Name: 3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 신경세포와 성상아교세포의 3D 공배양 방법으로 시냅스 회로 활동을 분석하는 기술입니다. 이 프로토콜은 신경재생 및 신약 개발 연구에 활용됩니다.

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우리는 박사 마이클 워드 (NIH)에 대 한 기술적인 조언 iNeuron 차별화, 그리고 사바 Barlas 예비 이미지 분석에 대 한 이러한 절차의 디자인에 지적 입력을 위한 박사 에릭 Ullian (UCSF)를 감사 하 고 싶습니다.

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 우리는 신경 cocultures의 3D 분야의 생산을 위한 체계적인 방법을 설명합니다. 분야 이다와는 독립적으로 파생 hPSCs에서 뉴런으로 구성 됩니다. 비록 하지이 프로토콜의 초점, 이다 hPSCs28 에서 순수한 인구의 세대는 중요 한 단계 이며 사전 경험 없이 수행 하는 경우에 기술적으로 도전적 일 수 있다. 이러한 시 냅 스 칩의 세대에서이 첫 번째 단계는 세심 한 타이밍 및 세부 사항에 주의로 수행 되어야 한다. HPSC에서 파생 된 이다의 사용의 한계는 긴 차별화 과정; 그러나 미래에 대 한 동결 수 있습니다 셀의 대량 생산 사용 하 고에서 해 동 하는, 실험의 시간 (단계 2.1.5 참조) 하지 않아도 초기 hPSC 단계에서 프로세스를 시작. 두 특성 명과12,35의 존재에 의해 현저 하 게 향상 된 유전자 변형 hPSCs에서 생성 된 iNeurons ...

이다는 구조 지원 이상 기능적인 책임의 다양 한 중앙 신경 시스템 (CNS) 내에서 매우 풍부한 glial 세포 유형입니다. 수용 성 synaptogenic 요인의 세포 외 기질 (ECM) 분 비를 통해 이다 설립 및 개발1동안 성숙한 시 냅 스의 클러스터링에 도움이. 그들은 또한 건강과 extracellular 신호2,3,,45, 시 냅 스의가 소성 유지에 중요 한 역할을 하 고 항상성의 장기 안정성을 세포 외 칼륨과 조미료, 뿐만 아니라 에너지 기질과 ATP6,,78의 분 비를 조절 하 여 환경. 마지막으로, 그들은9, extrasynaptic 전류 영향을 미치는 의해 neurotransmission에 기여할 수 있는 고 수 직접 다른 세포 유형 myelination10홍보 등을 통해 활동 영향. 중요 한 것은, 비정상적인 또는 이다의 부전 이어질 수 많은 neurodevelopmental 증후군 성인 neuropathology, 이므로 개선에 대 한 순서로 함께 설계 된 신경망에서 뉴런 이다를 포함 하는 명백한 필요가 내 생 두뇌 환경 모델입니다. 이다의 필수적인 특성 신경 시 냅 스1,,1112양식 동적 상호 작용을 그들의 능력입니다. 명과의 부재에서 신경 시 냅 스, 일반적으로 또한 기능 성숙13부족의 제한 된 수를 형성 한다.
인간의 이다 표시, transcriptional, 형태학 및 기능적 특성-분기, 뿐만 아니라 종의 유전자의 증가 크기와 복잡성 등-는 설치류12,14에 지 하지는 15. 그 결과, 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC)를 활용 하 여 연구-파생된 신경 세포 소설 치료, 부상, 모델과 문화 패러다임16 개발 하는 동안 생체 외에서 CNS 관련 질병 검사의 수단으로 널리 수용 되는 ,17. 또한, hPSCs 인간 시 냅 스 형성 및 기본 조직18,19에 대 한 필요 없이 기능 연구를 허용합니다.
시 냅 스 회로 기능에 기여 하는 다양 한 세포 유형 및 신호에 대 한 우리의 이해에 방 벽은 인간 두뇌의 관련 모델의 부족 이다. 높은 정확도와 재현성의 시 냅 스 네트워크를 정리 하는 적절 한 플랫폼에 대 한 필요가 있다. 최근, 관심 3D 문화 시스템의 생산에서 나왔다 ('organoids,'로 널리 알려진 'spheroids,' 또는 '미니 두뇌') 휴대 및 매크로 수준에서 구조 하는 복잡 한 3 차원 (3D)를20 . 3D 문화 시스템은 일반적으로 결 석 하 또는 제한 된 일반적인 2D coculture 패러다임21,22동안 ECM 및 셀 상호 작용을 유지 합니다. 기술의 풍부한 3D 신경 spheroids23,,2425; 경작에 대 한 존재 그러나, 많은 긴 문화 기간 필요 (년 개월) 자연 개발 및 레이어 보존, 사용자 아주 작은 제어할 출력 전시.
여기, 우리가 설명 하는 체계적인 방법을 빠르게 하 고 지속적으로 여러 세포 유형 (사전 차별화 된 뉴런을 이다) 간의 bioengineer 신경 상호 작용 영역 cocultures ('소행성')26으로 셀을 조립 하 여 hPSCs에서 파생 된 는 정리 차원에서 인간의 특정 형태학 복잡. 이 고밀도 신경 시스템 균등 하 게 분산 된 신경 하위 시간이 지남에 성숙한 속성에 걸릴 하 고 상영 하거나 높은 처리량 방식에서 분석을 생성 합니다. 처음으로 인간의 이다 이러한 3D cocultures에서 시 냅 스 네트워크 버스트 활동 유도 대 한 설명 합니다. 또한,이 프로토콜은 다른 크기, CNS의 다른 지역 id에 지정 된 셀을 사용 하 고 여러 다른 종류의 세포로 원하는 상호 작용을 공부 하는 분야를 생성에 쉽게 적응.

