 신경, 임베디드. 우리 하고자 여기 톨루이 얻으려고 블루 높은 품질의 이미지와 함께 포함 된 쥐 좌 골 신경 섹션 스테인드 수 지를 사용 하기 위한 프로토콜 및 실용적인 지침을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충액 식염수</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>톨루이딘 블루 O</td><td>시그마-알드리치</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 테트라 보레이트 데카 하이드레이트</td><td>Acros 유기물</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 임베딩 미디엄 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>트럼프의 고정액</td></tr><tr><td>pH 조정하기 위해 아세톤</td><td>피셔 화학 170942</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR 마이크로 슬라이드, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco 임베딩 캐스트</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>유리 나이프 메이커</td><td>RMC 제품</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>초박 절간</td><td>RMC Products,</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>, Falcon</td>, <td>ISO 9001</td><td></td></tr>, <tr><td>Eppendorf 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL 유리 바이알</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>수지 블록 트리밍용</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70944</td><td>얇은 수지 부분을 집는 데 사용됩니다</td></tr>. 울<tr><td>트라 글라스 나이프 스트립 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 와트 오븐</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>6350115</tr><tr><td>Whatman 여과지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 플라스틱 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td>Micro-surgical Kit</td><td>세계 정밀 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus 형광 현미경</td><td></td><td></td><td>듀얼 CCD 컬러 및 흑백 카메라, DP80</td></tr></tbody></table>

톨루이 블루 주변 신경 형태학의 평가 대 한 수 지에 포함 된 섹션의 얼룩

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

주변 신경와 모터 또는 감각 축 삭 대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 때문에 광범위 한 분포, 주변 신경은 자주 외상 또는 질병으로 인해 손상 됩니다. 방법 및 전략 주변 신경 손상 동물 모델, 기능 및 재생, 평가 하기 위해 개발 된 주변 신경의 morphometry 분석 되고있다 필수적인 터미널 결과 측정. 톨루이 블루 얼룩 신경의 크로스 섹션 포함 수 지 신경 섹션에서 얻은 주변 신경, 시각화 형태학 축 삭의 수와의 사용의 질적 및 양적 평가 대 한 재현 방법 myelination입니다. 이 기술은 다른 많은 조직학 방법, 것과 같이 어려울 수 있습니다 학습과 표준 작성 된 프로토콜을 사용 하 여 마스터. 이 간행물의 의도 톨루이 블루 videography 메서드를 사용 하 여 쥐에서 수확 하는 좌 골 신경의와 주변 신경의 얼룩에 대 한 서 면된 프로토콜을 강조 하 그러므로 이다. 이 프로토콜에서 우리 주변 신경 기정 vivo에서 그리고의 조직, 그리고 2% 오스뮴 tetroxide와 후 고정 컬렉션 설명 에폭시 수 지, 그리고 ultramicrotome 신경 1-2 μ m 두께 단면에서 신경의 포함. 신경 섹션 다음 유리 슬라이드에 전송 하 고 후 그들은 양적 및 질적 평가 톨루이 파란색으로 물. 예는 가장 일반적인 문제는 이러한 문제를 완화 하기 위해 단계 뿐만 아니라 표시 됩니다.

수 지 포함 섹션 톨루이와 파란 얼룩이 허용 정확한 조직학 데이터 quantifications 주변 신경. 절차의 개요는 (그림 2)에 표시 됩니다. 좌 골 신경 섹션 수 지 매체에 포함 된 하 고 최적의 해상도 (그림 3) 톨루이 블루 분명 보여준 이미지와 스테인드. 신경 손상이 발생할 수 있습니다 많은 변화 신경에 형태학 상 구조, 예를 들어 신경 섬유, 축 삭 직경에 myelin 칼 집 두께 변화. 이 방법은 총 섬유 직경 (g 비율; 축 삭 직경의 비율 등 여러 매개 변수 측정을 용이 하 게 그것의 자연적인 형태로 신경 구조를 유지할 수 있습니다. 그림 4)입니다. 다양 한 요인 때문에 신경의 부적절 한 처리 섹션에서 균열 (그림 5A)의 존재를 포함 한 최적의 주변 신경 섹...

