3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

이 방법은 여러 인간 신경 세포 유형 간의 세포 간 통신이 시냅스 회로 형성 및 기능에 어떻게 기여하는지에 관한 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 인간 만능 줄기 세포에서 기능적으로 성숙한 성상 세포와 뉴런의 3차원 공동 배양 구체를 빠르고 체계적으로 생성합니다. 이는 엄격한 실험 조사에 활용할 수 있습니다.

이 프로토콜의 재현성과 확장성은 새로운 오가노이드 기술에 대한 정의된 대안입니다. 이는 부상이나 질병 후 신경 재생을 촉진하기 위한 새로운 약물 개발 및 세포 생착 요법에 대한 가능성을 보여줍니다. 먼저 로키나아제 억제제 Y-27632를 함유한 2밀리리터의 HPSC 배지에 HPSC 클러스터를 ECM으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 안착시킵니다.

줄기세포가 약 50% confluent가 될 때까지 유지한 다음 신경 유도를 촉진하기 위해 SB431542와 DMH1을 포함하는 신경 매질로 배지를 변경합니다. 세포가 약 95% 집중되면 각 웰을 1-6개씩 새로운 ECM 코팅된 웰로 분할합니다. 14일째에 분리 용액으로 세포를 해리하고 각 웰의 내용물을 Y-27632를 함유한 배지가 있는 코팅되지 않은 T25 플라스크로 옮겨 응집체 형성을 촉진합니다.

자발적으로 형성된 3D 응집체에서 성상세포 전구세포와 성상세포를 생성하려면 EGF 및 FGF2를 포함하는 신경 매질로 전환하고 4-6개월에 성상세포 식별이 확인될 때까지 3-4일마다 먹이를 공급합니다. 기본적으로 이 프로토콜은 등쪽 피질 성상세포를 생성합니다. 그러나 성상세포 아형은 원하는 경우 패터닝 모르포겐(patterning morphogens)을 추가하여 지역적으로 지정할 수 있습니다.

일주일에 한 번, 어두운 중심이 나타나면 원심분리로 구체를 수집한 다음 분리 용액으로 H-astro 응집체를 부드럽게 해리합니다. 비CNS 및 비신경 세포를 통과하지 않도록 자발적으로 결합되지 않는 구체만 다시 플레이팅하십시오. 4-6개월 동안 팽창한 후 제조업체의 지침에 따라 동결 및 극저온 보존 배지에서 세포 식별을 확인하거나 즉시 실험에 사용합니다.

뉴런 또는 H-뉴런에서 비형질전환 뉴런 전구세포를 생성하기 위해, 14일차 HPSC 유래 신경 전구세포를 2밀리리터의 신경 배지와 웰당 Y-27632가 있는 ECM 코팅된 6웰 플레이트에 시딩합니다. 독시사이클린에 의해 유도되는 iNeuron으로 작업하는 경우, 세포가 약 35% 융합될 때 독시사이클린을 함유한 신경 매질을 추가하여 분화를 유도하고 유전자 발현을 활성화합니다. 이틀 후, 형질전환 및 비형질전환 라인에 하루에 웰당 2ml의 신경 배지를 공급합니다.

세포가 70% 포화도에서 들어 올릴 준비가 될 때까지 계속합니다. cocultures의 경우 먼저 분리 솔루션을 사용하여 3D 응집체에서 H-astros를 부드럽게 해리합니다. 그런 다음 2D 단층에서 H-뉴런 또는 iNeuron을 해리합니다.

먼저 6웰 플레이트에서 매체를 제거하고 단층 배양물을 포함하는 각 웰에 500마이크로리터의 분리 용액을 추가합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 2-3ml의 DMEM-F12 배지를 부드럽게 첨가하여 부착된 세포를 제거합니다.

그런 다음 15ml 원뿔형 튜브에 배지로 세포를 수집하고 300배 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 1ml의 새 배지를 추가한 다음 1, 000마이크로리터 마이크로 피펫으로 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 각 세포 유형을 계수합니다.