<table><tbody><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원뿔형 튜브</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>분리 솔루션</td></tr><tr><td>AggreWell 플레이트</td><td>Stemcell Technologies</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>접착 방지 헹굼 솔루션</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td>세포 방지 마이크로웰 플레이트에 대한 접착</td></tr><tr><td>항/항</td><td>Thermofisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>미디어 보충제</td></tr><tr><td>BrainPhys 신경 매체</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5790</td><td>신경 생리학적 기초 매체 대안</td></tr><tr><td>원형 유리 커버슬립</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7930</td><td>10% DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>10565-042</td><td>GlutaMAX 보충제</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>73634</td><td>위험: 삼키면 유독함. 작업 농도 : 2 &mu; M</td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332100</td><td>작업 농도: 1차 차단 완충액에서 5%, 2차 차단 완충액에서 1%</td></tr><tr><td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td><td>Sigma</td><td>D3072-1ml</td><td>위험: 임산부에게 유독합니다. 작업 농도 : 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>표피 성장 인자(EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>작업 농도: 10ng/mL</td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자-2(FGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>작업 농도: 10ng/mL</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 장착 솔루션</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>작업 농도 : 1 차 차단 버퍼에서 5 %, 2 차 차단 버퍼에서 1 %</td></tr><tr><td>헤파린</td> 시그마 <td>AMQAX1000</td><td></td>또는 자동 세포 계수기 <td>Life Technologies</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149-50KU</td><td>작업 농도 : 2 mg / mL</td></tr><tr><td>Magnetic plate</td><td>DLAB</td><td>8030170200</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 멤브레인 매트릭스</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>ECM 코팅 솔루션. 작업 농도 : 80 &mu; g/ml입니다. 얼음 위에서 준비하고 피펫, 튜브 및 미디어가 미리 냉각되었는지 확인하십시오.</td></tr><tr><td>MEA 2100 시스템</td><td>다채널 시스템</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>냉동 절편용 조직 임베딩 솔루션</td></tr><tr><td>Pap Pen(Aqua Hold)</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드( PFA)</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>HAZARD: 흡입하면 독성이 있음. 작업 농도: PBS</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td> 중 4%<td>Stemcell Technologies</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>폴리-l-오르니틴(PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>작업 농도: 0.5mg/mL</td></tr><tr><td>직사각형 유리 커버 슬립</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5872</td><td>분리 및 패시징 시약</td></tr><tr><td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>작업 농도: 10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72234</td><td>작업 농도: 2 &mu; M</td></tr><tr><td>스피너 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-3</td><td>작업 농도 : PBS</td></tr><tr><td>T25 배양 플라스크</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td>통풍 캡</td></tr><tr><td>T75 배양 플라스크</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>통풍 캡</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>세제. 작업 농도: 1%</td></tr><tr><td>TeSR-E8 기초 배지</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배지</td></tr><tr><td>TeSR-E8 보충제</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>인간 만능 줄기 세포 배지</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>세포 투과화를 위한 세제. 작동 농도: 차단 완충액 0.25%</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>1차 항체; astrocytes perisynaptic</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>1차 항체; astrocytes</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>1차 항체; astrocytes</td></tr><tr><td>Glt1</td><td>Jeffrey Rothstein 박사의 선물</td><td>n/a</td><td>1차 항체; astrocytes</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Synaptic Systems</td><td>160 011</td><td>1차 항체; 뉴런, 시냅스 이후</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>시냅스 시스템</td><td>188 004</td><td>1차 항체; 뉴런</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>1차 항체; 뉴런, 시냅스 후</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>1차 항체; 성상세포</td></tr><tr><td>Synapsin 1</td><td>시냅스 시스템</td><td>106 103 1차</td><td>항체; 뉴런, 시냅스 이전</td></tr><tr><td>TuJ1/&beta; 3-튜불린 (TUBB3)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1차 항체; 뉴런</td></tr></tbody></table>