여기에 우리가 현재 고 1-2 µ m 섹션 톨루이 블루 얼룩으로 주변 신경의 미세 구조를 시각화 하는 프로토콜

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

이 방법은 말초 신경의 형태 측정법이 무엇인지, 얼마나 많은 축삭이 존재하는지, 수초화 상태는 무엇인지, 섬유화 조직이 존재하는지와 같은 말초 신경 손상 및 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 기능을 고해상도로 시각화할 수 있다는 것입니다. 마취된 쥐를 해부 매트 위에 엎드린 자세로 놓는 것으로 시작합니다.1-2%이소플루란으로 마취를 유지하기 위해 콧방울을 놓습니다. 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 동물에게 페달 인출 및 뒷발의 손바닥 반사 신경을 테스트합니다. 적절한 마취 깊이가 이루어지면 뒷다리의 털을 면도하고 면도 부위를 70% 에탄올로 살균합니다.절개의 적절한 위치를 확인하기 위해 대퇴골을 촉진합니다. 대퇴골은 좌골 신경의 가장 접근하기 쉬운 부분의 근위부에 위치합니다. 무릎에서 대퇴근까지 뒷다리를 따라 피부를 2-3cm 절개한 후 이두박근과 대둔근 사이의 평면을 찾습니다.그런 다음 현저절부 가위를 사용하여 기저에 있는 근막을 분리하고 기저에 있는 좌골 신경을 2-3cm 노출시킵니다. 견인기를 사용하여 두 근육 사이의 간격을 넓힙니다. 가는 집게와 홍채 가위를 사용하여 신경을 주위의 결합 조직으로부터 조심스럽게 분리하되, 신경을 압박하거나 절단하지 않도록 세심한 주의를 기울인다.다음으로, 트럼프의 고정제로 노출된 신경을 덮고 10분 동안 그대로 두십시오. 필요한 경우 뒷다리 아래에 거즈를 놓아 각도를 개선하여 구멍에 더 많은 고정제를 추가할 수 있습니다. 10분 후에 정착액을 제거하고 이 단계를 두 번 더 반복합니다.해부 현미경으로 미세한 해부 가위를 사용하여 양쪽의 좌골 신경을 자르고 신경이 늘어나거나 끼이지 않도록 합니다. 즉시 Trump's Fixative가 들어있는 15mL 튜브에 신경 절편을 넣고 일주일 동안 섭씨 4도에서 고정하고 48시간마다 고정제를 교체합니다. 고정 후 신경에 남아 있는 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거하고 날카로운 메스를 사용하여 신경을 약 5mm 길이의 부분으로 자릅니다.신경 분절은 서로 다른 표지된 관으로 분리될 수 있습니다. 갓 조리한 2%오스뮴 테트록사이드에 신경 분절을 2시간 동안 담급니다. 에폭시 임베딩 키트를 사용하여 최종 임베딩 혼합물을 준비합니다.에폭시 매립 매체를 DDSA 용액과 혼합하고 에폭시 매립 매체를 NMA 용액과 혼합합니다. 두 용액을 자석 교반기로 최소 20분 동안 혼합합니다. 사용 직전에 가속기 DPM을 솔루션 B에 결합한 다음 가속기의 최종 비율이 전체 볼륨의 1포인트 5에서 2% 사이가 되도록 솔루션 A와 결합합니다.신경 분절을 1점 5밀리리터 튜브로 옮기고 PBS로 세척한 후 PBS를 아세톤과 증류수 농도를 각각 10분 동안 증가시킨 다음 100% 아세톤으로 각각 10분 동안 3회 교체하여 탈수 과정을 시작합니다. 한 가지 중요한 단계는 조직 탈수입니다. 물과 수지는 상호 작용하지 않으므로 조직에 남아 있는 물은 수지에 의해 침투되지 않아 조직학적 특성이 없는 부분에 구멍을 남깁니다.수지 침투의 경우 먼저 신경 분절을 임베딩 혼합물과 100% 아세톤의 일대일 혼합물에 30분 동안 배치합니다. 30분 후, 30분 동안 세그먼트를 임베딩 혼합물과 100% 아세톤의 2:1 혼합물로 옮깁니다. 신경 침포물을 실리콘 고무 임베딩 몰드에 놓고 신경 위에 수지를 부드럽게 첨가하여 기포를 피하면서 전체 신경 세그먼트를 덮도록 합니다.수지를 섭씨 60도에서 하룻밤 동안 중합하도록 두십시오. 신경이 박혀 있는 수지 블록을 사다리꼴 면이 위를 향하도록 하여 초박 절편기 홀더에 넣습니다. 초박 절편기의 내시경을 통해 보는 동안 외날 칼날을 사용하여 신경 조직을 둘러싼 과도한 수지를 다듬습니다.사산화오스뮴에 의해 짙게 염색되어 알아볼 수 있는 신경 분절의 세로 표면을 관통하지 마십시오. 