해리된 H-astros와 H-neurons 또는 iNeuron의 원하는 비율을 마이크로플레이트의 각 웰에 총 2ml의 부피로 추가합니다. 플레이트를 100배 G로 3분 동안 원심분리한 후 2일 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 하루가 지나면 빽빽하게 채워진 미세구가 판에 형성되어야 합니다.

1, 000마이크로리터 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 웰에서 구를 부드럽게 제거합니다. 매체로 마이크로 웰 바닥에 가볍게 힘을 가하여 추가로 부착된 구체를 제거합니다. 15mm 원뿔형 튜브에 모든 구체를 모은 후 가라앉히십시오.

그런 다음 먼저 오래된 매체를 흡인 한 다음 최소 2 밀리리터의 새로운 매체를 추가하여 구체를 씻습니다. 50-60밀리리터의 매체가 들어 있는 스피너 플라스크에 구를 추가합니다. 인큐베이터의 플라스크를 60RPM으로 설정된 마그네틱 교반 플레이트에 놓습니다.

시냅스 형성을 위해 최소 3주간의 배양이 필요합니다. 먼저 각 다전극 어레이(MEA)의 표면을 1밀리리터의 폴리오르니틴으로 코팅하여 표면을 친수성으로 만들고 최소 4시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양 후 폴리오르니틴을 제거하고 각 MEA의 표면을 탈이온수로 세척합니다.

그런 다음 1ml의 세포외 기질을 추가하고 최소 4시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 준비가 되면 세포외 기질을 제거한 다음 1.5ml 매체의 구체를 MEA 표면에 적용하여 구체가 전극 어레이 위에 위치하도록 합니다. 이틀 동안 접착시킵니다.

신경 구체의 전기적 활동을 측정하려면 MEA를 온도 제어 헤드 스테이지에 놓습니다. 5헤르츠 고역통과 필터와 200헤르츠 저역통과 필터, 그리고 표준편차의 5배인 스파이크 임계값을 사용하여 자발적인 전기 활동을 기록합니다. 통계 분석을 위해 스파이크 빈도 및 진폭을 포함한 원시 데이터를 저장합니다.

뉴런에 대한 MAP2 및 성상세포에 대한 GFAP와 같은 신경 세포 유형 제한 단백질 마커는 3D 구체 내 뉴런에서 성상세포의 균일하게 분산된 배열과 성숙도를 시각적으로 보여줍니다. 성상세포 형태 및 분지의 최대 투영은 H-astros가 막 결합 GFP로 드문드문 표지된 대표적인 3D 구에 표시됩니다. 성숙한 H-astros는 GFAP를 포함한 마커를 발현합니다.

iNeurons는 왼쪽 이미지에서 볼 수 있듯이 시냅스 전후 단백질을 발현하지만 H-astros와 coculture의 존재로 인해 시냅스 밀도가 크게 향상됩니다. 녹음하는 동안 MEA에 배치된 건강한 iNeurons 구체는 일관된 발화 주파수로 40마이크로볼트 이상의 전압 스파이크를 자발적으로 유도합니다. 공동 배양 구체는 H-astros의 존재와 함께 더 큰 네트워크 연결성을 나타내며, 그 결과 스파이크의 동기 네트워크 버스트가 증가합니다.

이 절차에 따라 시냅스 활동에 대한 성상세포의 생리학적 반응을 측정하기 위해 칼슘 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 또한 기존 시냅스 회로와의 연결성을 조사하기 위해 동물 모델에 이식할 수 있습니다. 이 생명공학 접근 방식을 따르면 뇌에서 발생하는 복잡한 신호 전달을 모델링하기 위해 세포 외 생체 재료와 희소돌기아교세포, 미세아교세포 및 에틸아 세포와 같은 추가 세포 유형을 특정 비율로 통합할 수 있습니다.