3d cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

시 냅 스 회로 기능에 기여 하는 다양 한 세포 유형 및 신호에 대 한 우리의 이해에 방 벽은 인간의 뇌 연구 관련 모델의 부족 이다. 이 문제를 해결 하려면 한 신흥 기술을 3 차원 (3D) 신경 세포 배양, 'organoids' 또는 'spheroids', extracellular 접착 분자를 포함 하 여 세포 상호 작용의 장기 보존에 대 한 나의 사용 이다. 그러나, 이러한 문화 시스템은 시간 소모 하 고 체계적으로 생성 된. 여기, 우리 신속 하 고 지속적으로 신경의 3D cocultures을 생산 하는 방법에 자세히 설명 하 고 인간 만능에서 이다 줄기 세포. 첫째, 미리 차별화 이다 신경 창시자는 해리와 계산. 다음으로, 셀 영역을 형성 결합 되어 요리로 키 니 아 제 억제제와 재현 크기의 구체를 생산 하는 특정 비율에. 몇 주 후 문화의 부동 구체로, cocultures ('소행성') 마지막으로 immunostaining에 대 한 구분 또는 시 냅 스 밀도 강도 측정 하는 multielectrode 배열에 따라 도금. 일반적으로,이 프로토콜 표시 성숙한 세포 유형 제한 표식, 기능 시 냅 스를 형성 하 고는 자발적 시 냅 스 네트워크 버스트 활동 전시 3D 신경 분야를 얻을 것입니다 예상 된다. 함께,이 시스템 단층 문화에 비해 더 적합 한 모델에서 약물 검사와 질병의 메커니즘에 대 한 조사를 허용 합니다.

제대로 수행 하는 경우이 프로토콜으로 이다28,33,34 와 뉴런35 (그림 1A-1C), hPSCs에서 생성 된 기능 cocultures의 정의 된 인구를 생산할 예정 이다 26 이전 상세 하 고 여기에 설명 된 단계 2.1-2.2. 이 단계적 절차, microwell 접시를 사용 하 여 일관성 있는 크기와 모양 (단계 3.3;의 3D 신경 분야를 얻을 것으로 예상 된다 그림 1D) 균등 하 게 분산 된 세포와 세포 죽음의 중요 한 표시 없이. 시작 셀 밀도, 세포 유형의 원하는 비율...