초박 절편기에 일반 유리 칼을 사용하여 신경의 균일한 단면 표면을 노출시키기 위해 여러 단면을 만듭니다. 이 작업이 완료되면 실온에서 증류수를 채운 보트와 함께 유리 칼로 전환하고 초박 절기를 1-2미크론으로 조정하여 얇은 부분을 자릅니다.금속 루프를 사용하여 유리 나이프 보트에서 떠 있는 얇은 부분을 유리 슬라이드의 탈이온수 한 방울로 옮깁니다. 또 다른 중요한 단계는 유리 나이프에서 슬라이드로 얇은 부분을 옮기는 동안입니다. 이 얇은 부분은 매우 약하여 부러지거나 접힐 수 있습니다.단면화 후에는 슬라이드를 화염 위로 여러 번 통과시켜 슬라이드의 부분을 건조시키고 섹션이 과열되지 않도록 합니다. 슬라이드는 톨루이딘 블루로 즉시 염색되지 않는 경우 며칠 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 신경 부분을 염색하려면 플라스틱 피펫 또는 마이크로 피펫을 사용하여 신경 섹션 상단에 톨루이딘 블루 용액 한 방울을 추가합니다.20-30초 후, 슬라이드를 탈이온수 병에 부드럽게 담그고 단면이 깨끗해질 때까지 3-4회 반복하여 초과분의 모든 톨루이딘 블루 용액을 헹굽니다. 슬라이드를 섭씨 60도에서 최소 15분 동안 건조하거나 실온에서 밤새 건조시킵니다. 건조 후 일반 장착 매체를 추가하고 커버 슬립으로 섹션을 덮습니다.마지막으로, 광학 현미경으로 장착된 부분을 검사합니다. g-ratio를 계산하기 위해 상세 이미지에는 100X oil immersion lens를 사용하는 것이 좋습니다. 수지 배지에 삽입되고 톨루이딘 블루로 염색된 좌골 신경 절편은 10X에서 20X, 40X 및 60X로 배율이 증가할 때 최적의 해상도로 선명한 이미지를 보여주었습니다.이 방법은 신경 구조를 보존하고 고해상도, 고배율 이미징을 가능하게 하여 B로 표시된 화살표로 표시된 축삭 직경의 비율인 g-ratio와 같은 여러 매개변수의 측정을 용이하게 합니다. A로 표시된 총 섬유 직경에 대한 다양한 요인으로 인해 신경의 부적절한 취급으로 인해 단면에 균열이 있는 것을 포함하여 최적의 말초 신경 절편이 아닌 것으로 이어질 수 있습니다. 불충분한 탈수로 인해 섹션에 구멍이 발생할 수도 있습니다. 절차에서 발생할 수 있는 또 다른 오류는 단면을 접는 것인데, 이는 단면을 유리 슬라이드로 이동하기 위해 접종 루프를 사용하여 해결할 수 있습니다.이 절차에 따라 축삭 정량화와 같은 다른 방법을 수행하여 재생 신경의 재생 정도가 얼마인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경 형태 측정을 평가하기 위해 1-2미크론 말초 신경 절편을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 조직에서 데이터 수집을 최대화하기 위해 다양한 기술의 조합이 제공됩니다.

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

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피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

이 비디오는 톨루이딘 블루를 사용하여 수지가 내장된 오스뮴 사산화수소 처리된 쥐 말초 신경 절편의 염색 기술을 보여줍니다. 염색된 신경 부분은 말초 신경의 미세한 구조를 시각화하는 데 도움이 됩니다.

Toluidine Blue Staining of Peripheral Nerve Sections: A Techniques to Stain Myelinated Nerve Fibers For Peripheral Nerve Structure Visualization (말초 신경 절편의 톨루이딘 블루 염색: 말초 신경 구조 시각화를 위한 수초신경 섬유를 염색하는 기술)

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톨루이 블루 주변 신경 형태학의 평가 대 한 수 지에 포함 된 섹션의 얼룩

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