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

이 방법은 여러 인간 신경 세포 유형 간의 세포 간 통신이 시냅스 회로 형성 및 기능에 어떻게 기여하는지에 관한 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 인간 만능 줄기 세포에서 기능적으로 성숙한 성상 세포와 뉴런의 3차원 공동 배양 구체를 빠르고 체계적으로 생성합니다. 이는 엄격한 실험 조사에 활용할 수 있습니다.이 프로토콜의 재현성과 확장성은 새로운 오가노이드 기술에 대한 정의된 대안입니다. 이는 부상이나 질병 후 신경 재생을 촉진하기 위한 새로운 약물 개발 및 세포 생착 요법에 대한 가능성을 보여줍니다. 먼저 로키나아제 억제제 Y-27632를 함유한 2밀리리터의 HPSC 배지에 HPSC 클러스터를 ECM으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 안착시킵니다.줄기세포가 약 50% confluent가 될 때까지 유지한 다음 신경 유도를 촉진하기 위해 SB431542와 DMH1을 포함하는 신경 매질로 배지를 변경합니다. 세포가 약 95% 집중되면 각 웰을 1-6개씩 새로운 ECM 코팅된 웰로 분할합니다. 14일째에 분리 용액으로 세포를 해리하고 각 웰의 내용물을 Y-27632를 함유한 배지가 있는 코팅되지 않은 T25 플라스크로 옮겨 응집체 형성을 촉진합니다.자발적으로 형성된 3D 응집체에서 성상세포 전구세포와 성상세포를 생성하려면 EGF 및 FGF2를 포함하는 신경 매질로 전환하고 4-6개월에 성상세포 식별이 확인될 때까지 3-4일마다 먹이를 공급합니다. 기본적으로 이 프로토콜은 등쪽 피질 성상세포를 생성합니다. 그러나 성상세포 아형은 원하는 경우 패터닝 모르포겐(patterning morphogens)을 추가하여 지역적으로 지정할 수 있습니다.일주일에 한 번, 어두운 중심이 나타나면 원심분리로 구체를 수집한 다음 분리 용액으로 H-astro 응집체를 부드럽게 해리합니다. 비CNS 및 비신경 세포를 통과하지 않도록 자발적으로 결합되지 않는 구체만 다시 플레이팅하십시오. 4-6개월 동안 팽창한 후 제조업체의 지침에 따라 동결 및 극저온 보존 배지에서 세포 식별을 확인하거나 즉시 실험에 사용합니다.뉴런 또는 H-뉴런에서 비형질전환 뉴런 전구세포를 생성하기 위해, 14일차 HPSC 유래 신경 전구세포를 2밀리리터의 신경 배지와 웰당 Y-27632가 있는 ECM 코팅된 6웰 플레이트에 시딩합니다. 독시사이클린에 의해 유도되는 iNeuron으로 작업하는 경우, 세포가 약 35% 융합될 때 독시사이클린을 함유한 신경 매질을 추가하여 분화를 유도하고 유전자 발현을 활성화합니다. 이틀 후, 형질전환 및 비형질전환 라인에 하루에 웰당 2ml의 신경 배지를 공급합니다.세포가 70% 포화도에서 들어 올릴 준비가 될 때까지 계속합니다. cocultures의 경우 먼저 분리 솔루션을 사용하여 3D 응집체에서 H-astros를 부드럽게 해리합니다. 그런 다음 2D 단층에서 H-뉴런 또는 iNeuron을 해리합니다.먼저 6웰 플레이트에서 매체를 제거하고 단층 배양물을 포함하는 각 웰에 500마이크로리터의 분리 용액을 추가합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 2-3ml의 DMEM-F12 배지를 부드럽게 첨가하여 부착된 세포를 제거합니다.그런 다음 15ml 원뿔형 튜브에 배지로 세포를 수집하고 300배 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 1ml의 새 배지를 추가한 다음 1, 000마이크로리터 마이크로 피펫으로 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 각 세포 유형을 계수합니다.해리된 H-astros와 H-neurons 또는 iNeuron의 원하는 비율을 마이크로플레이트의 각 웰에 총 2ml의 부피로 추가합니다. 플레이트를 100배 G로 3분 동안 원심분리한 후 2일 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 하루가 지나면 빽빽하게 채워진 미세구가 판에 형성되어야 합니다.1, 000마이크로리터 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 웰에서 구를 부드럽게 제거합니다. 매체로 마이크로 웰 바닥에 가볍게 힘을 가하여 추가로 부착된 구체를 제거합니다. 15mm 원뿔형 튜브에 모든 구체를 모은 후 가라앉히십시오.그런 다음 먼저 오래된 매체를 흡인 한 다음 최소 2 밀리리터의 새로운 매체를 추가하여 구체를 씻습니다. 50-60밀리리터의 매체가 들어 있는 스피너 플라스크에 구를 추가합니다. 인큐베이터의 플라스크를 60RPM으로 설정된 마그네틱 교반 플레이트에 놓습니다.시냅스 형성을 위해 최소 3주간의 배양이 필요합니다. 먼저 각 다전극 어레이(MEA)의 표면을 1밀리리터의 폴리오르니틴으로 코팅하여 표면을 친수성으로 만들고 최소 4시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양 후 폴리오르니틴을 제거하고 각 MEA의 표면을 탈이온수로 세척합니다.그런 다음 1ml의 세포외 기질을 추가하고 최소 4시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 준비가 되면 세포외 기질을 제거한 다음 1.5ml 매체의 구체를 MEA 표면에 적용하여 구체가 전극 어레이 위에 위치하도록 합니다. 이틀 동안 접착시킵니다.신경 구체의 전기적 활동을 측정하려면 MEA를 온도 제어 헤드 스테이지에 놓습니다. 5헤르츠 고역통과 필터와 200헤르츠 저역통과 필터, 그리고 표준편차의 5배인 스파이크 임계값을 사용하여 자발적인 전기 활동을 기록합니다. 통계 분석을 위해 스파이크 빈도 및 진폭을 포함한 원시 데이터를 저장합니다.뉴런에 대한 MAP2 및 성상세포에 대한 GFAP와 같은 신경 세포 유형 제한 단백질 마커는 3D 구체 내 뉴런에서 성상세포의 균일하게 분산된 배열과 성숙도를 시각적으로 보여줍니다. 성상세포 형태 및 분지의 최대 투영은 H-astros가 막 결합 GFP로 드문드문 표지된 대표적인 3D 구에 표시됩니다. 성숙한 H-astros는 GFAP를 포함한 마커를 발현합니다.iNeurons는 왼쪽 이미지에서 볼 수 있듯이 시냅스 전후 단백질을 발현하지만 H-astros와 coculture의 존재로 인해 시냅스 밀도가 크게 향상됩니다. 녹음하는 동안 MEA에 배치된 건강한 iNeurons 구체는 일관된 발화 주파수로 40마이크로볼트 이상의 전압 스파이크를 자발적으로 유도합니다. 공동 배양 구체는 H-astros의 존재와 함께 더 큰 네트워크 연결성을 나타내며, 그 결과 스파이크의 동기 네트워크 버스트가 증가합니다.이 절차에 따라 시냅스 활동에 대한 성상세포의 생리학적 반응을 측정하기 위해 칼슘 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 또한 기존 시냅스 회로와의 연결성을 조사하기 위해 동물 모델에 이식할 수 있습니다. 이 생명공학 접근 방식을 따르면 뇌에서 발생하는 복잡한 신호 전달을 모델링하기 위해 세포 외 생체 재료와 희소돌기아교세포, 미세아교세포 및 에틸아 세포와 같은 추가 세포 유형을 특정 비율로 통합할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 해마 뉴런이 있는 평면 미세 전극 어레이에 결합된 3D 뉴런 배양의 발달을 보여줍니다. 분리된 뉴런은 미세 전극 어레이의 활성 영역에서 2D 네트워크를 형성하고 멤브레인 인서트가 있는 다중 웰 플레이트의 유리 마이크로비드에 부착됩니다. 이러한 뉴런 코팅된 마이크로비즈를 전극으로 전달하면 상호 연결된 3D 신경망으로 구성됩니다.

micro-electrode arrays에 결합된 3차원 뉴런 네트워크 구축

이 비디오는 인간 만능 줄기 세포의 전구 세포에서 천체권을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 성장 인자와 키나아제 억제제를 포함하는 영양 배지를 가진 줄기 세포의 성장과 증식을 포함합니다. 그런 다음 이 세포는 응집되어 성상세포로 분화하여 천체권을 형성합니다.

인간 만능 줄기 세포를 이용한 천체권 생성 및 유지

이 비디오는 성상세포와 뉴런을 공동 배양하여 3D 구를 형성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 3D 구체는 시냅스 형성 및 신경망 통합을 조사하기 위한 고유한 플랫폼을 제공하여 발달 신경 과학, 신경 퇴행성 질환 및 신경 약리학적 중재 연구를 위한 잠재적 모델 역할을 합니다.

시냅스 형성을 유도하기 위해 성상세포와 뉴런의 3D 공동 배양 구체 생성

이 비디오는 MEA(Multielectrode Array)를 사용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리를 측정하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 3D 구 내에서 신경망 역학 및 시냅스 네트워크 버스트 활동을 이해할 수 있습니다.

Multielectrode Arrays를 활용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리학을 측정합니다.

이 비디오는 뉴런 네트워크 활동을 기록하기 위한 뉴런-성상세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. MEA(Multi-electrode Array) 플레이트에서 운동 뉴런과 성상세포의 공동 배양을 확립한 후, MEA를 사용하여 뉴런 네트워크의 동기 리듬 전기 활동을 세포 외로 기록했습니다.

Neuron-Astrocyte 공동 배양에서 Neuronal Network의 전기생리학적 활동 기록

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

이 연구에서는 3D 뉴런 배양이 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 모델을 presented. 3D 뉴런이 유리 마이크로비즈로 구성된 골격에 뉴런을 파종하여 네트워크를 구축하고, 그 위에서 뉴런이 자라나 상호 연결된 3D 구조를 형성합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

여기서는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양을 생산하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서 96웰 또는 384웰 형식으로 생성된 이 공동 배양 모델은 7일 이내에 높은 인쇄 후 생존율과 신경돌기 성장을 입증하고 두 세포 유형 모두에 대한 성숙 마커의 발현을 보여줍니다.

스크리닝 응용 분야를 위한 인간 iPSC 유래 뉴런-성상세포 공동 배양의 3차원 바이오프린팅

배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 신경세포와 성상아교세포의 3D 공배양 방법으로 시냅스 회로 활동을 분석하는 기술입니다. 이 프로토콜은 신경재생 및 신약 개발 연구에 활용됩니다.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

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